高效降解黄曲霉毒素b1和赭曲霉毒素a的溶杆菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物学及生物降解领域，具体地说，涉及一种高效降解黄曲霉毒素 B1和赭曲霉毒素A的溶杆菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 曲霉类真菌毒素主要由黄曲霉、寄生曲霉和赭曲霉等曲霉菌产生的次生代谢产 物，已分离鉴定了二十多种结构类似物，其中以黄曲霉毒素B1 (AFB1)和赭曲霉毒素A (0ΤΑ) 毒性最大，在农业生产和食品工业中污染最为广泛。1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织 (WHO)癌症研究机构划定为I类致癌物，因其具有强烈的致癌、致畸和致突变性，已逐渐成 为公共健康和科研领域关注的焦点。黄曲霉毒素和赭曲霉毒素污染谷物和油料作物已成为 全球性问题，在畜牧业中，两类曲霉毒素可通过污染饲料危害动物健康，导致畜牧业生产率 低下，造成严重的经济损失，并通过直接或间接（动物产品传播）途径污染食品，影响人类 的身体健康。动物从饲料中摄入AFB1或AFB2,经体内转化为AFM1或AFM2,存在于奶、肉 和禽蛋中，污染人类食物链。2011年底，我国乳制品行业发生的黄曲霉毒素超标事件即为 AFB1污染饲料导致奶制品AFM1超标的典型案例，已引起我国政府和食品安全部门的高度 重视。随着人们对真菌毒素危害性认识的逐步加深，对于曲霉类真菌毒素检测、污染防控和 脱毒技术方面的研究工作也在不断深入，其与人们生活品质、身体健康和经济利益休戚相 关。
[0003] 近几年，发现了多种微生物对黄曲霉毒素具有显著的降解或吸附作用。例如，丁 酸弧菌属（Butyrivibrio sp·)、乳酸杆菌（Lactobacillus sp·)、链球菌（Streptococcus sp·)、双歧杆菌（Bifidobacterium sp.)和不动杆菌属（Acinetobacter sp.)等。目前报 道的绝大多数脱毒菌种在实际应用中存在如下两方面的共性问题：其一，部分脱毒菌种的 脱毒机理属于物理吸附，并非实质性的生物降解，吸附在菌体细胞壁的毒素，在动物或人体 内不同理化环境下可能发生解吸附作用，没有实质性脱毒意义；其二，报道菌种对毒素的脱 毒率多数在100μg/kg以上较高浓度条件下测定，对于食品原料和饲料等复杂基质中低浓 度曲霉类毒素（低于20yg/kg)的实际脱毒能力研究鲜见报道。然而，低剂量、复合污染及 高污染率又是曲霉类真菌毒素污染的普遍特征，而且20μg/kg的低浓度曲霉类真菌毒素 已能够对人畜脏器造成伤害，尤其是被多种毒素复合污染的农产品，其毒性更具有显著的 增效作用。因此，发掘具有降解低浓度条件下，多种曲霉类真菌毒素复合污染的脱毒菌种， 在农业生产和食品安全领域具有重大的实践意义和应用价值。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种高效降解黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A的溶杆菌及其 应用。
[0005] 为了实现本发明目的，本发明从受多环芳烃严重污染的土壤（炼油厂、汽车修理 厂附近）和受真菌毒素严重污染的霉烂食品样品中分离出一株能够高效降解黄曲霉毒素 B1和赭曲霉毒素A的菌株CW239。在显微镜或电镜下观察，该菌的主要形态学特征为：革兰 氏阴性，无芽孢，杆状至长杆状，无鞭毛，不运动（图1A和图1B)。该菌严格好氧，最适生长 温度为25-30°C，最适生长pH为6. 8-7. 5,在R2A培养基上培养2天后，呈现黄色圆形菌落。
[0006] 基于菌株CW239的形态特征和16SrDNA序列（SEQIDNo. 1)，参考《常见细菌系 统鉴定手册》，将该菌株鉴定为溶杆菌（Lysobactersp.)。该菌株于2015年6月14日保藏 于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072)，保藏编 号为CCTCCNO:M2015372。
[0007] 体外试验表明，菌株CW239在短时间具有显著的赭曲霉毒素（OTA)和黄曲霉毒素 B1 (AFB1)的降解效果。在0ΤΑ终浓度为20μg/L的液体培养基中，菌株CW239处理12h， 对OTA的降解率为53. 1 %，48h降解率达到99. 8% ;在AFB1终浓度为20μg/L的液体培养 基中，菌株CW239处理12h，对AFB1的降解率为42. 5 %，48h降解率达到83. 4 %。用菌株 CW239处理毒素污染的饲料（终浓度20μg/kg)，48h对0ΤΑ降解率为68. 7%，AFB1降解率 为 52. 1%〇
[0008] 本发明还提供含有溶杆菌CW239的菌剂及其复合微生物菌剂。
[0009] 本发明还提供由溶杆菌CW239或所述菌剂制备的黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A 双功能生物降解剂。
[0010] 优选地，所述生物降解剂中活性成分为由所述菌剂制备的粗酶液。
[0011] 更优选地，所述生物降解剂中活性成分为菌株CW239的发酵液、菌株CW239发酵液 经离心所得上清液或菌体裂解液。
[0012] 其中，菌株CW239的发酵培养基为：胰蛋白胨17.0g/L，大豆胨3.0g/L，葡萄糖 2. 5g/L，NaCl5. 0g/L，K2HP042. 5g/L，以水配制。发酵条件为：30°C，180r/min振荡培养 48h。
[0013] 本发明还提供溶杆菌CW239、所述菌剂和所述生物降解剂在黄曲霉毒素B1和赭曲 霉毒素A生物降解中的应用。
[0014] 本发明还提供溶杆菌CW239、所述菌剂和所述生物降解剂在霉变食品原料或饲料 脱毒处理中的应用。
[0015] 其中，所述霉变食品原料或饲料中黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A的含量分别为 20μg/kg及以下，但不局限于20μg/kg及以下浓度。
[0016] 本发明进一步提供溶杆菌CW239或所述菌剂在制备黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素 A双功能高效生物降解剂中的应用。
[0017] 与现有的黄曲霉毒素降解菌相比，本发明的溶杆菌CW239能够在低浓度黄曲霉毒 素B1和赭曲霉毒素A污染条件下达到极佳的降解效果。根据国家食品及饲料卫生标准规 定，谷物类农产品黄曲霉毒素含量必须低于20μg/kg，赭曲霉毒素含量不得超过5μg/kg， 饲料中的赭曲霉毒素A也不得超过100μg/kg(GB2761-2011，GB13078. 2-2006)。实际上， 动物毒理实验表明，连续喂养含有20μg/kg毒素的饲料，就可以对大鼠的内脏器官造成严 重的伤害（Weietal.，2014D0I10. 1002/jsfa. 6649)。因此，菌株CW239 对低浓度AFB1 和 0ΤΑ具有高效的降解脱毒能力，在食品/饲料生物脱毒应用方面具有实质性的应用价值和 重大意义。
【附图说明】
[0018] 图1A和图1B为本发明菌株CW239的电子显微镜照片。
[0019] 图2为本发明实施例2和3中菌株CW239对曲霉毒素的动态降解曲线。
[0020] 图3为本发明实施例2中菌株CW239粗酶液对曲霉毒素的动态降解图。
【具体实施方式】
[0021] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例 中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0022] 实施例1黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A降解菌的筛选、鉴定和培养
[0023] 1、菌株的筛选
[0024] 样品采集自受多环芳烃严重污染的土壤（炼油厂、汽车修理厂附近）和受真菌毒 素严重污染的霉烂食品。取采集样品0. 5g加入150mL富集培养基中（0ΤΑ和AFB1含量各为 20μg/L左右），在30°C恒温培养箱中富集培养7天。第一次富集培养结束后，取5mL富集培 养液接种到150mL新鲜的0ΤΑ和AFB1富集培养基中，将0ΤΑ和AFB1的浓度提高到30μg/ L，在相同条件下继续富集培养7天。以相同的富集方法完成第三次富集培养实验，提高OTA 和AFB1的浓度至50μg/L。富集培养结束后，用无菌水将富集培养液作梯度稀释，将梯度 稀释液分别涂布于0ΤΑ或AFB1固体分离培养基，30°C条件下培养3天。培养结束后，挑取 培养皿单菌落接种于含有0ΤΑ和AFB1各20μg/L的富集培养基内进行降解测试培养48h， 同时设置不接菌的阴性对照。降解培养结束后，培养液经二氯甲烷提取，按照国家标准高效 液相色谱荧光检测法（HPLC-FLD，参照中华人民共和国国家标准GB/T25220-2010和GB/T 18979-2003进行）检测培养液中两类毒素残留浓度，与对照相比计算降解率。最终，分离获 得一株在低浓度0ΤΑ和AFB1条件下（0ΤΑ和AFB1含量< 20μg/L)仍保持高效降解率的菌 株CW239。
[0025] 其中，富集培养基为：葡萄糖5.Og/L，蛋白胨5.Og/L，酵母粉2. 5g/L，柠檬酸铵 1.Og/L，NaAc· 3H20 2. 5g/L，MnS04 · 4H20 0· 05g/L，Κ2ΗΡ041·Og/L，MgS04 · 7H20 0· 2g/L，吐 温-800. 5mL，OTA添加浓度 20-50μg/L，AFB1 添加浓度 20-50μg/L，调pH至 6. 2-6. 5。
[0026] 分离培养基为：葡萄糖10. 0g/L，蛋白胨10. 0g/L，酵母粉5. 0g/L，柠檬酸铵2. 0g/ L，MgS04 · 7H20 0· 58g/L，NaAc· 3H20 5. 0g/L，MnS04 · 4H20 0· 28g/L，吐温-801.OmL,调pH 至 6. 2-6. 5。
[0027] 上述培养基在120°C条件下高压灭菌15min，使用前添加无菌OTA和AFB1毒素标 准溶液至规定浓度，固体培养基按以上配方加2. 0%的琼脂粉。
[0028] 2、菌株CW239的鉴定
[0029] 菌株CW239的主要形态学特征为：革兰氏阴性，无芽孢，杆状至长杆状，无鞭毛，不 运动（图1A和图1B)。该菌严格好氧，最适生长温度为25-30 °C，最适生长pH为6. 8-7. 5， 在R2A培养基上培养2天后，呈现黄色圆形菌落。
[0030] 16SrDNA鉴定：利用细菌的16SrDNA通用引物 (27F5'