专利名称：表面定位的空肠弯曲杆菌多肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是细胞表面定位的空肠弯曲杆菌(Campylobacterjejuni)多肽及其在对空肠弯曲杆菌的免疫、在弯曲杆菌的诊断以及在具有抗弯曲杆菌活性的化合物的鉴定中的用途。
背景技术：
弯曲杆菌感染的出现弯曲杆菌是一种革兰氏阴性微需氧细菌，首先作为人类病原体于1973年被发现。自那时起它就成为发达世界中痢疾疾病最常见的细菌病因，其导致的疾病比更为传统上认为的食源病原体，志贺菌属和沙门氏菌属合起来导致的疾病还要多。在不同的致病弯曲杆菌菌株中，空肠弯曲杆菌是最重要的，是99％的弯曲菌病的病因。全球水平的监测表明，自从该生物体首先被承认是病原体以来，报告的弯曲菌病病例数目在稳定增加。的确，世界卫生组织现在将导致弯曲菌病的细菌视为世界上最重要的肠炎病原体。国际公共卫生官员估计仅空肠弯曲杆菌每年在全世界就导致4到5亿的痢疾病例，在美国最近的2000年数据中它是排名第一的食源病原体，表明了相对于其他更为引人注意的食源疾病的病因，弯曲杆菌的重要性。在数据中，弯曲杆菌是55％以上病例和33％住院的病因。
弯曲杆菌感染的症状痢疾是弯曲菌病最一贯和显著的表现。痢疾常常是出血的。空肠弯曲杆菌通常的症状还包括发烧、恶心、呕吐、腹痛、头痛和肌肉疼痛。病例中大部分程度轻，不需要住院且可以是自限的。但是空肠弯曲杆菌感染可以是严重且威胁生命的。如果有其他疾病(例如癌症、肝脏疾病和免疫缺陷相关的疾病)则死亡更为常见。五岁以下的儿童和15-29岁的年轻成年人是最经常受到影响的年龄组。潜伏期(接触和最初症状发作之间的时间)通常是两到五天，但是发作可以在摄入后短至2天或者多达10天。疾病通常持续不超过一周；但是严重的病例可以持续多达三周(CDC Guidelines for confirmation offood-borne disease outbreaks.MMWR，1996；4559)。
弯曲杆菌的长期后果弯曲杆菌感染有时可以具有长期的后果。一些患者可能出现称为吉一巴(Guillain-Barr é)综合征的疾病，它在弯曲菌病后影响机体的神经。尽管少见，它是西方世界中急性全身性瘫痪的最常见原因。在少数弯曲杆菌患者中，它在痢疾疾病后的数周开始。当人的免疫系统产生抗弯曲杆菌组分的抗体，并且这些抗体攻击人体神经细胞的组分原因是它们在化学上与细菌的组分相似，这时就出现吉一巴综合征1。吉-巴综合征从脚开始扩散到全身。刺痛感觉让位与可以导致瘫痪的虚弱。它持续数周至数月，通常需要悉心护理。完全康复是常见的，但是患者可能遗留下严重的神经损伤。大约15％的吉-巴综合征患者在一年后仍然卧床或者束缚于轮椅上。据估计每1000例报告的弯曲杆菌病中有大约1例(0.1％)会发展为吉-巴综合征。在英国多达40％的弯曲杆菌病综合征病例在弯曲杆菌病后出现2。
米-费(Miller Fisher)综合征是另一种相关的在弯曲杆菌病之后出现的神经综合征，它也是由于免疫拟态而产生1。在米-费综合征中，头部比身体的神经受到更多影响。
与弯曲杆菌感染有关的另外一种慢性病况是一种称为Reiter′s综合征的关节炎。这是一种反应性关节炎，最通常影响的是大的负重关节例如膝盖和后背。它是与特定遗传组成密切相关的并发症；具有人淋巴细胞抗原B27(HLA-B27)的人最易患病。
此外，弯曲杆菌还会导致阑尾炎或者感染腹腔(腹膜炎)，心脏(心肌炎)，中枢神经系统(脑膜炎)膀胱(胆囊炎)以及尿道和血流。
参考文献1.Ang CW等人，(2001)Infect Immun.69(4)2462-2469.
2.Rees等人，(1995)N Eng1 J Med 3331374-1379.
弯曲杆菌病的治疗罹患弯曲杆菌病的患者如果痢疾持续应当饮用足量的液体以维持水平衡。抗痢疾药物例如咯派丁胺可以缓解一些症状。弯曲杆菌病通常是自限疾病，但是一旦发现，建议使用抗生素进行特异治疗，因为治疗可以缩短病程。在更为严重的肠胃炎病例中，通常在指导组培结果以前就使用抗生素。大环内酯类抗生素(红霉素、克拉霉素或阿奇霉素)是对空肠弯曲杆菌最有效的药物。也可以使用氟化蒽醌类抗生素(环丙沙星、左氧氟沙星、加替沙星或莫西杀星)。
但是在许多国家已经报导了弯曲杆菌对抗生素药物的抗性，并且在升高(Pedungton和Kaneene(2003)J.Vet.Med.Sci.65(2)161-170)。在欧洲、亚洲和美国对蒽醌的抗性在升高。抗性的升高至少部分与在家禽饲料中使用抗生素有关(Smith等人，(1999)N Eng1J Med 3401525-1532。
弯曲杆菌治疗、预防和诊断的新策略因为病例的增加以及抗性的广泛出现，对开发新型有效的用于治疗和预防弯曲杆菌感染的制品有着相当大的需要。一方面，由于抗性的出现，需要有新型的抗弯曲杆菌化合物。另一方面观察和实验研究提供了在人中出现获得性免疫性的证据，这对疫苗开发的观念提供了支持，特别是对于危险人群(Scott和Tribble(2000)InCampylobacter，第二版.Nachamkin和Blaser编，American Societyfor Microbiology，pp.303-319)。此外，需要有新型的快速可靠方法诊断弯曲杆菌感染。
这些目标的实现可以通过鉴定和使用适宜的弯曲杆菌多肽，这些多肽可以作为靶标，即免疫系统和/或抗体的靶标、细胞毒性抑制剂的靶标或者诊断中指示分子的靶标。
发明概述本发明涉及的是空肠弯曲杆菌的表面定位多肽。在本申请的上下文中，“表面定位”多肽定义为至少部分地(即多肽链的部分或者多肽分子群的一部分)定位于空肠弯曲杆菌细胞外膜以外的多肽。因此，表面定位的多肽是完全或者部分暴露于外膜以外空间的多肽。表面定位的多肽还包括所有能够在通过这里描述的低pH表面蛋白提取获得的级分中被鉴别的多肽或者多肽片段。
表面定位的多肽是抗菌治疗和/或细菌感染诊断中引人注目的靶标，因为这种多肽暴露于细胞外空间意味着与这些多肽相互作用的化合物(例如用于预防、治疗或者诊断细菌感染的化合物)通常不需要进入或者穿过外膜就可以发挥作用。
空肠弯曲杆菌多肽在细胞表面的定位现在只能实验确定，不能用生物信息学确定，因为对这种定位还没有共同的分选信号或者基序。有可能以一定程度的确定性预测多肽是否进入周质，但是还没有确定多肽表面定位的一般基序，因此还不能仅从序列就预测任何给定的周质多肽(或者非周质多肽)是否被运输到表面。在空肠弯曲杆菌中确证的表面多肽的数目相对较少，主要包括鞭毛结构蛋白和少量非鞭毛相关的表面蛋白，例如PEB1-4。
本发明的发明者在空肠弯曲杆菌的细胞表面级分中鉴别了51种不同的多肽。使用的方法确定了表达水平相对较高的多肽。这些多肽暴露于表面，同时以相对大的量存在，使它们非常适于作为抗体的靶标，因此用于被动或者主动免疫/疫苗接种。
因此，第一方面，本发明涉及一种用作药物的组合物，其包含-多肽，它包含选自SEQ ID NO1-51的表面定位弯曲杆菌多肽的序列，或者它包含所述序列的抗原性片段或变体，或-包含所述多肽编码序列的多核苷酸，或-包含所述多肽编码序列的表达载体，或-包含所述多核苷酸或者所述表达载体的重组病毒或者重组细胞，或-能够与所述多肽结合的抗体。
在另一个主要方面中，本发明涉及-多肽，它包含选自SEQ ID NO1-51的序列，或者它包含所述序列的抗原性片段或变体，-包含所述多肽编码序列的多核苷酸，-包含所述多肽编码序列的表达载体，或-包含所述多核苷酸或者所述表达载体的重组病毒或者重组细胞，用于制备免疫动物或者人抵抗弯曲杆菌，优选为空肠弯曲杆菌感染的药物的用途。
此外，在一个主要方面中，本发明涉及能够与选自SEQ ID NO1-51的多肽结合的抗体用于制造药物以治疗或预防动物或者人中弯曲杆菌，优选为空肠弯曲杆菌的感染的用途。
所鉴别的51个表面定位的多肽中，15个(SEQ ID NO37-51)已经在使用来自其他细菌的关键基因进行同源性搜索时作为搜索命中结果得到的36000个以上的其他基因座中有所描述，参见WO02/077183。WO 02/077183没有描述所鉴别的多肽的亚细胞定位，也没有确定它们的表达水平。
在另一个主要方面中，本发明涉及一种抗体，它能够与选自SEQ IDNO1-36的多肽结合。
在另一个主要方面中，本发明涉及一种抗体，它能够与选自SEQ IDNO37-51的多肽结合，并且能够与完整的空肠弯曲杆菌细胞结合。
在另一个方面中，本发明涉及产生本发明上述抗体的方法。
暴露于表面与相当大量存在两个性质的组合还使本发明的发明者确定的51个多肽非常适于作为诊断弯曲杆菌病的靶标，这可以高度灵敏地检测完整的细胞。因此，在另一个主要方面中，本发明涉及了使用能够识别这里描述的细胞表面定位多肽的指示分子，检测空肠弯曲杆菌或者其部分的方法。
此外，51个多肽的表面定位使它们适于作为抑制剂的靶标。这些抑制剂可以是杀菌的或者抑菌的或者阻止空肠弯曲杆菌与宿主生物相互作用(毒性)。因此，在另一个主要方面中，本发明涉及了鉴别这里描述的细胞表面定位多肽的抑制剂的方法。
定义-疫苗-用于表示能够在人或者动物中诱导针对微生物的保护性免疫应答的组合物。
-保护性免疫应答-用于表示在生物体内诱导记忆的免疫应答(体液/抗体和/或细胞)，使感染性物质(这里是空肠弯曲杆菌)与次级而不是初级应答相遇，这样减轻其对宿主生物的影响。
-多肽-除非特别说明，这里使用的术语“多肽”还可以指多肽的变体或片段。优选的多肽是抗原性多肽。
-片段-用于表示多肽的非全长部分。因此，片段自身也是多肽。
-变体-给定参考多肽的变体指的是表现出与所述参考多肽具有一定程度序列一致性的多肽，但是又与所述参考多肽不同。
-抗原/抗原的/抗原性/免疫原/免疫原的/免疫原性-所有都指的是诱导免疫应答的能力。
-免疫原性载体-指的是直接或者间接辅助或加强免疫应答的化合物。
-表达载体-指的是(优选为重组的)用于从多核苷酸序列产生多肽的质粒或噬菌体或病毒。表达载体包含表达构建体，表达构建体包含下列各项的组装(1)在基因表达中具有调控作用的遗传元件例如启动子或增强子，(2)被转录为mRNA并翻译为蛋白质的结构或编码序列，并且与(1)的元件有效连接；以及(3)适当的转录起始和终止序列。
多肽的结合伴侣指的是能够与所述多肽结合的分子。这种结合可以是通过另一个分子间接的，但是优选是直接的。结合伴侣可以是任何类型的分子，例如小的疏水分子或者例如细胞或细胞外大分子如蛋白质、糖或核酸。优选类型的结合伴侣包括抗体、配基或抑制剂。
-多数-术语“多数”表示的是多于1个，优选多于10个。
-指示分子-术语“指示分子”涵盖了能够与给定多肽和/或细胞特异结合，并且能够产生可检测信号的分子或者分子复合物。优选地，指示分子是抗体或者包含抗体分子。因此，优选的指示分子是与可检测物质偶联或者形成复合物的抗体。
-来自宿主的分子或者宿主分子-指的是通常在可以被空肠弯曲杆菌感染的宿主生物中找到的分子。宿主来源的分子优选是多肽，优选是人多肽。
-抗体-在这里使用的术语“抗体”要涵盖的是抗体以及其功能等价物。因此，这包括了多克隆抗体、单克隆抗体(mAbs)、人化的、人的或者嵌合抗体、单链抗体以及抗体的结合片段，例如但是不止限于，Fab片段，F(ab′)2片段，Fab表达文库产生的片段，抗独特型抗体、包含抗体片段的嵌合，以及这些中任何一项的表位结合片段。该术语还包括多价、多特异例如双特异抗体以及单克隆抗体的混合物。
-解离常数，Kd，是描述大分子例如抗体及其抗原之间结合(或亲和性或亲合力)强度的量度。Kd越小，结合越强。
-分离的-其与这里公开的多肽、多核苷酸以及抗体有关。“分离的”指的是这些多肽、多核苷酸以及抗体从其天然的(通常是细胞)环境的组分中被鉴别、分离和/或回收。天然环境的污染组分是通常干扰多肽诊断或者治疗使用的物质，可以包括酶、激素以及其他蛋白或者非蛋白溶质。本发明的多肽、多核苷酸以及抗体优选是分离的，本发明的疫苗和其他组合物优选包含分离的多肽或者分离的多核苷酸或者分离的抗体。
详述1。从实验ACE003b和ACE003c中每个抗原的四只随机选择的小鼠，取血清1∶2000稀释，用全细胞弯曲杆菌裂解物(B，D)或者100ng重组蛋白(A，C)对其进行Western印迹检查。分子量标记蛋白的分子量kD97，64，51，39，28，19，14。
图2。抗体滴度测定的示例。从实验ACE003b和ACE003c中每个抗原的四只随机选择的小鼠，在第21天取血清(之前在第1天和14天免疫)，系列稀释，对相应的重组蛋白(100ng/点)进行Western印迹。
图3。小鼠口服攻毒的结果。根据以下进行包括不同抗原和对照组合的5个实验方块表示明矾阴性对照，三角表示抗原(除ACE017外)，ACE017的抗原也用三角表示，但是阳性对照是甘氨酸洗脱物(Rombus)，阴性对照是CBP(参见下面)并用方块表示。
实验名称 使用的抗原ACE003b Cj0092，Cj0143c，Cj0420，Cj0772c，明矾ACE003c Cj0715，Cj1018c，Cj1380，Cj1643，明矾ACE011a Cj0092，Cj0143c，Cj0420，Cj0772c，明矾ACE011b Cj0715，Cj1018c，Cj1380，Cj1643，明矾
ACE017 Cj0092，Cj0143c，Cj0420，Cj0772c，Cj1018c，Cj1380，Cj1643，食纤维素梭杆菌(Clostridium cellulovorans)的纤维素结合结构域(CBP，Sigma Aldrich C8581)，在文中提及的空肠弯曲杆菌菌株的甘氨酸洗脱物。
图4显示了本申请的序列表。
表1。在13个随机选择的空肠弯曲杆菌和一个大肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)菌株中出现的8种抗原。对来自14种列出的菌株的全细胞细菌细胞裂解物进行Western印迹，使用对所有8种抗原的血清作为探针。
来自2003年11月23日提交的丹麦优先权申请PA 2003 01726的列表1，以及2003年11月25日提交的美国临时申请60/524,617在这里引用作为参考。
用作药物的组合物在第一个主要方面，本发明涉及一种用作药物的组合物，其包含-多肽，它包含选自SEQ ID NO1-51的表面定位弯曲杆菌多肽的序列，或者它包含所述序列的抗原性片段或变体，-包含所述多肽编码序列的多核苷酸，-包含所述多肽编码序列的表达载体，-包含所述多核苷酸或者所述表达载体的重组病毒或者重组细胞，或-能够与所述多肽结合的抗体。
在一个重要的实施方案中，组合物包含-多肽，它包含选自SEQ ID NO1-51的序列，或者它包含所述序列的抗原性片段或变体，-包含所述多肽编码序列的多核苷酸，
-包含所述多肽编码序列的表达载体，或-包含所述多核苷酸或者所述表达载体的重组病毒或者重组细胞。
所述的组合物可以用作疫苗用于对需要进行免疫的个体进行积极免疫。这在“本发明的疫苗组合物和疫苗接种方法”一节中有描述。
在一个优选的实施方案中，组合物包含的多肽包含选自SEQ ID NO1-36的序列，或者多肽包含所述序列的抗原性片段或变体。在另一个优选的实施方案中，组合物包含的多肽包含选自由SEQ ID NO37-51的序列或者多肽包含所述序列的抗原性片段或变体。
在另一个重要的实施方案中，组合物包含能够与多肽结合的抗体，所述多肽选自SEQ ID NO1-51的表面定位弯曲杆菌多肽。
所述的组合物可以例如用于对需要进行免疫的个体进行被动免疫。这在“本发明的抗体和制备抗体的方法”一节中有描述。
本发明的疫苗组合物和疫苗接种方法疫苗接种或者主动免疫的目的是通过使用抗原性或者免疫原性组合物诱导针对感染性微生物的记忆性免疫应答，提供保护性免疫。因此，疫苗是能够在人或者动物中诱导针对微生物的保护性免疫应答的组合物。
这种免疫应答可以是细胞应答和/或体液应答，例如特异的T细胞应答或者抗体应答。
因此，在一个重要的实施方案中，组合物是疫苗组合物。
即本发明涉及一种组合物作为疫苗的用途，所述组合物包含-多肽，它包含选自SEQ ID NO1-51的空肠弯曲杆菌多肽的序序列，或者它包含所述序列的抗原性片段或变体，-包含所述多肽编码序列的多核苷酸，-包含所述多肽编码序列的表达载体，或-包含所述多核苷酸或者所述表达载体的重组病毒或者重组细胞。
这里的变体优选与所述的序列具有至少95％的序列一致性，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％的序列一致性。
在以上组合物的一个实施方案中，多肽包含SEQ ID NO1，或者其抗原性片段或变体。
在以上组合物的一个实施方案中，多肽包含SEQ ID NO2，或者其抗原性片段或变体。
在以上组合物的一个实施方案中，多肽包含SEQ ID NO3，或者其抗原性片段或变体。
在以上组合物的一个实施方案中，多肽包含SEQ ID NO4，或者其抗原性片段或变体。
在以上组合物的一个实施方案中，多肽包含SEQ ID NO5，或者其抗原性片段或变体。
在以上组合物的一个实施方案中，多肽包含SEQ ID NO6，或者其抗原性片段或变体。
在以上组合物的一个实施方案中，多肽包含SEQ ID NO7，或者其抗原性片段或变体。
在以上组合物的一个实施方案中，多肽包含SEQ ID NO8，或者其抗原性片段或变体。
在以上组合物的一个实施方案中，多肽包含SEQ ID NO9，或者其抗原性片段或变体。
在以上组合物的一个实施方案中，多肽包含SEQ ID NO10，或者其抗原性片段或变体。
在以上组合物的一个实施方案中，多肽包含SEQ ID NO11，或者其抗原性片段或变体。
在以上组合物的一个实施方案中，多肽包含SEQ ID NO12，或者其抗原性片段或变体。
在以上组合物的一个实施方案中，多肽包含SEQ ID NO13，或者其抗原性片段或变体。
在以上组合物的一个实施方案中，多肽包含SEQ ID NO14，或者其抗原性片段或变体。
在以上组合物的一个实施方案中，多肽包含SEQ ID NO15，或者其抗原性片段或变体。
在以上组合物的一个实施方案中，多肽包含SEQ ID NO16，或者其抗原性片段或变体。
在以上组合物的一个实施方案中，多肽包含SEQ ID NO17，或者其抗原性片段或变体。
在以上组合物的一个实施方案中，多肽包含SEQ ID NO18，或者其抗原性片段或变体。
在以上组合物的一个实施方案中，多肽包含SEQ ID NO19，或者其抗原性片段或变体。
在以上组合物的一个实施方案中，多肽包含SEQ ID NO20，或者其抗原性片段或变体。
在以上组合物的一个实施方案中，多肽包含SEQ ID NO21，或者其抗原性片段或变体。
在以上组合物的一个实施方案中，多肽包含SEQ ID NO22，或者其抗原性片段或变体。
在以上组合物的一个实施方案中，多肽包含SEQ ID NO23，或者其抗原性片段或变体。
在以上组合物的一个实施方案中，多肽包含SEQ ID NO24，或者其抗原性片段或变体。
在以上组合物的一个实施方案中，多肽包含SEQ ID NO25，或者其抗原性片段或变体。
在以上组合物的一个实施方案中，多肽包含SEQ ID NO26，或者其抗原性片段或变体。
在以上组合物的一个实施方案中，多肽包含SEQ ID NO27，或者其抗原性片段或变体。
在以上组合物的一个实施方案中，多肽包含SEQ ID NO28，或者其抗原性片段或变体。
在以上组合物的一个实施方案中，多肽包含SEQ ID NO29，或者其抗原性片段或变体。
在以上组合物的一个实施方案中，多肽包含SEQ ID NO30，或者其抗原性片段或变体。
在以上组合物的一个实施方案中，多肽包含SEQ ID NO31，或者其抗原性片段或变体。
在以上组合物的一个实施方案中，多肽包含SEQ ID NO32，或者其抗原性片段或变体。
在以上组合物的一个实施方案中，多肽包含SEQ ID NO33，或者其抗原性片段或变体。
在以上组合物的一个实施方案中，多肽包含SEQ ID NO34，或者其抗原性片段或变体。
在以上组合物的一个实施方案中，多肽包含SEQ ID NO35，或者其抗原性片段或变体。
在以上组合物的一个实施方案中，多肽包含SEQ ID NO36，或者其抗原性片段或变体。
在以上组合物的一个实施方案中，多肽包含SEQ ID NO37，或者其抗原性片段或变体。
在以上组合物的一个实施方案中，多肽包含SEQ ID NO38，或者其抗原性片段或变体。
在以上组合物的一个实施方案中，多肽包含SEQ ID NO39，或者其抗原性片段或变体。
在以上组合物的一个实施方案中，多肽包含SEQ ID NO40，或者其抗原性片段或变体。
在以上组合物的一个实施方案中，多肽包含SEQ ID NO41，或者其抗原性片段或变体。
在以上组合物的一个实施方案中，多肽包含SEQ ID NO42，或者其抗原性片段或变体。
在以上组合物的一个实施方案中，多肽包含SEQ ID NO43，或者其抗原性片段或变体。在一个优选的实施方案中，SEQ ID NO43中的X1是V，X2是A，X3是T。在另一个优选的实施方案中，SEQ ID NO43中的X1是A，X2是T，X3是A。
在以上组合物的一个实施方案中，多肽包含SEQ ID NO44，或者其抗原性片段或变体。
在以上组合物的一个实施方案中，多肽包含SEQ ID NO45，或者其抗原性片段或变体。
在以上组合物的一个实施方案中，多肽包含SEQ ID NO46，或者其抗原性片段或变体。
在以上组合物的一个实施方案中，多肽包含SEQ ID NO47，或者其抗原性片段或变体。
在以上组合物的一个实施方案中，多肽包含SEQ ID NO48，或者其抗原性片段或变体。
在以上组合物的一个实施方案中，多肽包含SEQ ID NO49，或者其抗原性片段或变体。
在以上组合物的一个实施方案中，多肽包含SEQ ID NO50，或者其抗原性片段或变体。
在以上组合物的一个实施方案中，多肽包含SEQ ID NO51，或者其抗原性片段或变体。
在组合物的一些实施方案中，多肽由选自SEQ ID NO1-51的序列组成。在另一些实施方案中，多肽包含选自SEQ ID NO1-51多肽的序列或者所述序列的抗原性片段或变体，以及标签(例如his标签即多聚组氨酸标签)。
组合物可以只包含选自SEQ ID NO1-51中的一种多肽或者其片段或变体。但是在其他实施方案中组合物包含SEQ ID NO1-51的组中一种以上的多肽和/或选自SEQ ID NO1-51的组的多肽一种以上的片段。因此，根据本发明的组合物可以包含一种以上，例如2种，例如3种，例如4种，例如5种，例如6种，例如7种，例如8种，例如9种，例如10种，例如范围在5到10，或者10个以上的一些多肽和/或片段，例如10到20范围的，选自SEQ ID NO1-51的组的不同多肽或者其抗原性片段或变体。
类似地，组合物可以只包含本发明的一种多核苷酸、一种表达载体或者一种重组病毒或重组细胞。但是在其他实施方案中，组合物包含一种以上的多核苷酸、表达载体或者重组病毒或重组细胞，例如2种，例如3种，例如4种，例如5种，例如6种，例如7种，例如8种，例如9种，例如10种，或者多于10种，如在10到20范围的，如这里描述的本发明中不同的多核苷酸、表达载体或者重组病毒或重组细胞。
而且，在一些实施方案中本发明的重组细胞可以表达SEQ ID NO1-51的组中一种以上多肽和/或选自SEQ ID NO1-51的组多肽的一种以上的抗原性片段或变体。因此，根据本发明的组合物可以包含的重组细胞包含一种以上例如2种，例如3种，例如4种，例如5种，例如6种，例如7种，例如8种，例如9种，例如10种，例如范围在5到10，或者10种以上的一些多肽和/或片段，例如10到20范围的，选自SEQ ID NO1-51的组的不同多肽或者其抗原性片段或变体。在另一个实施方案中，用于本发明的组合物包含多个这里描述的重组病毒或重组细胞。
包含多肽的疫苗在优选的实施方案中，本发明涉及包含多肽的组合物，所述多肽包含选自SEQ ID NO1-51(例如SEQ ID NO1-36的任何一个或者SEQ ID NO37-51的任何一个)的序列或者所述序列的抗原性片段或变体，组合物用作疫苗。优选的片段和变体是那些在这里的章节中描述的片段和变体。
因此，在本实施方案中，通过直接给服通常位于空肠弯曲杆菌细胞表面的多肽提供抗原性或者免疫原性。在一个特定实施方案中，对多肽进行选择使疫苗组合物包含能够与不同MHC分子(例如不同MHC I类分子)结合的多个多肽。优选地，用作疫苗的组合物包含能够与最频繁出现的MHC I类分子结合的多肽和/或片段。在本发明的一个特定实施方案中，组合物包含与MHC I类分子结合的一个或更多多肽和/或片段和/或能与MHC II类分子结合的一个或更多多肽。因此，在某些实施方案中疫苗组合物能够产生特异的细胞毒性T细胞应答和/或特异的辅助T细胞应答。与MHC分子的结合可以例如根据Andersen等人，(1999)Tissue Antigens 54185；或Tan等人，(1997)J.Immunol.Methods 20925的描述测定。
佐剂和免疫原性载体优选地，本发明的用作疫苗的组合物，即疫苗组合物，包含药物上可以接受的载体，这在“用于本发明的组合物”一节中有描述。
组合物还可以包含佐剂。佐剂是一些物质，它们混合到疫苗组合物中以后增加或者改变了对多肽或者其他抗原的免疫应答。佐剂可以例如是下列中的任何一项AIK(SO4)2、AlNa(SO4)2，AINH4(SO4)、硅胶、明矾、Al(OH)3，Ca3(PO4)2、高岭土、碳、氢氧化铝、磷酸铝、胞壁酰二肽、N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-DMP)、N-乙酰-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(CGP 11687，也被称作nor-MDP)、N-乙酰-胞壁酰-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1′，2′-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧)-乙胺(CGP 19835A，也被称作MTP-PE)、含RIBI(MPL+TDM+CWS)的2％鲨烯/Tween-80.RTM.乳剂、脂多糖和衍生物包括脂肪A，弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂、Merck佐剂65、多核苷酸(例如多聚IC和多聚AU酸)、来自结核分支杆菌(Mycobacterium、tuberculosis)的蜡质D、在短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)，百日咳杆菌(Bordetellapertussis)，和布鲁氏菌属(Brucella)的成员中发现的物质、脂质体或者其他脂类乳剂、Titermax、ISCOMS、QuilA、ALUN(参见US58767和5,554,372)、脂肪A衍生物、霍乱肠毒素衍生物、HSP衍生物、LPS衍生物、合成肽基质或者GMDP、白介素1、白介素2、Montanide ISA-51和QS-21。用于本发明的优选佐剂包括MontanideISA-51和QS-21。Montanide ISA-51(Seppic，Inc.)是基于矿物油的弗氏不完全佐剂的佐剂类似物，它通常作为乳剂给服。QS-21(Antigenics；Aquila Biopharmaceuticals，Framingham，MA)是高度纯化的水溶性皂角苷，它作为水溶液给服。
能够根据本发明使用的佐剂的合意功能列在下表中。
表1 佐剂的作用方式
来源John C.Cox和Alan R.Coulter Vaccine 1997 Feb；15(3)248-56根据本发明的疫苗组合物可以包含一种以上的不同佐剂。还考虑到本发明的弯曲杆菌多肽或者其一个或更多片段以及佐剂可以以任何适当的顺序分开给服。
通常选择的佐剂是例如与明矾沉淀的抗原组合使用的弗氏完全或者不完全佐剂，或者杀死的百日咳杆菌。在Goding，MonoclonalAntibodiesPrinciples & Practice(2nd edition，1986)61-63页中提供了佐剂的一般讨论。但是Goding提出当目标抗原分子量低或者免疫原性弱时，则推荐其与免疫原性载体偶联(见下面)。已经提示各种不同的皂角苷提取物和细胞因子在免疫原性组合物中可以用作佐剂。最近提议使用一个众所周知的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)作为佐剂(WO 97/28816)。
此外，本发明的疫苗组合物可以包含免疫原性载体例如支架结构，例如蛋白或者多糖，弯曲杆菌多肽或其片段能够与所述支架结构连接。疫苗组合物中存在的弯曲杆菌多肽或者其抗原性片段或变体可以与免疫原性载体(例如蛋白)相连。多肽与载体蛋白的结合或连接可以是共价或非共价的。免疫原性载体蛋白可以独立于佐剂存在。载体蛋白的功能可以是例如增加特定片段的分子量，以提高它们的活性或免疫原性，赋予稳定性，增加生物活性或者提高在血清中的半寿期。而且，免疫原性载体蛋白可以帮助弯曲杆菌多肽或者其片段向T细胞的呈递。载体蛋白可以是但是不止限于，匙孔血蓝蛋白、血清蛋白例如铁传递蛋白、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、甲状腺球蛋白或卵清蛋白、免疫球蛋白、或者激素例如胰岛素。在本发明的一个实施方案中，破伤风类毒素和/或百日咳类毒素也是适宜的载体。另外，可以加入葡聚糖例如sepharose。在另一个实施方案中，也可以加入抗原呈递细胞(例如能够将多肽或者其片段向T细胞呈递的树突状细胞)以获得与载体蛋白相同的效果。
制备疫苗组合物的方法已经例如在US 5,470,958和其中的参考文献中讨论。如果注射的话，本发明疫苗组合物的有效量多肽组分，对于人受试对象而言，通常的范围是从大约0.1到大约1000μg，例如从大约1到大约900μg，例如从大约5到大约500μg，一般在从大约0.01到大约10.0μg/kg受试动物体重。以上提到的范围只是指示性的，不应当理解为对本发明的限制。
本发明的有效量抗原性多肽可以是在没有免疫调节剂的情况下能够引发可检测到的体液免疫应答的量。对于许多免疫原，对人受试对象，这是在大约5-100μg的范围中。要使用的适当量的免疫原取决于需要免疫原引发的免疫应答。而且，所需的确切有效量随受试对象不同而不同，取决于受试对象的物种、年龄和一般情况，正在治疗的病况的严重性、给药方式等等。因此不是总能够明确确切的有效量。但是适当的有效量可以由本领域的普通技术人员仅仅使用常规实验或者本领域的先验进行确定。
DNA疫苗组合物和包含重组病毒或重组细胞的疫苗组合物DNA或RNA疫苗指的是通过在患者的细胞中表达多核苷酸构建体将例如抗原性多肽决定簇引入患者中，所述多核苷酸构建体包括与目标多肽(这里是SEQ ID NO1-51的任何一个多肽或者是其抗原性片段或变体)的编码序列有效连接的表达控制序列。由于这种片段可能不含有甲硫氨酸起始密码子，还选择地包括这种密码子作为表达控制序列的部分。多核苷酸构建体可以是非复制的和线形的多核苷酸、环形表达载体或者自主复制质粒或病毒表达载体。构建体可以整合到宿主基因组中。可以转染哺乳动物细胞的表达载体可以用于根据本发明的个体免疫方法中。构建表达载体的方法在本领域内是众所周知的(参见例如Molecular CloningA Laboratory Manual，Sambrook等人，，编，Cold Spring Harbor Laboratory，第二版，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)。优选的是包含大量基因的组合物，所述基因表达选自本发明的SEQ ID NO1-51的多种多肽和/或本发明的多种抗原性片段，籍此可以针对多种不同的预选靶标同时进行疫苗接种。
也可以通过将编码特异抗原性多肽的多核苷酸掺入到活的但是无害的载体例如病毒或细胞(例如减毒或毒性降低的大肠杆菌或沙门氏菌)中制备疫苗。无害的重组病毒或者重组细胞注射到目标接受者中。这种重组细胞可以是死的或者活的。如果是活的，重组生物可以在宿主中复制，同时产生并且向宿主免疫系统呈递抗原性多肽。还考虑到这种类型的疫苗可能比非复制类型的疫苗更为有效。为了使这种疫苗有效，载体生物必须是有生活力的，且或者是天然的无毒的或者具有减毒或毒性降低的表型。
使用减毒细菌进行疫苗接种的策略和用于疫苗接种的适宜细菌菌株已经在例如Makino等人，(2001)Microb.Pathog.311-8；Gentschev等人，(2002)Int.J.Med.Microbiol.291577-582；Turner等人，(2001)Infect.Immun.694969-4979；WO99/49026；和WO03/022307中描述。
可以应用的载体的其他示例是包含例如WO 90/07936，WO91/02805，WO 93/25234，WO 93/25698，和WO 94/03622公开的逆转录病毒，如Berkner，Biotechniques 6616-627，1988；Li等人，Hum.Gene Ther.4403-409，1993；Vincent等人，Nat.Genet.5130-134，1993；和Kolls等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91215-219，1994)公开的腺病毒，如U.S.4,769,330；U.S.Pat.No.5,017,487；和WO 89/01973中公开的痘病毒，如WO 90/11092公开的裸露DNA，如WO 93/03709公开的与多阳离子分子复合的多核苷酸分子以及如Wang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 847851，1987公开的与脂质体结合的多核苷酸。在某些实施方案中，DNA可以与杀死或者灭活的腺病毒连接，如Curiel等人，Hum.Gene Ther.3147-154，1992；Cotton等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 896094，1992公开的。其他适宜的组合物包括如Wu等人，J.Biol.Chem.26416985-16987，1989公开的DNA配基，以及如Felgner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 847413-7417，1989公开的脂-DNA组合。此外，可以通过将DNA包被到可生物降解的橡胶珠上提高细胞摄取裸露DNA的效率。
疫苗载体优选包含与编码免疫原性多肽的多核苷酸序列有效连接的适宜启动子。本发明中可以使用任何能够在靶标细胞中指导高水平转录起始的启动子。因此非组织特异的启动子例如巨细胞病毒(DeBernardi等人，Proc Natl Acad Sci USA 889257-9261，以及其中的参考文献)、小鼠金属硫蛋白I(Hammer等人，J Mol ApplGen 1273-288)、HSV胸腺嘧啶激酶(McKnight，Cell 31355-365)和SV40早期(Benoist等人，Nature 290304-310)启动子也可以使用。
疫苗接种的方法在另一个主要方面中，本发明涉及的是任何一种或者更多-多肽，其包含选自SEQ ID NO1-51的序列(例如SEQ ID NO1-36的任何一个或者SEQ ID NO37-51的任何一个)；或者包含所述序列的抗原性片段或变体，-包含编码所述多肽的序列的多核苷酸，-包含编码所述多肽的序列的表达载体，或者-包含所述多核苷酸或所述表达载体的重组病毒或重组细胞，的用途，其用于制备用于免疫动物或人以抵御空肠弯曲杆菌的感染的药物。优选地，免疫诱导保护性免疫应答。
类似地，本发明涉及了免疫免疫动物或人以抵御空肠弯曲杆菌感染的方法，包含给服一个或更多-多肽，其包含SEQ ID NO1-51的任何序列，例如SEQ ID NO1-36的任何一个或者SEQ ID NO37-51的任何一个；或者包含所述序列的抗原性片段或变体，-包含编码所述多肽的序列的多核苷酸，-包含编码所述多肽的序列的表达载体，或-包含所述多核苷酸或所述表达载体的重组病毒或重组细胞，的步骤，籍此免疫所述动物或人以抵抗空肠弯曲杆菌的感染。
动物可以是任何鸟或者哺乳动物，例如鸡、鸭、火鸡、奶牛或者猪。特殊的靶标人群可以是来自危险群体(例如4周岁以下的儿童群体、工业化国家的人群或者到发展中国家的未接触过抗原或者半免疫的旅行者群体)的个体。
根据本发明的组合物的给药方式包括，但是不止限于全身给药例如静脉内或者皮下给药，皮内给药、肌肉内给药、鼻内给药、口服给药以及一般地任何形式的粘膜给药。
根据本发明的免疫原性作用可以例如通过如RIA检测血清样品中的抗体进行测定。此外，可以通过测定例如对T细胞依赖性抗原性多肽之T细胞反应性的增加测定这种作用，其中所述的增加的反应性是针对这种抗原性多肽的正常免疫应答提高的特征。免疫刺激作用还可以以尤其是IL-2，IL-3，IFN-γ和/或GM-CSF的T细胞产生，增加进行测定。这样可以通过筛选T细胞产生IL-2，IL-3，IFN-γ或GM-CSF的增加，容易地鉴定出具有诱导增强免疫应答的多肽或者其片段，如US 07/779,499中描述的，在这里引用作为参考。Young等人，(2000)在Campylobacter，第二版.Nachamkin和Blaser编，AmericanSociety for Microbiology，pp.287-301中也描述了一系列适宜的动物模型，它们可以用于治疗和预防策略以及组合物的效力评价上。Scott and Tribble(2000)在Campylobacter，第二版.Nachamkin和Blaser编，American Society for Microbiology，pp.303-319中描述了与针对弯曲杆菌免疫相关的许多方面，包括可能的靶标人群，动物模型和疫苗接种策略。
这里描述的多核苷酸和表达载体可以通过标准方法引入到靶标细胞中例如作为裸露DNA(Donnelly等人，Annu Rev Immunol 15617-648)、整合到IS-COMS中、脂质体或者红细胞血影、或者通过生物弹射击转移，钙沉淀或者电穿孔。或者可以使用基于病毒的载体作为将编码目标多肽的多核苷酸引入到动物或人细胞中的方式。优选的病毒载体包括那些来自复制缺陷的肝炎病毒(例如HBV和HCV)、逆转录病毒(参见例如WO89/07136；和Rosenberg等人，NEng J Med 323(9)570-578)、腺病毒(参见例如，Morsey等人，J Cell Biochem，Supp.17E)、腺相关病毒(Kotin等人，Proc Natl Acad Sci USA 872211-2215)、复制缺陷的单纯疱疹病毒(HSV；Lu等人，摘要，66页，Abstracts of theMeeting on Gene Therapy，Sep.22-26，1992，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.)、金丝雀痘病毒，以及这些载体的任何改良版本。如需要，在导入患者前可体外培养和克隆转染的细胞。
除了直接体内步骤，也可以使用离体步骤，其中细胞取自动物，修饰后放到相同或者另一只动物上。显然可以使用任何以上提到的组合物，在离体的背景下，将根据本发明的抗原性多肽或者编码这种多肽的多核苷酸引入组织细胞。病毒、物理和化学的摄取实验方法在本领域内是众所周知的。因此作为向患者直接给服本发明的多肽或者能够表达这种多肽的载体的另一种选择，可以从患者中取出辅助T细胞；使用相同的抗原性多肽或载体离体刺激那些T细胞；将刺激后的T细胞引入到同一患者中。
本发明的抗体和制备抗体的方法在另一个主要的实施方案中，用作药物的组合物包含能够结合多肽的抗体，所述多肽选自SEQ ID NO1-51的表面定位弯曲杆菌多肽。这样的药物可以用于抗体治疗，例如对需要接受的个体进行被动免疫。
因此在另一个主要的方面中，本发明涉及能够结合(优选是特异结合)多肽的抗体，所述多肽选自SEQ ID NO1-36和/或其片段和/或其变体，例如SEQ ID NO1的多肽和/或其片段和/或其变体，例如SEQ ID NO2的多肽和/或其片段和/或其变体，例如SEQ ID NO3的多肽和/或其片段和/或其变体，例如SEQ ID NO4的多肽和/或其片段和/或其变体，例如SEQ ID NO5的多肽和/或其片段和/或其变体，例如SEQ ID NO6的多肽和/或其片段和/或其变体，例如SEQ IDNO7的多肽和/或其片段和/或其变体，例如SEQ ID NO8的多肽和/或其片段和/或其变体，例如SEQ ID NO9的多肽和/或其片段和/或其变体，例如SEQ ID NO10的多肽和/或其片段和/或其变体，例如SEQ ID NO11的多肽和/或其片段和/或其变体，例如SEQ ID NO12的多肽和/或其片段和/或其变体，例如SEQ ID NO13的多肽和/或其片段和/或其变体，例如SEQ ID NO14的多肽和/或其片段和/或其变体，例如SEQ ID NO15的多肽和/或其片段和/或其变体，例如SEQ IDNO16的多肽和/或其片段和/或其变体，例如SEQ ID NO17的多肽和/或其片段和/或其变体，例如SEQ ID NO18的多肽和/或其片段和/或其变体，例如SEQ ID NO19的多肽和/或其片段和/或其变体，例如SEQ ID NO20的多肽和/或其片段和/或其变体，例如SEQ ID NO21的多肽和/或其片段和/或其变体，例如SEQ ID NO22的多肽和/或其片段和/或其变体，例如SEQ ID NO23的多肽和/或其片段和/或其变体，例如SEQ ID NO24的多肽和/或其片段和/或其变体，例如SEQ IDNO25的多肽和/或其片段和/或其变体，例如SEQ ID NO26的多肽和/或其片段和/或其变体，例如SEQ ID NO27的多肽和/或其片段和/或其变体，例如SEQ ID NO28的多肽和/或其片段和/或其变体，例如SEQ ID NO29的多肽和/或其片段和/或其变体，例如SEQ ID NO30的多肽和/或其片段和/或其变体，例如SEQ ID NO31的多肽和/或其片段和/或其变体，例如SEQ ID NO32的多肽和/或其片段和/或其变体，例如SEQ ID NO33的多肽和/或其片段和/或其变体，例如SEQ IDNO34的多肽和/或其片段和/或其变体，例如SEQ ID NO35的多肽和/或其片段和/或其变体，例如SEQ ID NO36表示的多肽和/或其片段和/或其变体，在这个上下文中，“特异结合”并不是意味着绝对的特异性。在一些实施方案中抗体也可以特异结合例如来自其他弯曲杆菌种类的多肽，这些多肽与来自空肠弯曲杆菌的多肽有高度的序列一致性，例如与来自空肠弯曲杆菌的多肽有90％以上的，例如95％以上的或者98％以上的序列一致性的多肽。
在优选的实施方案中，抗体能够结合(优选地特异结合)选自SEQID NO1-36的多肽，例如SEQ ID NO1的多肽，例如SEQ ID NO2的多肽，例如SEQ ID NO3的多肽，例如SEQ ID NO4的多肽，例如SEQ ID NO5的多肽，例如SEQ ID NO6的多肽，例如SEQ IDNO7的多肽，例如SEQ ID NO8的多肽，例如SEQ ID NO9的多肽，例如SEQ ID NO10的多肽，例如SEQ ID NO11的多肽，例如SEQ ID NO12的多肽，例如SEQ ID NO13的多肽，例如SEQID NO14的多肽，例如SEQ ID NO15的多肽，例如SEQ ID NO16的多肽，例如SEQ ID NO17的多肽，例如SEQ ID NO18的多肽，例如SEQ ID NO19的多肽，例如SEQ ID NO20的多肽，例如SEQ ID NO21的多肽，例如SEQ ID NO22的多肽，例如SEQ IDNO23的多肽，例如SEQ ID NO24的多肽，例如SEQ ID NO25的多肽，例如SEQ ID NO26的多肽，例如SEQ ID NO27的多肽，例如SEQ ID NO28的多肽，例如SEQ ID NO29的多肽，例如SEQID NO30的多肽，例如SEQ ID NO31的多肽，例如SEQ ID NO32的多肽，例如SEQ ID NO33的多肽，例如SEQ ID NO34的多肽，例如SEQ ID NO35的多肽，例如SEQ ID NO36的多肽。
在优选的实施方案中，本发明的抗体还能够与完整的空肠弯曲杆菌细胞结合，即能够结合保持其结构完整性(优选是保持其外膜完整性，即其中外膜没有被通透化)的生活的或者死亡的空肠弯曲杆菌细胞。抗体与完整细胞的结合可以例如通过流式细胞仪，根据Rioux等人，(2001)Infect.Immun.695162-5165或者在Singh等人，(2003)Infect.Immun.713937-3946中的描述测定。
在另一个主要方面中，本发明涉及能够结合，优选特异结合完整的空肠弯曲杆菌细胞并且能够结合，优选特异结合选自SEQ ID NO37-51的多肽和/或其片段和/或其变体的抗体，例如SEQ ID NO37的多肽和/或其片段和/或其变体，例如SEQ ID NO38的多肽和/或其片段和/或其变体，例如SEQ ID NO39的多肽和/或其片段和/或其变体，例如SEQ ID NO40的多肽和/或其片段和/或其变体，例如SEQ IDNO41的多肽和/或其片段和/或其变体，例如SEQ ID NO42的多肽和/或其片段和/或其变体，例如SEQ ID NO43的多肽和/或其片段和/或其变体，例如SEQ ID NO44的多肽和/或其片段和/或其变体，例如SEQ ID NO45的多肽和/或其片段和/或其变体，例如SEQ ID NO46的多肽和/或其片段和/或其变体，例如SEQ ID NO47的多肽和/或其片段和/或其变体，例如SEQ ID NO48的多肽和/或其片段和/或其变体，例如SEQ ID NO49的多肽和/或其片段和/或其变体，例如SEQ IDNO50的多肽和/或其片段和/或其变体，例如SEQ ID NO51的多肽和/或其片段和/或其变体。
在优选的实施方案中，抗体能够结合，优选特异结合完整的空肠弯曲杆菌细胞并且能够结合，优选特异结合选自SEQ ID NO37-51的多肽，例如SEQ ID NO37的多肽，例如SEQ ID NO38的多肽，例如SEQ ID NO39的多肽，例如SEQ ID NO40的多肽，例如SEQID NO41的多肽，例如SEQ ID NO42的多肽，例如SEQ ID NO43的多肽，例如SEQ ID NO44的多肽，例如SEQ ID NO45的多肽，例如SEQ ID NO46的多肽，例如SEQ ID NO47的多肽，例如SEQ ID NO48的多肽，例如SEQ ID NO49的多肽，例如SEQ IDNO50的多肽，例如SEQ ID NO51的多肽。
优选的抗体是结合的解离常数或Kd低于5×10-6M的抗体，例如低于10-6M，例如低于5×10-7M，例如低于10-7M，例如低于5×10-8M，例如低于10-8M，例如低于5×10-9M，例如低于10-9M，例如低于5×10-10M，例如低于10-10M，例如低于5×10-11M，例如低于10-11M，例如低于5×10-12M，例如低于10-12M，例如低于5×10-13M，例如低于10-13M，例如低于5×10-14M，例如低于10-14M，例如低于5×10-15M，或者低于10-15M。可以使用本领域内众所周知的方法，例如ELISA(例如如Orosz和Ovadi(2002)J.Immunol.Methods 270155-162中的描述)或表面等离子共振分析测定结合常数。
抗体可以用于哺乳动物(优选是人，更优选是免疫损害患者)的被动免疫。可以进行使用抗体的治疗以治愈或者防止空肠弯曲杆菌的感染。
本发明的抗体包括以下优选的机理组1.作为抗菌(影响细菌的生活力)物质起作用的功能抑制抗体。不论患者的免疫状态如何，这种抗体都应当是有效的。优选地，这些抗体能够减缓空肠弯曲杆菌的生长至低于50％(例如低于25％例如低于10％，例如低于5％)未加入抗体的对照的生长。
2.设计目的是增强吞噬细胞杀死的调理抗体。这种抗体的有效性可以取决于患者的免疫状态，但是即使在免疫损害的患者中它们也非常有可能增强吞噬细胞杀死。
3.与治疗性分子例如毒素或杀菌物质(例如篦麻毒素)或放射性同位素偶联的抗体。偶联治疗性分子与抗体的技术是众所周知的，参见例如Thorpe等人，(1982)Immunol.Rev.62，119-158。不论患者的免疫状态如何，这种抗体都应当是有效的。
有或者没有治疗性分子偶联的抗体可以用作治疗剂，它可以单独给服或者与化疗剂或者其他治疗药物组合使用。
在一个实施方案中，本发明的抗体是调理的而且是抑制功能的。在另一个实施方案中，本发明的抗体是调理的但不是抑制功能的。后一组抗体可以是例如针对弯曲杆菌生活力非必需的靶标多肽的抗体。
在另一个主要方面中，本发明涉及了在非人的动物中制备抗多肽抗体的方法，所述多肽选自SEQ ID NO1-36，包括以下步骤a.提供-多肽，它包含选自SEQ ID NO1-36的序列，或者它包含所述序列的抗原性片段或变体，或-包含所述多肽编码序列的多核苷酸，或-包含所述多肽编码序列的表达载体，或-包含所述多核苷酸或者所述表达载体的重组病毒或者重组细胞，b.将包含所述多肽、多核苷酸、载体、重组病毒或重组细胞的组合物引入所述动物中，c.在所述动物中制备抗体，以及d.分离抗体以及任选地，纯化抗体。
在另一个主要方面中，本发明涉及了在非人的动物中制备抗多肽抗体的方法，所述多肽选自SEQ ID NO37-51，其中的抗体能够结合完整的空肠弯曲杆菌细胞，方法包括以下步骤a.提供-多肽，它包含选自SEQ ID NO37-51的序列，或者它包含所述序列的抗原性片段或变体；或-包含编码所述多肽的序列的多核苷酸；或-包含编码所述多肽的序列的表达载体，或-包含所述多核苷酸或者所述表达载体的重组病毒或者重组细胞，b.将包含所述多肽、多核苷酸、载体、重组病毒或重组细胞的组合物引入所述动物中，c.在所述动物中制备抗体，d.分离抗体以及任选地，纯化抗体，以及e 筛选能够结合完整的空肠弯曲杆菌细胞的抗体。
优选地在能够产生人抗体的转基因动物中进行以上方法。在另一个优选的实施方案中，以上方法是非治疗性的。
单克隆/多克隆抗体本发明的抗体可以是单克隆抗体，或者多克隆抗体，或者单克隆抗体的混合物。在优选的实施方案中，抗体是单克隆抗体或者其片段。单克隆抗体(Mab′s)是这样的抗体，其中每个抗体分子都是相似的，因此识别相同的表位。抗体可以是任何种类的抗体，但是优选是IgG或IgA抗体。
一般通过杂交瘤细胞系产生单克隆抗体。制备单克隆抗体以及制备合成抗体的杂交瘤的方法对本领域内技术人员是众所周知的。产生抗体的杂交瘤可以例如通过产生抗体的B淋巴细胞与无限增殖化的细胞系融合制备。可以通过以下步骤制备单克隆抗体。使用抗原(例如全长多肽或者其片段)免疫动物。通常通过向免疫活性的哺乳动物给服免疫有效量(即足以产生免疫应答的量)的抗原，完成免疫。优选地，哺乳动物是啮齿动物例如家兔、大鼠或小鼠。然后对哺乳动物进行加强免疫程序，加强免疫的时间足以使哺乳动物产生高亲和性的抗体分子。产生抗体的细胞悬液取自每只分泌所需抗体的经过免疫的哺乳动物。在充足时间产生高亲和性抗体之后，处死动物(例如小鼠)，从一个或更多的淋巴结、脾脏和外周血中获得产生抗体的淋巴细胞。优选的是脾细胞，它们可以在生理培养基中使用本领域技术人员众所周知的方法被机械地分成单个细胞。产生抗体的细胞通过与小鼠骨髓瘤细胞系融合而无限增殖化。小鼠淋巴细胞与小鼠的同源骨髓瘤产生高百分比的稳定融合，但是也可以使用大鼠、家兔和青蛙的体细胞。一般在融合剂例如聚乙二醇的存在下通过与骨髓瘤细胞融合使所需的产生抗体的动物的脾细胞无限增殖化。适于作为融合伴侣的多种骨髓瘤细胞系的任何一种可以是，例如P3-NS1/1-Ag4-1，P3-x63-Ag8.653或Sp2/0-Ag14骨髓瘤细胞系，可以从位于Rockville，Md的美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得。
还可以使用其他对重组DNA技术领域内技术人员众所周知的方法产生单克隆抗体。已经开发出了另外一种替代方法，被称为“组合抗体展示”方法，用于鉴定和分离具有某种特异性的抗体片段，并且可以用于制备单克隆抗体。
多克隆抗体是识别特定给定抗原的抗体分子的混合物，因此多克隆抗体可以识别例如多肽内的不同表位。多克隆抗体一般从已经接受抗原免疫的哺乳动物的血清中纯化。多克隆抗体可以例如根据AntibodiesA Laboratory Manual，Ed Harlow和David Lane，ColdSpring Harbor Labora tory Press，1988中描述的任何方法制备。多克隆抗体可以来自任何适宜的哺乳动物，例如来自小鼠、大鼠、家兔、驴、山羊和绵羊。
特异性本发明抗体的特异性可以是针对SEQ ID NO1-51中任何一个多肽的单特异性。在另一个实施方案中，抗体是双特异的或者多特异的，其具有至少一部分对SEQ ID NO1-51中任何一个多肽是特异的。
单克隆抗体可以是单价的，即只有一个结合结构域。对于单价抗体，免疫球蛋白恒定结构域氨基酸序列优选包含在本领域中被称为CH1，CH2，CH3和CH4的抗体分子结构部分。优选地是那些在本领域内被称为CL的结构部分。此外，恒定结构域可以是重链或轻链恒定结构域(分别是CH或CL)，本发明涉及多种不同的单价抗体组合物。例如，轻链恒定结构域能够与另一个轻链恒定结构域或者与一个重链恒定结构域通过二硫桥结合。相反，重链恒定结构域可以形成两个独立的二硫桥，产生与另一条重链和一条轻链通过二硫桥连接或者形成重链多聚物的可能性。因此在另一个实施方案中本发明涉及包含单价多肽的组合物，其中的恒定链结构域C具有能够形成至少一个二硫桥的半胱氨酸，且组合物包含至少两条由所述二硫桥共价连接的单价多肽。
在本发明的另一个实施方案中，抗体是具有至少两个结合结构域的多价抗体。结合结构域可以对相同配基或者对不同配基具有特异性。
多特异性，包括双特异性在优选的实施方案中，本发明涉及多特异性抗体，它具有对至少两个不同实体的亲和性，并且能够与这两个实体特异结合。
在一个实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体，它携带至少两个不同结合结构域，其中至少一个来自抗体。本发明的双特异分子还可以是单链双特异分子。多特异分子也可以是单链分子或者可以包含至少两个单链分子。多特异，包含双特异的抗体可以通过本领域内技术人员知道的任何适宜方式制备。已经开发出多种方法，例如在WO94/09131；WO 94/13804；WO 94/13806或美国专利Nos.5,260,203；5,455,030；4,881,175；5,132,405；5,091,513；5,476,786；5,013,653；5,258,498；和5,482,858中描述的方法。
使用根据本发明的双特异性或者多特异性抗体，与单特异性/单价抗体相比提供了几个优势。双特异性/多特异性抗体具有的第一个结合结构域能够特异识别和结合SEQ ID NO1-51所示空肠弯曲杆菌多肽中的任何一个，而另一个结合结构域可以用于其他目的。在一个实施方案中，至少一个另外的结合结构域用于与空肠弯曲杆菌多肽结合，例如与第一个结合结构域结合的相同空肠弯曲杆菌多肽上的另一个表位结合。这样，对空肠弯曲杆菌的特异性可能提高，且抗体的亲和力也可能提高。在另一个实施方案中，可以用至少一个其他结合结构域与哺乳动物细胞例如人的细胞特异结合。优选地，至少另一个结合结构域能够结合免疫活性细胞例如白细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、嗜碱性细胞和/或嗜曙红细胞，目的是增强抗体在治疗方法中的作用。可以通过确定至少一个其他结合结构域能够特异结合哺乳动物蛋白(例如人蛋白，例如选自分化群蛋白(CD)中的任何一个蛋白特别是CD64和/或CD89)实现上述要求。
人化抗体使用非人抗体用于人的治疗并不总是合意的，因为非人的“外源”表位可能会引发待治疗个体中的免疫应答。为了消除或者使与非人抗体相关的问题最少化，最好对嵌合抗体衍生物进行工程化，即将非人的Fab可变区结合决定簇与人的恒定区(Fc)结合，使抗体分子“人化”。这种抗体表征为具有与以上描述的单克隆抗体和多克隆抗体等价的抗原特异性和亲和性，以及向人给服时更低的免疫原性，因此更有可能被待治疗的个体耐受。
因此，在一个实施方案中，本发明的抗体是人化抗体。人化抗体一般是嵌合抗体，包含来自人抗体的区域和来自非人抗体例如啮齿动物抗体的区域。人化(也被称为改型或者CDR移植)是已为大家接受的的技术，用于降低异种来源(通常是啮齿类)单克隆抗体的免疫原性、增加与人免疫球蛋白的同源性并且增强它们对人免疫系统的活化。因此，人化抗体通常是人抗体，其中一些CDR残基以及可能有一些框架残基被来自啮齿类抗体中类似位点的残基替代。
人化抗体必需保持对抗原的高度亲和性以及其他有利的生物学性质。为了达到这个目的，根据优选的方法，使用亲本和人化序列的三维模型对亲本序列以及多种不同的理论产物进行分析，制备人化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可以获得的并且是本领域技术人员熟悉的。可以获得计算机程序，阐明和显示了所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构。对这些显示进行研究，可以对某些残基在候选免疫球蛋白序列行使功能中的可能作用进行分析，即对影响候选免疫球蛋白与其抗原结合能力的残基进行分析。这样，虽然是CDR残基直接并且最显著地影响抗体结合，但是可以从受体序列和输入序列中选择和组合FR残基，使所需的抗体特征(例如对于靶标抗原增加的亲和性)被最大化。
获得人化单抗的一种方法涉及制备嵌合抗体，在所述嵌合抗体中，包含一个抗体完整可变结构域的抗原结合位点与来自第二个抗体(优选是人抗体)的恒定结构域融合。实施这种嵌合化步骤的方法是例如在EP-A-0 120 694(Celltech Limited)，EP-A-0 125 023(GenentechInc.)，EP-A-0 171 496(Res.Dev.Corp.Japan)，EP-A-0173494(Stanford University)和EP-A-0 194 276(Celltech Limited)中描述的方法。
本发明的人化抗体可以通过能够使用来自非人抗体的CDR替换至少一部分人抗体CDR的方法进行。Winter描述了可以用于制备本发明人化抗体的方法(英国专利申请GB 2188638A)，其内容在这里引用作为参考。
作为示例，本发明的人化抗体可以通过以下过程制备(a)通过常规技术构建含有操纵子以及编码抗体重链的DNA序列的表达载体，其中CDR和需要保持抗体结合特异性的这些可变结构域框架区的最小部分来自非人免疫球蛋白，抗体链的剩余部分来自人免疫球蛋白；(b)通过常规技术构建含有操纵子以及编码互补抗体轻链的DNA序列的表达载体，其中CDR和需要保持供体抗体结合特异性的这些可变结构域框架区的最小部分来自非人免疫球蛋白，抗体链的剩余部分来自人免疫球蛋白；(c)通过常规技术将表达载体转染到宿主细胞中；以及(d)通过常规技术培养转染的细胞，产生人化抗体。
可以使用本发明的两个载体共转染宿主细胞，第一个载体含有的操纵子编码来自轻链的多肽，第二个载体含有的操纵子编码来自重链的多肽。两个载体含有不同的筛选标记，但是此外除了抗体重链和轻链多肽序列外，优选地两个载体是相同的，以尽可能保证重链和轻链多肽的相同表达。或者可以使用单一载体，载体包括编码轻链和重链多肽的序列。轻链和重链多肽的编码序列可以包含cDNA或者基因组DNA或者二者均包含。
用于表达本发明改变抗体的宿主细胞可以是细菌细胞例如大肠杆菌或者真核细胞。特别是可以使用用于该目的的明确确定类型的哺乳动物细胞，例如骨髓瘤细胞或者中国仓鼠卵巢细胞。
构建本发明载体的一般方法、产生本发明宿主细胞所需的转染方法以及从这些宿主细胞中产生本发明抗体所需的培养方法都是常规的技术。同样，一旦制备出来，本发明的人化抗体可以根据标准步骤纯化。
人抗体在更优选的实施方案中，本发明涉及的是抗体，其中的结合结构域由人抗体携带，即其中的抗体比人化抗体具有更高程度的人肽序列。
针对人蛋白的人单抗可以使用携带人免疫系统而不是小鼠免疫系统的转基因小鼠制备。使用来自这些用目标抗原免疫的转基因小鼠的脾细胞制备分泌人单抗(单抗对来自人蛋白的表位具有特异亲和性)的杂交瘤(参见例如Wood等人，国际申请WO 91/00906，Kucherlapati等人，PCT出版物WO 91/10741；Lonberg等人，国际申请WO92/03918；Kay等人，国际申请92/03917；Lonberg，N.等人，1994 Nature 368856-859；Green，L.L.等人，1994 NatureGenet.713-21；Morrison，S.L.等人，1994 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 816851-6855；Bruggeman等人，1993 Year Immunol 733-40；Tuaillon等人，1993 PNAS 903720-3724；Bruggeman等人，1991 Eur J Immunol 211323-1326)。这些转基因小鼠可以从Abgenix，Inc.，Fremont，Calif.，和Medarex，Inc.，Annandale，N.J获得。已经描述了在种系突变体小鼠中抗体重链连接区(IH)基因的同源删除导致内源抗体产生的完全抑制。将人种系免疫球蛋白基因阵列转移到这种种系突变体小鼠中会使小鼠在接受抗原攻击后产生人抗体，参见例如Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 902551(1993)；Jakobovits等人，Nature 362255-258(1993)；Bruggemann等人，Year in Immunol.733(1993)；和Duchosal等人，Nature 355258(1992)。人抗体也可以来自噬菌体展示文库(Hoogenboom等人，J.Mol.Biol.227381(1992)；Marks等人，J.Mol.Biol.222581-597(1991)；Vaughan，等人，，NatureBiotech 14309(1996))。
制备人单克隆抗体的适宜方法还已经在WO03/017935，WO02/100348，US 2003 091561，和US 2003 194403中有所描述。
抗体的结合片段在本发明的一个实施方案中，抗体是抗体片段，优选是抗原结合片段或者可变区。在本发明中有用的抗体片段的示例包括Fab，Fab′，F(ab′)2和Fv片段。木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，它们被称为Fab片段，每一个都有单一的抗原结合位点以及残留的″Fc″片段，这样称呼是因为它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合片段、能够交联抗原的F(ab′)2片段以及另一个残留片段(被称为pFc′)。其他片段可以包括由抗体片段形成的双功能抗体、线形抗体、单链抗体分子以及多特异性抗体。
抗体片段Fab、Fv和scFv与整个抗体的区别在于抗体片段只携带单一抗原结合位点。已经通过多种方式，例如通过在Fv的VH的C端引入的半胱氨酸(Cumber等人，，1992)或者在scFv的VL的C端引入的半胱氨酸(Pack and Pluckthun，1992)，或者通过Fab的铰链半胱氨酸残基进行化学交联(Carter等人，，1992)，制备了具有两个结合位点的重组片段。
优选的抗体片段保留了抗体的一些或者基本上所有的选择性结合其抗原的能力。一些优选的片段如下面确定(1)Fab是含有抗体分子的单价抗原结合片段的片段。Fab片段可以通过木瓜蛋白酶消化完整抗体，产生完整的轻链和一条重链的一部分而获得。
(2)Fab′是抗体分子的片段，可以通过使用胃蛋白酶处理整个抗体之后进行还原，产生完整的轻链和重链的一部分而获得。每个抗体分子得到两个Fab′片段。Fab′片段与Fab片段的区别在于在重链CH1结构域的羧基端添加了几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或更多半胱氨酸。
(3)F(ab′)2是抗体的片段，其可以通过使用胃蛋白酶处理整个抗体接下来不进行还原而获得。F(ab′)2是两个Fab′片段由两个二硫键连接的二聚体。
(4)Fv是最小的抗体片段，它含有完整的抗原识别和结合位点。该区域由一个重链和一个轻链可变区结构域以松散、非共价结合而成的二聚体(VH-VL二聚体)组成。正是这种构型使来自所有可变结构域的CDR相互作用，确定了VH-VL二聚体表面上的抗原结合位点。六个CDR共同赋予了抗体抗原结合特异性。但是，即使是单可变结构域(或者只包含对抗原特异的三个CDR的一半Fv)也具有识别和结合抗体的能力，尽管比整个结合位点的亲和性低。
在本发明的一个实施方案中抗体是单链抗体，明确为含有轻链可变区、重链可变区的遗传工程化的分子，两个可变区由适宜的多肽衔接物连接成为遗传融合的单链分子。这种单链抗体也被成为“单链Fv”或者“sFv”抗体片段。一般地，Fv多肽在VH和VL结构域之间还包含多肽衔接物，这使sFv能够形成所需的结合抗原的结构。
根据本发明的抗体片段可以通过本领域内技术人员知道的任何适宜方式制备。已经开发出几种微生物表达系统，用于制备活性抗体片段，例如已经描述了在多种不同宿主如大肠杆菌或酵母中产生Fab。片段可以作为Fab′或者Fv产生，但是此外已经显示VH和VL可以被柔韧的多肽衔接物以两个方向中的任意一个遗传连接，这种组合被称为scFv。
用于本发明的组合物在用于药物的组合物的优选实施方案中，所述组合物包含除了活性组分以外药物上可以接受的载体。
如这里所使用的，与组合物或者载体相关使用的术语“药物上可以接受的”表示该物质能够向人或动物给服而不会产生不合意的生理效果例如恶心、晕眩、肠胃不适等等。
含有溶解于其中或者分散于其中的活性成分的组合物的制备是本领域充分理解的。通常这种组合物以无菌可注射物的形式制备，或者是液态溶液或悬液，水或非水溶液，然而也可以制备适于在使用前溶解或者悬浮于液体中的固体形式。制剂也可以被乳化。活性组分可以与药物上可以接受的、与活性组分相容的载体混合，载体的量适宜用于这里描述的方法中。适宜的载体有，例如水、盐水、右旋葡萄糖、甘油、乙醇等等以及其组合。此外，如果需要的话，组合物可以含有提高活性成分有效性的微量辅助物质例如润湿或者乳化剂，pH缓冲剂等等。
本发明的组合物可以在其中包含药物上可以接受的组合物组分的盐。药物上可以接受的盐包括与无机酸(例如盐酸或者磷酸)或者有机酸(例如乙酸、酒石酸、扁桃酸)等形成的酸式盐(与多肽的自由氨基基团形成)。与自由羧基基团形成的盐也可以来自无机碱(例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵或者氢氧化铁)以及有机碱(例如异丙胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等等)。
药物上可以接受的载体是本领域内众所周知的。示例性的液态载体有无菌的水溶液(它除了含有活性组分和水以外不含有其他物质)或者含有缓冲剂(例如生理pH值下的磷酸钠、生理盐水或者二者均含有，例如磷酸盐缓冲液)。另外，含水载体可以含有一种以上的缓冲盐以及盐例如氯化钠和氯化钾、右旋葡萄糖、丙二醇、聚乙二醇以及其他溶质。液态组合物除了水以外还可以含有其他液相。示例性的这种其他液相是甘油、植物油(例如棉籽油)、有机酯类(例如油酸乙酯)和水-油乳剂。
含有本发明多肽或者抗体的组合物优选含有至少占每份总药物组合物重量0.1重量百分比的多肽或者抗体。重量百分比是多肽或者抗体与总组合物的重量之比。因此，例如0.1重量百分比是每100克总组合物0.1克多肽或者抗体。
组合物也可以是部分试剂盒(kit-in-part)，还包括抗生素物质〔例如选自β-内酰胺、头孢霉素、青霉素、氨基糖苷抗生素、大环内酯类抗生素(红霉素、克拉霉素或阿奇霉素)以及蒽醌类抗生素(环丙沙星、左氧氟沙星、加替沙星、或莫西杀星)的抗生素〕和/或免疫刺激物质(例如细胞因子、干扰素、生长因子例如GCSF或GM-CSF)。部分试剂盒(kit-in-part)可以用于同时、顺序或者分别给药。
本发明还涉及在实施这里描述的方法时有用的药物组合物。这样本发明涉及了包含药物上可以接受载体以及-包含SEQ ID NO1-36任何一个序列、或者包含所述序列的片段或变体的分离多肽，-包含所述多肽编码序列的分离多核苷酸，-包含所述多肽编码序列的表达载体，或者-包含所述多核苷酸或者所述表达载体的重组病毒或者重组细胞。
此外，本发明涉及药物组合物，药物组合物包含如这里确定的本发明抗体以及药物上可以接受的载体。
本发明的多肽本发明的片段在另一个方面中，本发明涉及片段，优选为SEQ ID NO1-51任何一项(例如SEQ ID NO1-36的任何一项或者SEQ ID NO37-51的任何一项)给出的多肽的抗原性片段。这种片段的长度各有不同，可以从多肽的两个连续氨基酸残基到全长多肽减去一个氨基酸残基。优选地，片段的长度小于100个连续氨基酸，例如小于70或50个连续氨基酸，例如小于40个连续氨基酸，例如小于30个连续氨基酸，例如小于25个连续氨基酸，例如小于20个连续氨基酸。因此，例如片段长度可以是2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或者20个连续氨基酸。在其他优选的实施方案中，片段包含6个或者更多，例如7个或者更多，例如8个或者更多，例如9个或者更多，例如10个或者更多相应全长序列的连续氨基酸残基。优选的范围包括长度在5和50个连续氨基酸之间的片段，例如长度在5和25个连续氨基酸之间，例如长度在5和20个连续氨基酸之间。用另一种方式表示，片段由氨基酸序列的一部分组成，与全长多肽相比，它的长度小于全长多肽的100％。优选地，片段长度小于全长多肽长度的99％，例如小于75％，例如小于50％，例如小于25％，例如小于20％，例如小于15％，例如小于10％。在其他优选的实施方案中，片段由氨基酸序列的部分组成，它的长度与全长的多肽相比小于100％，但是大于1％，例如小于100％但是大于5％，例如小于100％但是大于10％，例如小于100％但是大于20％，例如小于100％但是大于25％，例如小于100％但是大于50％的全长多肽长度。
优选的特异片段包括如下片段，其包含选自SEQ ID NO52-119的片段的一个或多个残基，例如两个或者更多，例如三个或者更多，例如四个或者更多，例如五个或者更多，例如六个或者更多，选自SEQID NO52-119的片段的连续残基。更为优选的特异片段包括的片段由或者基本上由选自SEQ ID NO52-119的序列组成。
其他优选的片段包括来自2003年11月21日提交的丹麦专利申请PA 2003 01726中序列表1以及2003年11月25日提交的美国暂时申请60/524,617的片段，在这里引用作为参考。
优选地，本发明的片段是在完整的空肠弯曲杆菌细胞中或者其他细胞(如果在其中重组表达)中暴露于表面的片段。可以使用对所述片段特异的单克隆抗体测定在表面的暴露，例如如Singh等人，(2003)Infect.Immun.713973-3946中的描述。另外优选的片段能够诱导可与完整空肠弯曲杆菌细胞结合的抗体。这种抗体的确定可以通过使用所述片段制备单克隆抗体然后对单个抗体与完整细胞的结合进行表征，如Singh等人，(2003)Infect.Immun.713973-3946中所描述的。
SEQ ID NO1-51的全长多肽以及本发明的片段可以通过本领域内已知的常规技术制备。适宜的宿主细胞可以是哺乳动物细胞例如CHO，COS或HEK293细胞。或者可以使用昆虫细胞、细菌细胞或者真菌细胞。在以上列出的细胞类型中异源表达多核苷酸序列以及接下来产生的多肽(例如使用标签序列例如组氨酸标签，在纯化之后可以除去)的纯化方法，对于本领域内的技术人员是众所周知的。或者可以合成制备本发明的片段。
本发明的变体在另一个主要方面中，本发明涉及SEQ ID NO1-51(例如SEQ IDNO1-36的任何一项或者SEQ ID NO37-51的任何一项)中提供的任何多肽的变体或者SEQ ID NO1-51中提供的任何多肽的片段的变体在用作药物的组合物中的用途。
在这里使用时，短语例如“与SEQ ID NOX具有至少95％的序列一致性的多肽”与术语例如“SEQ ID NOX的多肽及其变体，其中的变体与所述的序列具有至少95％的序列一致性”可以交换使用，并且意指相同的对象。
变体优选与给定的多肽或者片段具有至少75％的序列一致性，例如至少80％的序列一致性，例如至少85％的序列一致性，例如至少90％的序列一致性，例如至少91％的序列一致性，例如至少92％的序列一致性，例如至少93％的序列一致性，例如至少94％的序列一致性，例如至少95％的序列一致性，例如至少96％的序列一致性，例如至少97％的序列一致性，例如至少98％的序列一致性，例如至少99％的序列一致性。使用Wisconsin遗传软件包7.0中的GAP，BESTFIT，或者FASTA中的任何一种算法，使用缺省空位加权确定序列一致性。
给定多肽或者片段的优选变体是这样的变体，其中在变体与给定参考多肽或片段之间的所有氨基酸替代都是保守替代。保守氨基酸替代指的是具有相似侧链的残基的可交换性。例如，具有脂肪族侧链的氨基酸组是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族羟基侧链的氨基酸组是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的氨基酸组是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香侧链的氨基酸组是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的氨基酸组是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；具有含硫侧链的氨基酸组是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸替代组是缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，赖氨酸-精氨酸，丙氨酸-缬氨酸以及天冬酰胺-谷氨酰胺。
多肽或者其片段的变体还包括其中一个或多个氨基酸被删除或者插入的多肽或者片段的形式。优选地，小于5，例如小于4，例如小于3，例如小于2，例如只有一个氨基酸被插入或者删除。多肽或者其片段的“变体”还包括被氨基酸序列翻译后修饰了的这些多肽或者片段的形式。
本发明的多核苷酸和表达载体在另一个方面中，本发明涉及多核苷酸，优选是分离的和/或重组的多核苷酸，包含选自SEQID NO1-51的序列的抗原性片段或者变体的编码序列，例如选自SEQID NO1-36的序列的抗原性片段或者变体的编码序列或者选自SEQID NO37-51的序列的抗原性片段或者变体的编码序列。
此外，本发明涉及了包含多肽编码序列的表达载体，所述多肽包含选自由SEQ ID NO1-51的序列，或者包含任何所述序列的片段或者变体。优选的表达载体是适于DNA疫苗接种的表达载体。其他优选的表达载体是本发明的多肽在启动子控制下的表达载体，启动子指导序列在大肠杆菌或者沙门氏菌中的表达。沙门氏菌表达载体在这里描述的本发明重组病毒或者重组细胞的制备中是有用的。
本发明的多核苷酸和表达载体可以通过本领域内技术人员众所周知的标准的重组DNA技术制备。
本发明的重组细胞在另一个主要方面中，本发明涉及了使用多核苷酸转化或者转染的重组细胞，所述多核苷酸包含编码多肽的序列，所述多肽包含选自SEQ ID NO1-36的序列或者包含所述序列的抗原性片段或者变体。优选地，所述重组细胞是大肠杆菌或者沙门氏菌细胞，更优选是减毒的或者毒性降低的大肠杆菌或沙门氏菌。
在另一个方面中，本发明涉及的是重组的减毒或者毒性降低的微生物细胞，优选是被多核苷酸转化或转染的大肠杆菌或者沙门氏菌细胞，所述多核苷酸包含编码多肽的序列，所述多肽包含选自SEQ ID NO37-51的序列，或者包含所述序列的抗原性片段或者变体。
在例如Makino等人，(2001)Microb.Pathog.311-8；Gentschev等人，(2002)Int.J.Med.Microbiol.291577-582；Turner等人，(2001)Infect.Immun.694969-4979；WO99/49026；和WO03/022307及其中的参考文献中描述了适宜在这里使用的细菌菌株。适宜的沙门氏菌菌株的示例有CvD908-T7pol(Santiago-Machuca等人，(2002)Plasmid 47108-119)，ATCC39183，ATCC 53647和ATCC 53648。适宜的大肠杆菌菌株的示例有YT106和E1392/75-2A。
本发明的方法和使用以上定义的组合物和其他产物可以用于在需要进行以下治疗的动物或人中治疗或者预防空肠弯曲杆菌的感染和/或由这种感染导致的疾病。优选地，动物是鸡、鸭、火鸡、奶牛或者猪。优选的人群是危险群体，例如4周岁以下的儿童群体、工业化国家的人群或者到发展中国家的未接触过抗原或者半免疫的旅行者群体。
这里的治疗和预防包括抗击空肠弯曲杆菌的所有类型治疗性治疗和预防性治疗以及其他治疗，包括但是不止限于疫苗接种、预防、主动免疫、被动免疫、抗体给药、根除性治疗、改善性治疗。特别地，使用本发明抗体的被动免疫是对免疫损害个体的适宜治疗。
因此，在另一个方面中，本发明涉及治疗或预防动物或人中空肠弯曲杆菌感染的方法，包括给服下列任何一项的步骤-多肽，其包含SEQ ID NO1-51的任何序列(例如SEQ ID NO1-36的任何序列或者SEQ ID NO37-51的任何序列)，或者包含所述序列的抗原性片段或变体，-包含所述多肽编码序列的多核苷酸，-包含编码所述多核苷酸序列的表达载体，-包含所述多核苷酸或所述表达载体的重组病毒或重组细胞，或者-能够特异结合所述多肽的抗体，籍此治疗或预防在所述动物或人中的空肠弯曲杆菌感染。
优选地，所述给药通过胃肠道外、静脉内、肌肉内、皮下、口服或者鼻内进行优选地，所述药物是适宜进行胃肠道外、静脉内、肌肉内、皮下、口服或者鼻内给药的药物。
在另一个方面中，本发明涉及在动物或人中针对空肠弯曲杆菌感染进行的免疫方法，包括给服如下的步骤-多肽，其包含选自SEQ ID NO1-51的序列(例如SEQ ID NO1-36的任何序列或者SEQ ID NO37-51的任何序列)，或者包含所述序列的抗原性片段或变体，-包含所述多肽编码序列的多核苷酸，
-包含编码所述多核苷酸序列的表达载体，或者-包含所述多核苷酸或所述表达载体的重组病毒或重组细胞优选地，所述给药通过胃肠道外、静脉内、肌肉内、皮下、口服或者鼻内进行。
在另一个方面中，本发明涉及这里阐述的本发明抗体用于制造用于治疗或预防动物或人的空肠弯曲杆菌感染的药物的用途。因此，本发明还涉及治疗或预防空肠弯曲杆菌感染的方法，包含给服这里阐述的本发明抗体的步骤，从而治疗或者预防空肠弯曲杆菌感染。优选地，所述给药通过胃肠道外、静脉内、肌肉内、皮下、口服或者鼻内进行。
本发明的诊断方法本发明的发明者确定的51个多肽既暴露于表面且在细胞中的相对高拷贝数目，这两个特点的组合使它们非常适于作为检测空肠弯曲杆菌的靶标，使得对这种生物的检测具有高度敏感性。
因此，在另一个主要方面中，本发明涉及在样品中检测空肠弯曲杆菌或者其部分的方法，包括以下步骤a.将所述样品与能够与多肽特异结合的指示分子接触，所述多肽选自SEQID NO1-36，以及b.确定指示分子是否产生了信号，从而检测所述样品是否含有空肠弯曲杆菌或者其部分。
优选地，所述指示分子能够结合(优选为特异结合)完整的空肠弯曲杆菌细胞。
在另一个方面，本发明涉及了检测空肠弯曲杆菌的方法，包括以下步骤a.将所述样品与能够与多肽特异结合的指示分子接触，所述多肽选自SEQID NO37-51，其中的指示分子还能够与完整的空肠弯曲杆菌细胞结合(优选为特异结合)以及b.确定指示分子是否产生了信号，从而检测所述样品是否含有空肠弯曲杆菌或者其部分。
在以上诊断方法的优选实施方案中，在接触步骤和测定步骤之间进行一次漂洗步骤，目的是提高检测的特异性。
样品可以是例如粪便、尿、组织、组织提取物、液体样品或者体液样品例如血液、血浆或血清。样品的另一个示例是食物样品，例如肉样品。
以上的方法可以例如用于诊断个体中的空肠弯曲杆菌感染或者弯曲杆菌病。在以上方法的优选实施方案中，所述的指示分子不穿过空肠弯曲杆菌细胞的外膜。所述指示分子的优选类型由抗体组成或者包含抗体，例如这里明确的本发明抗体。
本领域的技术人员应当理解有多种众所周知的临床诊断化学步骤，其中可以使用指示分子形成结合反应产物，反应产物的量与样品中配基(这里是空肠弯曲杆菌或者其部分)的量有关。因此，虽然这里描述了示例性的检测方法，但是本发明不止限于此。
本发明还涉及诊断系统(优选是试剂盒的形式)用于检测生物样品中空肠弯曲杆菌的存在(优选是其含量)。制备诊断试剂盒的方法已经在例如US 5,470,958及其参考文献中有所描述。
诊断系统包括，根据本发明的指示分子(优选是独立包装的药剂，更优选地还有使用说明)，其量足以进行至少一次检测。“包装的”指的是使用能够在固定范围内容纳本发明指示分子的固体基质或者材料例如玻璃、塑料(例如聚乙烯、聚丙烯或者聚碳酸酯)、纸、铝箔等等。因此，例如，包装可以是用于容纳毫克量本发明标记指示分子制剂的玻璃瓶，或者它可以是微量滴定板的孔，已经有效附着了微克量的本发明的标记指示分子，即连接在微量滴定板的孔中这样能够与配基结合。
“使用说明”通常包括描述试剂浓度或者至少一个检测方法参数(例如试剂以及要混合的样品的相对量、试剂/样品混合物的维持时间、温度、缓冲条件等等)的具体表述。
在多数实施方案中，本发明的诊断方法和系统包括作为指示分子一部分的标记或者指示方法，标记或指示方法能够传递含有指示分子与预选配基(即包含SEQ ID NO1-51的任何序列的多肽和/或其片段)复合的结合反应复合物形成的信号。这些标记自身在临床诊断化学中是众所周知的。
标记方法可以是与抗体或者抗原化学结合而不使其变性，形成荧光染料(染料)的荧光标记物质，荧光标记物质是有用的免疫荧光示踪剂。适宜的荧光标记物是荧光染料例如异氰酸荧光素(FIC)、异硫氰酸荧光素(FITC)、5-二甲基胺-1-萘磺酰氯(DANSC)、四甲基罗达明异硫氰酸酯(TRITC)、丽丝胺、罗达明8200磺酰氯(RB 200 SC)。适宜的荧光物质的其他示例包括伞形酮、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或者藻红素等等。在DeLuca，″Im-munofluorescence Analysis″，inAntibody As a Tool，Marchalonis，等人，，eds.，John Wiley &Sons，Ltd.，pp.189-231(1982)中可以找到对免疫荧光分析技术的描述。
放射性元素可用作标记物质。示例性的放射性标记物质是产生γ射线发射的放射性元素。自身发出γ射线的元素，例如124I、125I、128I、132I和51Cr代表了一类产生γ射线的放射性元素指示组。特别优选的是125I。另外一组有用的标记方法是例如11C，18F，15O和13N的元素，它们自身发射正电子或者β粒子例如111In或3H。其他适宜的放射性标记元素包括131I和35S。
在其他实施方案中，可以通过将抗体与另一个可被检测的物质例如酶、辅基、化学发光物质或者生物发光物质相偶联而有助于使用抗体的检测。适宜的酶的示例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、β半乳糖苷酶或者乙酰胆碱酯酶；适宜的辅基复合物的示例包括链亲和素/生物素和亲和素/生物素；化学发光物质的示例包括鲁米诺；生物发光物质的示例包括荧光素酶、荧光素和水母蛋白。
在优选的实施方案中，指示基团是酶，例如辣根过氧化物酶(HRP)或者葡萄糖氧化酶。在主要指示基团是例如HRP或者葡萄糖氧化酶的这些例子中，需要其他的试剂呈现指示分子/配基复合物(免疫反应物)已经形成的事实。这些用于HPR的其他试剂包括过氧化氢和氧化染料前体例如二氨基联苯胺。对于葡萄糖氧化酶有用的其他试剂是2，2′-氨基-二-(3-乙基-苯噻唑啉-G-磺酸)。
标记的连接(即多肽例如抗体的标记)在本领域内是众所周知的。例如，可以通过代谢掺入作为培养基组分提供的含有放射性同位素的氨基酸，对蛋白质进行标记。参见，例如Galfre等人，，Meth.Enzymol.，733-46(1981)。通过活化功能基团进行的蛋白质连接或者偶联技术是特别适用的。参见例如Aurameas，等人，，Scand.J.Immunol.，Vol.8Suppl.77-23(1978)，Rodwell等人，(1984)Biotech.3889-894，和美国专利No.4,493,795。
可以建立使用以上指示分子的各种不同的诊断检测，用于空肠弯曲杆菌样品的检测。示例性的检测在AntibodiesA LaboratoryManual，Harlow and Lane(eds.)，Cold Spring Harbof LabofatoryPress，1988中有详细描述。这种检测的代表性示例包括对流免疫电泳(CIEP)、放射性免疫检测、放射性免疫沉淀、酶联免疫吸附测定(ELISA)、斑点印迹检测、抑制或竞争检测以及三明治检测、免疫分析专用试管棒(纤维素试验纸)检测、同步免疫检测、免疫色谱检测、免疫过滤检测、橡胶珠凝集检测、免疫荧光检测、生物传感器检测以及弱光检测(还参见例如U.S.4,376,110和4,486,530)。
在一个实施方案中，本发明的诊断试剂盒可以用于“ELISA”形式中检测在流体样品中预选配基的量。“ELISA”指的是酶联免疫吸附测定，它使用结合在固相上的抗体或者抗原以及酶-抗原或者酶-抗体偶联物检测和定量样品中存在的抗原的量，可以容易地应用于本发明。因此，在一些实施方案中，本发明的指示分子可以附着于固相基质上形成固体支持物，固体支持物包含了所研究的诊断系统中的包装。试剂通常通过从含水介质中的吸附附着于固相基质上，尽管也可以使用对本领域技术人员众所周知的适用于多肽(例如抗体)的其他附着方式。有用的固相基质也是本领域内众所周知的。这些物质是水溶性的，包括可以从Pharmacia Fine Chemicals(Piscataway，N.J.)获得的商标为SEPHADEX的交联葡聚糖；琼脂糖；可以从AbbottLaboratories of North Chicago，III.获得的1微米到5毫米直径的聚苯乙烯小珠；基于聚氯乙烯、聚苯乙烯、交联聚丙烯酰胺、硝酸纤维素或者尼龙的网例如薄片、条、或者板；或者管、盘或者如由聚苯乙烯或者聚氯乙烯制成的微量滴定板的孔。
另外一种诊断方法可以利用本发明一个实施方案的抗体组合物的多价性以交联配基，这样使多个配基与多肽聚集，产生可沉淀的聚集物。该实施方案与众所周知的免疫沉淀方法相似。该实施方案包含的步骤是在结合条件下将样品与包含本发明抗体的组合物混合形成结合混合物之后通过分离步骤分离形成的结合复合物。通常通过离心或者过滤从混合物中取出聚集物，完成分离。结合复合物的存在表明存在预选的待测配基。
本发明的结合伴侣和多肽抑制剂本发明涉及的51个多肽的表面定位使这些多肽成为非常适宜的结合伴侣(例如抑制剂)的靶标。病原性微生物表面定位的多肽经常与宿主生物相互作用。因此，表面定位多肽的任何类型的结合伴侣可以干扰宿主-病原的相互作用。因此结合伴侣经常拮抗微生物的病原性(毒性)。结合伴侣还可以是与其结合的多肽的抑制剂。
因此，在另一个主要方面中，本发明涉及鉴别SEQ ID NO1-51提供的表面定位多肽的结合伴侣的方法。这些方法可以是生化的或者基于细胞的。
生化方法在一个主要方面，本发明涉及的是鉴别多肽的结合伴侣的方法，所述多肽选自SEQ ID NO1-36或者其片段，包括以下步骤a.提供选自SEQ ID NO1-36的多肽，或者其片段b.将所述多肽或者片段与推定的结合伴侣结合，以及c.测定所述的推定结合伴侣是否能够结合所述的多肽或者片段。
在优选的实施方案中，所述的推定结合伴侣是来自宿主的分子。
在该方法的优选实施方案中，多肽或者其片段被固定在固相支持物例如层析柱或者微量滴定板上提供，并且在接触步骤之后，测定推定的结合伴侣是否结合到固相支持物上。可以通过直接与固相支持物结合，或者通过间接结合(例如使用特异抗体)，进行多肽或者其片段的固定化。在优选的实施方案中，在接触步骤和测定步骤之间进行一个漂洗步骤，目的是提高检测的特异性。在其他优选的实施方案中，推定的结合伴侣与可检测的标记形成复合物。可以在进行接触之前对推定的伴侣进行标记。或者可以在接触步骤之后进行标记。此外，在该方法的一些实施方案中，固定化可以在多肽或者其片段与结合伴侣结合之后进行。在优选的实施方案中，该方法是筛选方法，其中对于大量推定的结合伴侣重复该方法。测定结合的适宜方法是本领域内众所周知的，在本发明的其他部分提及了这些方法中的一些。
在另一方面中，选自SEQ ID NO1-51(例如SEQ ID NO1-36的任何一个或者SEQ ID NO37-51的任何一个)的多肽，其宿主来源结合伴侣可以如下鉴别电泳分离纯化的宿主膜，印迹到膜上，与目标多肽或者其片段共同孵育。然后使用对于目标多肽或者其片段特异的抗体检测结合。接下来可以从印迹上洗脱并且使用质谱或任何其他本领域内已知的技术进行分析，确定多肽或者其片段已经与之结合的宿主的结合伴侣。
如果病原性生物的表面定位多肽之结合伴侣是宿主来源的分子，则这种表面定位多肽与宿主之间的相互作用对于细菌的毒性可能是重要的。因此干扰表面定位多肽与宿主来源的结合伴侣之间相互作用的化合物可能适于阻止或者治疗空肠弯曲杆菌的感染。因此，本发明另外的方法涉及鉴别SEQ ID NO1-51的任何一个(例如SEQ ID NO1-36的任何一个或者SEQ ID NO37-51的任何一个)表面定位空肠弯曲杆菌多肽与宿主来源的结合伴侣相互作用的抑制剂的方法，包括以下步骤a.提供SEQ ID NO1-51的任何多肽(例如SEQ ID NO1-36的任何一个或者SEQ ID NO37-51的任何一个)或者其片段，b.提供所述多肽的宿主来源的结合伴侣(根据以上的描述确定或者由任何其他方法确定)c.将所述多肽与所述宿主来源的结合伴侣在没有所述相互作用的推定抑制剂的情况下接触，
d.将所述多肽与所述宿主来源的结合伴侣在所述的推定抑制剂存在下接触，以及e.测定步骤d得到的所述多肽与所述宿主来源的结合伴侣的结合强度与步骤c得到的同样强度相比是否降低。
在一些实施方案中，步骤c和d可以在两个不同的样品容器中进行。在其他实施方案中，可以通过向步骤c的混合物中加入推定的抑制剂进行步骤d。在优选的实施方案中，对于大量的推定抑制剂重复该方法。
非常感兴趣的是抑制表面定位多肽活性的结合伴侣。这种活性可以是酶活性、转运活性或者任何类型的其他生化或细胞活性，优选为酶活性。
优选的宿主来源结合伴侣是宿主多肽和宿主脂类。可以根据Szymanski和Armstrong(1996)Infect.Immun.643467-3474的描述测定结合。
在以上描述的生化方法的优选实施方案中，结合伴侣和表面定位多肽或者其片段的结合具有的解离常数或Kd小于5×10-6M，例如小于10-6M，例如小于5×10-7M，例如小于10-7M，例如小于5×10-8M，例如小于10-8M，例如小于5×10-9M，例如小于10-9M，例如小于5×10-10M，例如小于10-10M，例如小于5×10-11M，例如小于10-11M，例如小于5×10-12M，例如小于10-12M。可以通过例如表面等离子体共振测定解离常数。
基于细胞的方法通过删除或者破坏其结构基因或者下调基因的表达(见下面)降低表面定位多肽的水平，可以影响细菌细胞。细胞可以变得对细胞毒性化合物更为敏感。特别对于表面定位多肽，它们水平的降低可能影响细胞表面部分例如外膜或者细胞壁阻止化合物进入细胞内的功能。这样，降低表面定位多肽的水平可以使细胞对多种不同的化合物变得更加“通透化”。
因此，本发明的一个方面涉及的是鉴别具有针对空肠弯曲杆菌抗菌活性的化合物的方法，包括以下步骤a.提供敏化细胞，敏化细胞具有降低水平的SEQ ID NO1-36的任何多肽，以及b.例如通过生长检测，测定所述细胞对推定抗菌化合物的敏感性。
优选地，该方法是筛选方法，其中对多个推定抗菌化合物重复该步骤。优选的推定抗菌化合物是不能穿过野生型空肠弯曲杆菌细胞外膜的化合物。
此外，本发明涉及鉴别具有针对空肠弯曲杆菌抗菌活性的化合物的方法，包括以下步骤a.提供敏化细胞，敏化细胞具有降低水平的SEQ ID NO37-51的任何多肽，以及b.例如通过生长检测，测定所述细胞对推定抗菌化合物的敏感性，其中的推定抗菌化合物不能穿过野生型空肠弯曲杆菌的细胞外膜。
优选地，该方法是筛选方法，其中对多个推定抗菌化合物重复该步骤。
该方法背后的理论基础是具有低水平表面定位多肽的细胞对细胞毒性化合物表现出增加的敏感性，这样可以确定具有低效力的抗菌化合物，在使用野生型细胞用于检测时这些化合物会被遗漏。通过这种方法确定的化合物经常需要被修饰以提高效力。这可以通过化学修饰进行。
对表面定位多肽活性的抑制可能影响细菌的生活力(即存活、生长和/或增殖)。特别有趣的是空肠弯曲杆菌生活力必需的表面定位多肽的抑制。可以根据WO 02/077183中的描述研究空肠弯曲杆菌基因的必需性。必需表面定位多肽的抑制剂可能不需要进入到细菌细胞内就能影响细胞的生活力。因此，与细胞内靶标的抑制剂相比，一般对作为有效抗菌物质的必需表面定位多肽的抑制剂提出的要求更少。
因此，本发明涉及鉴别多肽抑制剂的方法，所述多肽选自SEQ IDNO1-36，包括以下步骤a.提供两个细胞，它们的差异在于在SEQID NO1-36的任何多肽水平不同，b.例如通过生长检测，测定所述细胞对推定抑制剂的敏感性，以及c.测定所述的两个细胞是否在所述推定抑制剂存在下受到不同影响。
优选地，对多个推定抑制剂重复该方法。优选的抑制剂是不能穿过野生型空肠弯曲杆菌细胞外膜的化合物。
此外，本发明涉及鉴别多肽抑制剂的方法，所述多肽选自SEQ IDNO37-51，方法包含以下步骤a.提供两个细胞，它们的差异在于在SEQID NO37-51的任何多肽水平不同，b.例如通过生长检测，测定所述细胞对推定抑制剂的敏感性，其中的推定抗菌化合物不能穿过空肠弯曲杆菌细胞外膜，以及c.测定所述的两个细胞是否在所述推定抑制剂存在下受到不同影响。
优选地，对多个推定抑制剂重复该方法。
该方法背后的理论基础是具有低活性必需多肽的细胞，其生活力与具有更高水平该多肽的细胞的生活力相比，受到该多肽更多的影响。如果两个细胞受到不同的影响，这表明抑制剂作用于靶标或者至少作用于相同的生化途径。
在该方法的一些实施方案中，具有不同目标多肽活性的两个细胞是野生型细胞(或者其他具有野生型活性目标基因的细胞)和具有降低的目标多肽活性的敏化细胞。在一些实施方案中，在敏化细胞中不同或者降低的水平可能是目标基因不同或者降低的表达水平(导致多肽不同或者降低的拷贝数)。这可以通过将基因置于可调控的启动子的控制下，或者通过对抑制必需多肽的编码mRNA翻译的反义RNA进行可调控表达完成。在其他实施方案中，不同或者降低的活性可以是由于突变例如温度敏感突变导致的目标多肽不同或者降低的活性。
产生敏化细胞以及使用这些细胞用于筛选抑制剂的适宜方式已经在WO 02/077183中有描述。敏化细胞可以通过在一定浓度的诱导物或者阻遏物或者其他条件(这提供了细菌生活力所需的一定的基因产物水平，使得基因产物功能的存在或者不存在成为生活力的限速步骤)下培养条件表达的空肠弯曲杆菌突变株得到。用于空肠弯曲杆菌的可调控启动子已经在例如Kelana等人，(2003)J Food Prot 661190-1197和Dedieu等人，(2002)Appl Environ.Microbiol.684209-421中有描述。靶标基因的亚致死表达可以是使生长抑制至少大约10％，例如至少大约25％，例如至少大约50％，例如至少大约75％，例如至少大约90％，例如至少大约95％的表达。
在本发明基于细胞检测的另一个实施方案中，通过在多肽中使用突变(例如温度敏感突变)降低细菌生活力所需多肽的水平。将这种细胞生长于介于允许和限制温度之间的中间温度下，产生的细胞具有降低活性的基因产物。应当理解可以使用降低但是不去除细菌生活力所需基因产物的活性或水平的任何突变，实施以上的方法。该方法还可以与条件表达方法组合在一起。在这个组合的方法中，产生这样的细胞，其中在目标基因中有温度敏感突变，其中该基因是条件表达的。
当筛选必需多肽的抑制剂时，可以通过直接比较实验样品中的生长量与对照样品中的生长量，测定生长抑制，生长量通过培养物相对于未接种培养基的光密度测定。检测细胞增殖的其他方法包括测定绿色荧光蛋白(GFP)报告物构建体的荧光发射、各种不同的酶活性检测以及其他本领域内众所周知的方法。用于测定生活力的其他参数包括例如菌落形成单位。可以在固相、液相、上述两种介质的组合或者在体内进行以上方法。可以将多个化合物转移到琼脂平板中，使用自动化和半自动化的设备进行同时检测。
本发明的基于细胞的检测能够检测对目标靶标分子显示低效力或中等效力的化合物，因为这种化合物在敏化细胞上比在非敏化细胞上具有显著更高的效力。与非敏化细胞相比，在敏化细胞上检测时效果可以是检测的化合物可能具有两倍到数倍更高的效力，例如至少10倍更高的效力，例如至少20倍更高的效力，例如至少50倍更高的效力，例如至少100倍更高的效力，例如至少1000倍更高的效力。
过表达表面定位多肽的突变的空肠弯曲杆菌还可以用于鉴别抑制这种多肽的化合物。如果该化合物是细胞毒性的，靶标多肽的过表达可以使细胞更具抗性。因此，本发明还涉及寻找SEQ ID NO1-51(例如SEQ ID NO1-36的任何一个或者SEQ ID NO37-51的任何一个)表示的任何表面定位空肠弯曲杆菌多肽的抑制剂的方法，包含以下步骤a.提供两个细胞，它们的差异在于SEQ ID NO1-51(例如SEQID NO1-36的任何一个或者SEQ ID NO37-51的任何一个)的任何表面定位空肠弯曲杆菌多肽的活性不同，其中一个细胞含有大致野生型拷贝数目的所述多肽而另一个细胞含有高于野生型拷贝数目的所述多肽，b.例如通过生长检测，测定所述细胞对推定抑制剂的敏感性，以及c.测定所述的两个细胞是否在所述推定抑制剂的存在下受到不同影响。
可以使用强启动子或者引入多拷贝的表面定位多肽的结构基因获得过表达。强的空肠弯曲杆菌启动子在Wosten等人，(1998)J.Bacteriol.180594-599中已有描述。由于不是抑制剂细胞靶标的多肽的过表达也可以使细胞对某种抑制剂具有抗性，需要通过其他方式(例如生化检测)来证实目标靶标多肽被推定抑制剂的抑制。
除了表面定位多肽的生化或者其他细胞活性的抑制剂之外，以上描述的细胞方法可以例如通过干扰基因调控，用于确定降低靶标表达水平(从而确定其拷贝数)的化合物。
在用于寻找结合伴侣或者抑制剂的任何基于细胞的或生化方法的优选实施方案中，对于大量候选化合物重复该方法。
在另一个方面中，本发明涉及用于这里描述的基于细胞的方法中的突变体空肠弯曲杆菌，例如编码表面定位多肽的基因被置于异源可调控启动子控制下的菌株、携带表面定位多肽温度敏感等位基因的菌株，以及过表达表面定位多肽的菌株。
通过靶向表面定位多肽(例如SEQ ID NO1-36表示的任何多肽)干扰细菌生长的其他方法包括使用特异的反义分子(例如反义RNA或DNA)以及使用对必需的表面定位多肽编码mRNA特异的核酶分子，抑制基因表达。
实施例策略在项目中的实验步骤如下通过低pH洗脱分离表面蛋白。通过2-D凝胶和质谱进行分析。克隆到大肠杆菌表达载体中。制备重组蛋白，免疫小鼠，使用空肠弯曲杆菌攻击免疫的小鼠，寻找抵御疾病和肠内移殖的防范。还分析了大肠杆菌和沙门氏菌的表面定位(如果是阳性的，有用于减毒载体菌株的可能性)。
细菌培养空肠弯曲杆菌(C.j.)菌株ML53(血清型019)，是来自人粪便的临床分离物，由Karen Krogfeld(SSI)提供。按照常规37℃下在含10％CO2，5％O2的空气中生长于血液琼脂平板上。
表面蛋白的提取细菌在血液琼脂平板上生长过夜，收集到50mM Tris pH7.8中，6000g离心5分钟沉淀。沉淀重悬于0.2M甘氨酸pH2.2中，细菌悬液在室温下轻轻混合10分钟。6000g离心5分钟再次沉淀细菌，收集含有表面蛋白的上清，使用NaOH中和，冻存于-80℃。进行2-D凝胶电泳之前在Amersham Hi-Trap脱盐柱上对样品进行脱盐。
2-D凝胶电泳在Ettan Dalt 2系统(Amersham Biosciences)上或者在NovexNuPage系统(Invitrogen)上，根据凝胶系统提供的手册进行双向凝胶电泳。
简而言之第一相电泳在7cm或24cm的预灌注IPG凝胶条上进行(pH范围3-10或者6-11)，根据生产商的说明使用EttanIPGphor等电聚焦系统(Amersham Biosciences)。在以下的条件下进行等电聚焦7cm pH3-10凝胶条8000Vh，7cm pH6-11凝胶条16000Vh，24cm pH3-10凝胶条52000Vh。第二相使用预灌注的12.5％凝胶(Amersham Biosciences)，对24cm凝胶条在5W每胶的条件下进行15分钟电泳，然后在170W下进行电泳4-6小时。7cm凝胶条在Novex NuPage system(Invitrogen)中进行电泳，使用预灌注的4-12％凝胶(Invitrogen)在200伏特下电泳40分钟。根据最初在Mortz等人，(2001)Proteomics 1(11)，1359-1363中描述的方法的改进方法对凝胶进行银染。使用Amersham的Ettan Spot Picker，根据生产商的说明挑取用于质谱分析的蛋白斑点。
质谱挑取特异的蛋白斑点，置于Milli-Q水中。使用50mM NH4HCO3/50％乙醇漂洗这些凝胶块，然后在96％乙醇中孵育脱水。在还原溶液(10mMDTT，50mM NH4HCO3)中56C下孵育进行还原，然后在烷化溶液(55mM碘代乙酰胺，50mM NH4HCO3)中室温黑暗孵育进行烷化。然后进行两轮漂洗和脱水，之后加入5ul胰蛋白酶溶液(12.5ng/ul Promega胰蛋白酶，溶于50mM NH4HCO3，10％乙腈)。然后再加入碳酸氢钠溶液，消化在37℃下孵育过夜。向过夜消化物中加入三氟乙酸，振荡孵育。
提取物的一部分用于MALDI-TOF肽质谱指纹分析(Reflex IV，BrukerDaltonics，Germany)，在特异的空肠弯曲杆菌数据库中对所产生峰的列表进行数据库搜索。在数据库搜索中使用Mascot搜索程序和评分算法(Matrix Science，UK)。肽质耐受分别设置为60ppm和0.5Da。调整搜索参数，以包括Met的氧化、向Cys上加上氨甲酰甲基基团，使胰蛋白酶错过每个肽中一个切割位点。
在2003年11月21日提交的丹麦专利申请PA 200301726中的清单1以及2003年11月25日提交的美国暂时申请60/524,617中给出(这里引用作为参考)。使用该步骤确定了共51个不同的空肠弯曲杆菌蛋白。这些蛋白的全长序列在SEQ ID NO1-51中给出(参见图4)。序列列表中的蛋白质根据Sanger研究所的分类进行功能分类。根据基因组序列进行预测的但是以前没有表征、并且与以前表征过的蛋白没有任何同源性的所有蛋白根据Sanger研究所的分类，划分为假设蛋白。那些与已知蛋白有同源性的蛋白根据相对应的已知蛋白进行命名，使用前缀“可能的”或者“推定的”，这取决于同源性的程度。一些蛋白有小的基序，这样不能够给这些蛋白确切的生化/代谢功能，但是可以表明它们具有某种特性(例如核苷酸结合基序，膜结合位点等等)的事实。推定的周质蛋白质根据类似的基础进行分类--它们具有短的(4-6个氨基酸)N端基序，它可以介导向周质的转运。
生物信息学研究使用由来自DNAStar公司的Lasergene序列分析软件(Burland，TG(2000)Methods Mol.Biol.13271-91)确定的缺省参数进行抗原性指数研究。预测SEQ ID NO52-119中提供的序列是它们对应的全长多肽的特殊抗原性片段(参见图4)。
在大肠杆菌中的克隆和表达对应于目标蛋白的基因用PCR扩增并且克隆到含有his-标签(pET101，Invitrogen)的大肠杆菌表达载体中。产生的质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，使用0.5mM IPTG诱导蛋白的表达4小时。根据以上制备甘氨酸洗脱物，通过三种独立的方法分析洗脱物中重组空肠弯曲杆菌蛋白的存在考马斯亮蓝染色，使用抗his标签抗体进行Western印迹，以及质谱分析。对8个质粒(表达Cj0092，Cj0143c，Cj0420，Cj0715，Cj0772c，Cj1018c，Cj1380和Cj1643的质粒)进行表面定位检测。发现所有8个质粒都定位在大肠杆菌细胞表面。
根据以上描述培养和诱导的培养物中纯化重组蛋白，根据生产商的说明使用NTA-Ni琼脂糖(Qiagen)。纯化的蛋白对PBS进行透析，冻存于-80℃。
小鼠的免疫抗原剂量确定为了确定每个蛋白最佳的免疫剂量和疫苗接种时间，使用1，5，10和25微克每种蛋白免疫小鼠。溶解于PBS中的适量蛋白与100μg的明矾(Alhydrogel，Brenntag Biosector)混合，在室温下振荡30分钟，用于每只小鼠的注射。用PRS调整体积至0.5ml。小鼠皮下免疫3次(0，14，28天)。在第0天和每次免疫后的第7天(第7，21和35天)取血。在第7天时200微升所有血液样品取自从后眼窝血管丛，放置1小时使凝固，3500g离心10min，收集血清。
血液分析通过测定血液中的抗体滴度监测抗体应答。这通过Western印迹进行。血清用PBS/0.1％Tween从1∶100到1∶25600系列稀释。重组蛋白在制备型(2-D)(Invitrogen)凝胶上电泳，使膜上的1.5mm蛋白条带对应于100ng蛋白。使用具有1.5mm宽槽的Surf-Blot装置(IdeaScientific，Minneapolis，MN)进行Western印迹。使用血清稀释液作为第一抗体，碱性磷酸酯酶偶联的抗小鼠抗体(Sigma)作为第二抗体。用FastTab药片(Sigma)使印迹显色。在每只动物注射5，10和25微克抗原时，所有的抗原在血清稀释度12800和25600之间都可以被检测到。
针对攻击的免疫使用根据以上制备的25微克重组蛋白疫苗在第0、14和28天免疫小鼠。在第7、21和35天取血，根据以上进行检测。在最后一次加强免疫两周内没有用于攻击实验的小鼠在攻击前一周使用10微克重组蛋白再次进行加强免疫。
小鼠口服攻击空肠弯曲杆菌ML1和ML53(由Karen Krogfeld，SSI提供的临床分离物)在42℃下在血液琼脂平板上培养过夜。在攻击前一天，细菌收获到含有1％酵母提取物的脑心浸出物培养液中，稀释至OD600为0.05，获得起始培养物。25ml起始培养物接种于含有20mlBHI琼脂的75cm2摇瓶中，42C下孵育过夜。在攻击当天，6000g离心5分钟收获细菌，重悬于新鲜的BHI/YE培养液中使OD600为1(5×108到109菌落形成单位(cfu)/ml；通过将系列稀释涂布于BHI琼脂平板上测定每一批的实际cfu)。悬液保存在冰上直至用于攻击小鼠(通常在制备后3小时内)。
每个抗原6-8只免疫的小鼠口服2.5-5×108cfu的空肠弯曲杆菌(0.5ml根据以上制备的悬液)进行攻击。每天收集5个粪便颗粒(或者在ACE017实验中所有的粪便颗粒)，置于0.5ml(或者5ml)添加10％甘油的BHINE培养液中，-80℃冻存。
通过涂布于弯曲杆菌选择培养基中对移殖进行监测。粪便颗粒匀浆，调整体积至2(或12)ml，将250ul的匀浆物置于1.5ml BHINE培养液中，置于血液琼脂平板上。平板在42℃孵育2-3小时，150-250ul的液体涂布于Karmali琼脂平板上，然后将其在42℃孵育48小时。对平板评分如下如果观察到单层密集的菌苔则给1000分，如果在菌苔中无法区别分开的菌落则给100分，如果菌落数目小于100(在这种情况下对菌落进行计数)则给0-100分。每天对每个抗原的所有小鼠的评分进行平均。
染色筛选使用小鼠攻击实验筛选13个空肠弯曲杆菌菌株和1个大肠弯曲杆菌菌株中8个抗原的存在。对全细胞裂解物进行SDS凝胶电泳，Western印迹，使用来自免疫小鼠的血清。
结果如下面列出的，进行了包括不同抗原和对照组合的五个实验实验名称使用的抗原ACE003bCj0092，Cj0143c，Cj0420，Cj0772c，明矾ACE003cCj0715，Cj1018c，Cj1380，Cj1643，明矾铝ACE011a Cj0092，Cj0143c，Cj0420，Cj0772c，明矾铝ACE011b Cj0715，Cj1018c，Cj1380，Cj1643，明矾铝ACE017 Cj0092，Cj0143c，Cj0420，Cj0772c，Cj1018c，Cj1380，Cj1643，来自食纤维素梭杆菌(Clostridium cellulovorans)的纤维素结合结构域(CBP，Sigma Aldrich C8581)，空肠弯曲杆菌菌株ML1和ML53的甘氨酸洗脱物。
对来自实验ACE003b和ACE003c的小鼠血液的血液分析示例在
图1和2中表示。
攻击结果示于图3中。
对不同空肠弯曲杆菌菌株中抗原存在进行筛选的结果在表1中表示。
来自ML53(血清型019)菌株的ACE393的DNA测序来自菌株ML53的ACE393(SEQ ID NO120)的DNA测序显示了在翻译为蛋白质序列后的氨基酸水平上与NCBI中发表的序列有3个区别。
区别如下氨基酸序列位置70V(公开序列)与A(ML53菌株)氨基酸序列位置136A(公开序列)与T(ML53菌株)氨基酸序列位置168T(公开序列)与A(ML53菌株)
对来自用于最初动物效力研究的菌株ML53(019)的重组ACE393的蛋白质序列进行实验证实。分析包括MALDI-TOF测定的完整质量；1D凝胶分析；2D凝胶分析和2D胶Western印迹。数据(未显示)是基于最初的构建体，即序列包括C端的6个His标签和V5衔接物区域。在根据标准实验方案进行Ni-His纯化之后，使用ACE393进行所有的检测和分析。
对完整的ACE393分析观察到两个蛋白。这两个分子量与预测的N端截短形式(-21个氨基酸以及类似的具有额外的C端19个氨基酸截短的N端截短形式)的分子量完全匹配。1D SDS PAGE显示了两个斑点，一个较大，一个较小。这与来自完整MALDI-TOF分析的数据完全对应。来自这两个斑点的多肽作图数据没有显示任何差异，这很可能是由于过量上样的原因。在2D胶分析中斑点的数目表明混合物可能含有两种以上的组分。数据表明改变可能是由于SDS分子数目不同造成的电荷差异。使用小鼠抗体的Western印迹数据给出了相同的带型，与银染数据吻合。
天然和重组ACE 593的MALDI-TOF肽指纹分析天然形式在含有弯曲杆菌全细胞裂解物的4个不同2D胶中发现了天然形式的ACE393。这一确定是基于MALDI-TOF肽指纹分析，它的序列覆盖为40到55％。
对公共序列和内部发现的ACE393序列(ML53，019)搜索MALDI-TOF肽指纹分析的数据。内部序列给出另外两个肽131-143 DIVLDTEIGGVAK(SEQ ID NO121)166-190 FAASTSTITLSDDINLNIEVEANEK(SEQ ID NO122)(粗体的氨基酸是两个序列之间的差异)与公共序列相比含有最后一个修饰的肽(68-73；LDATIK(SEQ IDNO123))由于太小，不能被MALDI-TOF肽指纹分析发现。
重组形式对重组肽进行MALDI-TOF肽指纹分析显示了与天然蛋白分析中发现的修饰相同的两个修饰。其他多肽从衔接物-His序列确定。
高变区根据″The genome sequence of the food-borne pathogenCampylo-bacter jejuni reveals hypervariable sequences.Nature.2000 Feb 10；403(6770)665-8″中的描述检查靶标序列中可能的高变和同多聚区。在这些可变区中没有发现这里描述的靶标，这样这些靶标特别适宜作为疫苗候选者。
权利要求
1.一种用作药物的组合物，其包含-多肽，它包含选自SEQ ID NO1-51的序列的表面定位弯曲杆菌多肽，或者它包含所述序列的抗原性片段或变体，-包含所述多肽编码序列的多核苷酸，-包含所述多肽编码序列的表达载体，-包含所述多核苷酸或者所述表达载体的重组病毒或者重组细胞，或-能够与所述多肽结合的抗体。
2.权利要求1的组合物，其中组合物包含-多肽，它包含选自SEQ ID NO1-51的序列的多肽，或者它包含所述序列的抗原性片段或变体，-包含所述多肽编码序列的多核苷酸，-包含所述多肽编码序列的表达载体，或-包含所述多核苷酸或者所述表达载体的重组病毒或者重组细胞。
3.以上权利要求任何一项的组合物，其中的变体与所述序列具有至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％的序列一致性。
4.以上权利要求任何一项的组合物，其中的抗原性片段包含低于99％，例如低于75％，例如低于50％，例如低于25％，例如低于20％，例如低于15％，或者例如低于10％的全长所述序列。
5.以上权利要求任何一项的组合物，其中的抗原性片段包含少于70个的所述序列的连续氨基酸残基，例如少于50个，例如少于40个，例如少于30个，例如少于20个所述序列的连续氨基酸残基。
6.以上权利要求任何一项的组合物，其中的抗原性片段包含6个或者更多，例如7个或者更多，例如8个或者更多，例如9个或者更多，例如10个或者更多的所述序列的连续氨基酸残基。
7.以上权利要求任何一项的组合物，其中的抗原性片段包含选自SEQ ID NO52-119的片段中一个或多个氨基酸残基，例如两个或者更多连续的，例如三个或者更多连续的，例如四个或者更多连续的，例如五个或者更多连续的，例如六个或者更多选自SEQ ID NO52-119片段的连续氨基酸残基。
8.以上权利要求任何一项的组合物，其中的多肽包含标签，例如组氨酸标签。
9.以上权利要求任何一项的组合物，其中的重组细胞是减毒或毒性降低的大肠杆菌细胞或者减毒或毒性降低的沙门氏菌细胞。
10.以上权利要求任何一项的组合物，其中的重组细胞是活的。
11.以上权利要求任何一项的组合物，其中的重组细胞是死的。
12.权利要求2-11任何一项的组合物，其中的药物是疫苗。
13.权利要求12的组合物，其中的组合物包含免疫原性载体，例如载体蛋白，其中的免疫原性载体优选与所述多肽结合。
14.权利要求12-13任何一项的组合物，其中的组合物包含佐剂。
15.权利要求1的组合物，其中的组合物包含能够与选自SEQ ID NO1-36的多肽结合的抗体。
16.权利要求15的组合物，其中的抗体还能够与完整的空肠弯曲杆菌细胞结合。
17.权利要求1的组合物，其中的组合物包含能够与多肽结合以及能够与完整的空肠弯曲杆菌细胞结合的抗体，所述多肽选自SEQ ID NO37-51。
18.权利要求15到17任何一项的组合物，其中的抗体是多克隆的。
19.权利要求15到17任何一项的组合物，其中的抗体是单克隆的。
20.权利要求15到19任何一项的组合物，其中的抗体是人抗体或者人化抗体。
21.权利要求15到20任何一项的组合物，其中的抗体是抗体结合片段。
22.权利要求15到21任何一项的组合物，其中的抗体具有的解离常数或者Kd小于5×10-6M，例如小于10-6M，例如小于5×10-7M，例如小于10-7M，例如小于5×10-8M，例如小于10-8M，例如小于5×10-9M，例如小于10-9M，例如小于5×10-10M，例如小于10-10M，例如小于5×10-11M，例如小于10-11M，例如小于5×10-12M，例如小于10-12M，例如小于5×10-13M，例如小于10-13M，例如小于5×10-14M，例如小于10-14M，例如小于5×10-15M，或者小于10-15M。
23.以上权利要求任何一项的组合物，其中的组合物包含药物上可以接受的载体。
24.以上权利要求任何一项的组合物，其中的组合物适宜全身给药。
25.以上权利要求任何一项的组合物，其中的组合物适宜静脉内、肌肉内或者皮下给药。
26.以上权利要求任何一项的组合物，其中的组合物适宜口服给药。
27.以上权利要求任何一项的组合物，其中的组合物适宜鼻内给药。
28.能够结合选自SEQ ID NO1-36的多肽的抗体。
29.权利要求28的抗体，其中抗体还能够与完整的空肠弯曲杆菌细胞结合。
30.能够与选自SEQ ID NO37-51的多肽结合以及能够与完整的空肠弯曲杆菌细胞结合的抗体。
31.权利要求28到30任何一项的抗体，包含权利要求18到22任何一项的特性。
32.使用包含多肽编码序列的多核苷酸转化或者转染的重组细胞，所述多肽包含选自SEQ ID NO1-36的序列，或者包含所述序列的抗原性片段或者变体。
33.权利要求32的重组细胞，其中的重组宿主细胞是大肠杆菌或者沙门氏菌细胞。
34.权利要求32或33的重组细胞，其中的重组细胞是减毒或毒性降低的细胞。
35.使用包含多肽编码序列的多核苷酸转化或者转染的减毒或毒性降低的大肠杆菌细胞或者减毒或毒性降低的沙门氏菌细胞，所述多肽包含选自SEQ ID NO37-51的序列，或者包含所述序列的抗原性片段或者变体。
36.-多肽，它包含选自SEQ ID NO1-51的序列，或者它包含所述序列的抗原性片段或变体，-包含所述多肽编码序列的多核苷酸，-包含所述多肽编码序列的表达载体，或-包含所述多核苷酸或者所述表达载体的重组病毒或者重组细胞，用于制备药物以免疫动物或人抵抗弯曲杆菌，优选为弯曲杆菌的感染的用途。
37.权利要求36的用途，其中的免疫诱导保护性免疫应答。
38.权利要求36或37的用途，其中的药物是适宜胃肠道外、静脉内、肌肉内、皮下、口服或者鼻内给药的药物。
39.能够与选自SEQ ID NO1-51的多肽结合的抗体，优选是如权利要求28到31任何一项明确的抗体，用于制备药物用于治疗或预防动物或人弯曲杆菌，优选为弯曲杆菌，的感染的用途。
40.在非人的动物中产生抗多肽抗体的方法，所述多肽选自SEQ IDNO1-36，包括以下步骤a.提供-多肽，它包含选自SEQ ID NO1-36的序列，或者它包含所述序列的抗原性片段或变体，-包含所述多肽编码序列的多核苷酸，-包含所述多肽编码序列的表达载体，或-包含所述多核苷酸或者所述表达载体的重组病毒或者重组细胞，b.将包含所述多肽、多核苷酸、载体、重组病毒或重组细胞的组合物引入所述动物中，c.在所述动物中产生抗体，以及d.分离抗体以及任选地，纯化抗体。
41.在非人的动物中产生抗多肽抗体的方法，所述多肽选自SEQ IDNO37-51，其中的抗体能够结合完整的空肠弯曲杆菌细胞，包括以下步骤a.提供-多肽，它包含选自SEQ ID NO37-51的序列，或者它包含所述序列的抗原性片段或变体，-包含所述多肽编码序列的多核苷酸，-包含所述多肽编码序列的表达载体，或-包含所述多核苷酸或者所述表达载体的重组病毒或者重组细胞，b.将包含所述多肽、多核苷酸、载体、重组病毒或重组细胞的组合物引入所述动物中，c.在所述动物中制备抗体，d.分离抗体以及任选地纯化抗体，以及e.筛选能够结合完整空肠弯曲杆菌细胞的抗体。
42.权利要求40或41的方法，其中的动物是能够产生人抗体的转基因动物。
43.在样品中检测空肠弯曲杆菌或者其部分的方法，包括以下步骤a.将所述样品与指示分子接触，所述指示分子能够与选自SEQ ID NO1-36的多肽特异结合，以及b.确定指示分子是否产生了信号，从而检测所述样品是否含有空肠弯曲杆菌或者其部分。
44.权利要求43的方法，其中的指示分子还能够结合完整的空肠弯曲杆菌细胞。
45.检测样品中弯曲杆菌的方法，包括以下步骤a.将所述样品与指示分子接触，所述指示分子能够与选自SEQ IDNO37-51的多肽特异结合，其中指示分子还能够与完整的空肠弯曲杆菌细胞特异结合，以及b.确定指示分子是否产生了信号，这样检测所述样品是否含有空肠弯曲杆菌或者其部分。
46.权利要求43到45任何一项的方法，其中所述的指示分子不穿过空肠弯曲杆菌细胞的外膜。
47.权利要求43到46任何一项的方法，其中所述的指示分子由抗体组成或者包含抗体，例如权利要求28到31的任何一项中明确的抗体。
48.鉴别多肽的结合伴侣的方法，所述多肽选自SEQ ID NO1-36或者其片段，包括以下步骤a.提供选自SEQ ID NO1-36或者其片段的多肽，b.将所述多肽或者片段与推定的结合伴侣接触，以及c.测定所述的推定结合伴侣是否能够结合所述的多肽或者片段。
49.鉴别具有针对空肠弯曲杆菌抗菌活性的化合物的方法，包括以下步骤a.提供敏化细胞，敏化细胞具有降低水平的选自SEQ ID NO1-36的任何多肽，以及b.例如通过生长检测，测定所述细胞对推定抗菌化合物的敏感性。
50.鉴别具有针对空肠弯曲杆菌抗菌活性的化合物的方法，包括以下步骤a.提供敏化细胞，敏化细胞具有降低水平的选自SEQ ID NO37-51的任何多肽，以及b.例如通过生长检测，测定所述细胞对推定抗菌化合物的敏感性，其中的推定抗菌化合物不能穿过野生型空肠弯曲杆菌细胞外膜。
51.鉴别多肽抑制剂的方法，所述多肽选自SEQ ID NO1-36，包括以下步骤a.提供两个多肽水平有差异的细胞，所述多肽选自SEQ ID NO1-36的任何多肽，b.例如通过生长检测，测定所述细胞对推定抑制剂的敏感性，以及c.测定所述的两个细胞是否在所述推定抑制剂存在下受到不同影响。
52.权利要求51的方法，其中的推定抑制剂不穿过空肠弯曲杆菌细胞的外膜。
53.鉴别多肽抑制剂的方法，所述多肽选自SEQ ID NO37-51组成的组，包括以下步骤a.提供两个多肽水平有差异的细胞，多肽选自SEQ ID NO37-51的任何多肽，b.例如通过生长检测，测定所述细胞对推定抑制剂的敏感性，其中的推定抑制剂不能穿过空肠弯曲杆菌细胞外膜，以及c.测定所述的两个细胞是否在所述推定抑制剂存在下受到不同影响。
全文摘要
本发明涉及空肠弯曲杆菌的表面定位多肽及其在针对弯曲杆菌疫苗接种中的用途。本发明还涉及多核苷酸、表达载体、表达这些表面定位多肽的重组病毒或者重组细胞在疫苗接种中的用途。此外，本发明涉及针对表面定位多肽的抗体的用途，用于抗弯曲杆菌治疗。最后，公开了通过表面定位多肽检测弯曲杆菌以及确定抗弯曲杆菌物质的方法。
文档编号G01N33/569GK1906210SQ200480039712
公开日2007年1月31日 申请日期2004年11月19日 优先权日2003年11月21日
发明者P·斯彻罗特兹-金, C·J·斯卡鲁普, N·P·耐伯格, T·A·布罗科霍瓦 申请人:Ace生物科学公司