类产碱假单胞菌株及其在制备西他列汀中间体中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种类产碱假单胞菌株及其在制备西他 列汀中间体中的应用。
【背景技术】
[0002] 磷酸西他列汀（sitagliptinphosphate)是默沙东公司第一个研制的用于治疗2 型糖尿病的二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制剂，该药能有效地针对2型糖尿病中的胰岛素抵抗 和胰岛α、β细胞的功能障碍，通过抑制DPP-4减缓肠促胰岛素GLP-1的降解，从而发挥降 糖作用。与易导致低血糖、体重增加和引起恶心呕吐等副作用的传统口服降糖药物相比，该 抑制剂具有明显的优势和良好的市场前景。磷酸西他列汀关键的手性中间体主要有两个， 一个是手性β-氨基酸，一个是其相应的手性醇中间体，目前关于西他列汀的合成工作重 点主要围绕这两个手性中间体展开。
[0003]目前文献报道此手性β-氨基酸的合成方法主要有以下几种：
[0004] ( -）采用手性源诱导出手性的α-氨基酸，而后经重氮化反应产生β-氨基酸， 从而构建手性中心，该路线所用原料较为昂贵，反应条件相当苛刻，如需要_78°C及-30Γ 等低温条件，且有些反应所需时间较长且操作较为繁琐，中间产物的精制需要经过柱层析 分离；
[0005] (二）采用手性磷钌催化剂对酮酯进行不对称催化氢化，构建手性二级醇，然后将 手性二级醇手性反转为二级胺，该路线中手性催化剂价格昂贵，放大效应明显；
[0006] (三）β-烯氨基酸中间体的不对称氢化，不对称氢化反应在昂贵的金属催化剂如 与手性膦/二膦配体相组合的铑的存在下进行或是使用昂贵的钌金属催化剂；
[0007] (四）以异丙胺为氨供体，以西他列汀前体酮为氨受体，利用转氨酶生物催化制备 西他列汀，该方法具有环境友好，反应条件温和等优势，但特殊酶的不易获得和价格的高昂 特性（分离方案等）不可忽视；
[0008] (五）以三氟苯甲醛和Ν-乙酰甘氨酸经缩合、还原、生物酶拆分、水解、保护氨基、 重氮化、Arndt-Fistert重排反应、水解得R-β-氨基丁酸，但是所述合成路线过长，手性拆 分获得手性氨基酸的收率不超过50%，另外一半对映异构体的循环利用是一大难题，且反 应过程用到重氮甲烷，重氮甲烷室温下是不稳定的有毒气体，具有爆炸性，操作危险。
[0009] 而目前文献报道相应的手性醇中间体的合成方法主要如下：
[0010] (一）W0 09/045507利用适当的羰基还原酶对β-羰基部分进行不对称还原得到 β-羟基中间体，再与氮杂环丁酮中间体反应得到西他列汀，该方法的缺点在于：在高压下 反应、使用非常昂贵的金属手性催化剂（Rh或Ru)、低立体选择性和铑污染产物以及由此引 起的最终化合物很难纯化；
[0011] (二）W012/046254公开制备通过酶促转化制备西他列汀的中间体的方法，提供了 两种生物催化合成手性醇中间体的方法，分别为利用工程菌全细胞和工程菌所产的羰基还 原酶的粗提物作为生物催化剂，将西他列汀前体酮还原为相应的（S)构型的醇；其方法具 有环境友好，反应条件温和，ee值高等优势，但在另一方面，工程菌的构建有很大的难度而 且花费昂贵，使用粗提酶作为生物催化剂存在的问题是游离的粗酶在反应液中不稳定，酶 的催化能力较低，酶容易失活，不易实现酶的循环使用，且后期的分离操作复杂；而使用整 细胞作为催化剂，将底物溶于甲苯中进行两相催化反应所存在的问题是，底物在甲苯中溶 解度小，反应所转化的底物浓度较低，不适合大规模工业化生产。
[0012] 现有的化学法和生物催化法合成西他列汀以及中间体的方法都存在其不足之处， 因此，开发更清洁的环境友好的制备西他列汀的中间体的方法是非常有意义的。
【发明内容】
[0013] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种类产碱假单胞菌株，并提供了该菌株的用 途，通过该菌株菌体的生物催化能够更经济地获得西他列汀中间体。
[0014] 本发明以4-氧-4-[3-(三氟甲基）-5,6-二氢[1，2,4]三唑并[4,3-a]_吡 嗪-7(8!1)-基]-1-(2,4,5)-三氟苯基）丁-2-酮（11)为原料，利用微生物中的羰基还 原酶，区域选择性和对映选择性催化还原为（S)-3-羟基-1-[3-(三氟甲基）-5, 6-二氢 [1，2, 4]三唑并[4, 3-a]吡嗪-7 (8H)-基]-1-(2, 4, 5-三氟苯基）丁-1-酮（I)。
[0015] 本发明技术路线如下：
[0016]
[0017] 本发明采取的技术方案如下：
[0018] 1、类产喊假单胞菌（Pseudomonaspseudoalcaligenes)XW_40,由中国典型培养物 保藏中心保藏，保藏号为CCTCCNO:M2015521。
[0019] 2、上述类产碱假单胞菌XW-40在制备西他列汀中间体中的应用。
[0020] 优选的，以类产碱假单胞菌XW-40菌体作为催化剂，将原料4-氧-4-[3-(三氟 甲基）-5,6_ 二氢[1，2,4]三唑并[4,3-&]-吡嗪-7(8!1)-基]-1-(2,4,5)-三氟苯基） 丁-2-酮催化还原为（S)-3-羟基-1-[3-(三氟甲基）-5,6-二氢[1，2,4]三唑并[4,3-a] 吡嗪-7 (8H)-基]-1- (2, 4, 5-三氟苯基）丁 -1-酮。
[0021] 优选的，所述反应体系中还包括辅酶再生底物和有机助溶剂。
[0022] 优选的，所述催化剂类产碱假单胞菌XW-40菌体经过重新收集，洗涤后用于下一 批次西他列汀中间体的制备。
[0023] 优选的，所述类产碱假单胞菌XW-40菌体浓度为90g(干重）/L，原料浓度为10g/ L，辅酶再生底物为质量分数5 %的葡萄糖，有机助溶剂为体积分数10 %的二甲基亚砜，反 应时间为28小时。
[0024] 本发明的有益效果在于：（1)筛选的产羰基还原酶菌株Pseudomonas pseudoalcaligenesXW-40具有高度的区域选择性和对映选择性，能够有 效催化4-氧-4-[3-(三氟甲基）-5,6-二氢[1，2,4]三唑并[4,3-a]_吡 嗪-7 (8H)-基]-1-(2, 4, 5)-三氟苯基）丁 -2-酮（II)还原为西他列汀手性 中间体（S)-3-羟基-1-[3-(三氟甲基）-5, 6-二氢[1，2, 4]三唑并[4, 3-a]吡 嗪-7 (8H)-基]-1- (2, 4, 5-三氟苯基）丁 -1-酮（I)，无副产物产生，简化了分离过程；（2) 对于土壤中菌株的筛选，选择与底物（II)结构相似的苯乙酮为唯一的碳源进行菌株的筛 选，可以快速地从众多种土壤中快速的筛选出合适的疑似初筛菌株，再将其用于（II)的还 原，快速的选择出最佳的菌株；（3)所筛选的菌株PseudomonaspseudoalcaligenesXW-40 在最适的反应条件下能耐受l〇g/L的高底物浓度，并且仍保持高选择性，底物抑制作用较 弱，从而可实现高底物浓度的生物催化，这一点对于目前所报道的利用野生细菌进行生物 还原来说相对少见；（4)PseudomonaspseudoalcaligenesXW-40菌体能够循环使用，待一 批反应结束后将菌体离心，可重新投入下一批次的催化反应中，与分批补料相比，同时去除 了底物与产物对细胞的抑制作用，使菌体的催化活性达到最大限度的利用，同一批菌体可 循环使用5次，收率和光学纯度高，过程绿色，成本低廉。
[0025] 菌种保藏
[0026] 本发明中类产喊假单胞菌（Pseudomonaspseudoalcaligenes)XW-40是从土壤中 分离获得，送中国典型培养物保藏中心（CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCCN0:M2015521，地 址位于湖北省武汉市武汉大学，保藏日期为2015年9月10日，分类命名为类产碱假单胞菌 Pseudomonaspseudoalcaligenes。菌落在固体培养基的形态为表面形态扁平，圆形，边缘 部分光滑整齐，整个菌落呈潮湿状，颜色呈乳白色，不透明，菌落直径约为1. 9mm，生理学性 质见表2。经16SrDNA分子生物学鉴定为类产碱假单胞菌，同源性达100%。
【具体实施方式】
[0027] 下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
[0028] 实施例1土壤菌株的初筛
[0029] 称取约lg土壤样品于10ml无菌水中，振荡混勾后离心，吸取上清液1ml加入到 100ml以苯乙酮为唯一碳源的最小盐培养基中，30°C培养5-7天。然后将培养的菌悬液涂布 至以苯乙酮为唯一碳源的最小盐琼脂培养基中，将平板上长出来的菌落分离纯化接种于琼 脂斜面上（培养基组成：蛋白胨5g/L，酵母膏1. 5g/L，葡萄糖10g/L，牛肉膏1. 5g/L，NaCl 5g/L，pH7. 0)，30°C培养48h，作为进一步筛选的疑似菌株，编号保存。
[0030] 实施例2产羰基还原酶菌株的筛选
[0031] 将实施例1分离纯化得到的菌种接种于组成为蛋白胨5g/L，酵母膏1. 5g/L、葡萄 糖 10g/L，牛肉膏L5g/L，NaCl5g/L，pH7. 0 的培养基中，30°C培养 48h，4°C下 7000rpm/min 离心10min，收集菌体，用冷生理盐水洗涤两次，得细胞湿菌体。
[0032] 采用如下菌株筛选体系进行筛选：lg/L底物（II)，质量分数5%的葡萄糖，10% (v/v)无水乙醇，80g/L菌体（干重），0· 1M的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液，ρΗ7· 0, 30°C 下搅拌反应12h，离心，上清液用乙酸乙酯萃取3次，有机层合并，无水硫酸镁干燥过夜，反 相C1S液相色谱以及手性液相色谱测定转化率和对映体过量（ee)。
[0033] 液相色谱条件为：检测转化率时色谱柱C1S(250X4. 6mmX5μm，Agilent America)，流动相：水 / 乙腈（v/v) = 70/30，流速lml/min，检测波长：268nm， 温度：25°C;4_ 氧-4-[3-(三氟甲基）-5, 6-二氢[1，2, 4]三唑并[4, 3-a]_ 吡 嗪-7 (8H)-基]-1- (2, 4, 5)-三氟苯基）丁 -2-酮及3-羟基-1- [3-(三氟甲基）-5, 6-二氢 [1，2, 4]三唑并[4, 3-a]吡嗪-7 (8H)-基]-1-(2, 4, 5-三氟苯基）丁 -1-酮的保留时间分 别为19. 7和26. 8min;检测ee时色谱柱ChiracelAY-H(5X250mm)，流动相：正己烷/无水 乙醇（v/v) = 85 :15,流速：1.Oml/min，检测波长：268nm，温度：25°C;在化学合成外消旋醇 3-羟基-1-[3-(三氟甲基）-5,6_二氢[1，2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)_基]-1-(2,4， 5_三氟苯基）丁-1-酮的分析中，S和R异构体的保留时间分别为11.3min以及17. 8min。 采用相同方法确定制备醇产物的手性构型，将转化率大于5%的菌株的结果表述于表1中，
[0034] 表1产羰基还原酶菌株的筛选
[0035]
[0036] 由表1可知，对映体过量（ee)最高以及转化率最好的为编号40-1的菌株，观察了 40-1号菌落在固体培养基的形态为表面形态扁平，圆形，边缘部分光滑整齐，整个菌落呈潮 湿状，颜色呈乳白色，不透明，菌落直径约为1.9mm，生理学性质见表2。经16SrDNA分子 生物学鉴定为类产碱假单胞菌，同源性达100%，命名为Pseudomonaspseudoalcaligenes XW-40,其DNA序列见SEQIDNo. 1。
[0037]表140-1菌株生理生化性质
[0040]实施例3产物⑴制备
[0041]利用PseudomonaspseudoalcaligenesXW-40 细菌制备（S)_3_ 羟基-1-[3_(三 氟甲基）-5,6_二氢[1，2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)_基]-l-(2,4,5-三氟苯基） 丁 -1-酮（I)。取5ml种子液转接至100ml新鲜的培养基中（250ml容量的摇瓶）（培养基 组分以及培养条件见实施例2)，在30°C下，190转/分钟震荡培养48小时，4°C下，7000转 /分钟条件下离心10分钟，