一种根瘤菌及其用图
【专利说明】一种根瘤菌及其用途 【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域。更具体地，本发明涉及一种根瘤菌，还涉及所述根瘤菌 的用途。 【【背景技术】】
[0002] 根瘤菌可以与豆科植物结瘤共生固氮，根瘤菌通过固定空气中的氮气转化为氨， 从而为豆科植物提供氮素营养，而豆科植物为根瘤菌提供养分，两者形成共生体系。由于根 瘤菌对豆科植物的侵染具有专一性和有效性，因此需要选育适合豆科植物的根瘤菌才能达 到共生效果。接种根瘤菌是国际上公认的生物固氮技术，生物固氮不会对环境造成任何污 染，同时改善土壤，促进植物生长，是可持续农业发展的重要措施。
[0003] 降香黄檀为豆科植物，是国家二级重点保护野生植物，其木材木质坚硬，纹理漂 亮，是制作古典硬木家具的上乘材料，其根部心材和树干心材能代降香，供药用，为良好的 镇痛剂。另外，在福建、贵州等地还可作为绿化树。多年来我国林业部门在研究"降香黄檀" 的育苗工作中投入了大量的人力、物力、财力，虽得以成功，但成活率较低，通过使用根瘤菌 剂可以与降香黄檀形成共生固氮体系，提高降香黄檀的成活率并促进植株长势，对今后降 香黄檀的人工种植栽培具有重要意义。 【
【发明内容】
】
[0004] [要解决的技术问题]
[0005] 本发明的目的是提供一种根瘤菌（Rhizobiumsp. )LX-JX01。
[0006] 本发明的另一个目的是提供所述根瘤菌菌剂的制备方法。
[0007] 本发明的另一个目的是提供所述根瘤菌菌剂的用途。
[0008] [技术方案]
[0009] 本发明是通过下述技术方案实现的。
[0010] 本发明涉及一种根瘤菌（Rhizobiumsp.)LX-JX01，该菌株已于2015年8月21日 在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCCNo. 11265。
[0011] 本发明还涉及一种根瘤菌LX-JX01菌剂制备方法。
[0012] 该制备方法的步骤如下：
[0013] A、液体DM培养基制备
[0014] 将1~3克酵母膏、8~12克蔗糖、1~3克硝酸钾、0.4~0.6克磷酸氢二钾、 0. 4~0. 6克磷酸二氢钾与0. 1~0. 2克氯化钠溶于蒸馏水中，并用蒸馏水定容到1000ml; 再使用无机酸或无机碱将其溶液的pH值调节至6. 8~7. 2,得到所述的液体DM培养基；
[0015] B、固体DM培养基制备
[0016] 按照每升液体DM培养基为18~20克琼脂，往步骤A制备得到的液体DM培养基 加入琼脂，加热至l〇〇°C使其琼脂溶解，然后在温度40°C下进行冷却使其DM培养基成为固 体状态，于是得到所述的固体DM培养基；
[0017] C、菌株活化
[0018] 将保存于温度4°C冰箱中在固体DM培养基斜面上的菌株CGMCCNo. 11265转接到新 鲜配制的固体DM培养基平板上，划线出单菌落，然后在温度4°C的冰箱中保存待用；
[0019] D、根瘤菌培养
[0020] 用灭菌接种环从步骤C的固体DM培养基平板上挑取两环单菌落，接种到150ml灭 菌液体DM培养基中，在摇床中在温度26~30°C与转速160~200转/分钟的条件下振荡 培养70~75小时，通过常规镜检确定无杂菌便得到所述的液体根瘤菌菌剂。
[0021] 根据本发明的一种优选实施方式，所述的无机酸选自硫酸、盐酸或磷酸；所述的无 机碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠或碳酸氢钠。
[0022] 根据本发明的另一种优选实施方式，所述的液体DM培养基是由1. 8~2. 2克酵母 膏、9~11克蔗糖、1. 8~2. 2克硝酸钾、0. 45~0. 55克磷酸氢二钾、0. 45~0. 55克磷酸 二氢钾与0. 14~0. 16克氯化钠制备得到的。
[0023] 根据本发明的另一种优选实施方式，所述的液体DM培养基是由2克酵母膏、10克 蔗糖、2克硝酸钾、0. 5克磷酸氢二钾、0. 5克磷酸二氢钾与0. 15克氯化钠制备得到的。
[0024] 本发明还涉及采用所述制备方法制备得到的根瘤菌LX-JX01菌剂。
[0025] 本发明还涉及所述的根瘤菌LX-JX01菌剂在促进降香黄檀生长中的用途。
[0026] 本发明还涉及所述的根瘤菌LX-JX01菌剂在降香黄檀育苗中的用途。
[0027] 下面将更详细地描述本发明。
[0028] 本发明涉及一种根瘤菌（Rhizobiumsp.)LX-JX01，该菌株已于2015年8月21日 在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCCNo. 11265。
[0029] 本发明人于2010年5月从广西凭祥市中国林科院热林中心苗圃中采集了黄壤土 样品，从中分离得到一株降香黄檀根瘤菌。
[0030] -、根瘤菌的获得
[0031] 将常规表面消毒的降香黄檀种子经过浸泡、晾干处理后种植到所述的黄壤土中， 在60天后植株结瘤固氮。将根瘤取下，采用常规方法进行表面消毒，然后使用常规根瘤菌 分离培养基（文献：许月蓉，"分离根瘤菌用的选择培养基"，《土壤》、1988年03期）采用稀 释涂布方法从中分离得到根瘤菌。经平板纯化与后续的发酵培养鉴定、回接结瘤验证，确定 将一株在固体分离培养基上生长的菌株命名为LX-JX01，该菌株与降香黄檀有共生结瘤固 氮的作用，初步确定该菌株是降香黄檀根瘤菌。
[0032] 二、根瘤菌的鉴定
[0033] 1、常规镜检
[0034] 分离得到的降香黄檀根瘤菌经过革兰氏染色法染色结果为阴性。在通常甘露醇固 体平板培养基中在恒温28 °C的条件下培养7天，可长出肉眼可见的直径约2_表面光滑、边 缘整齐的白色圆形菌落；在摇瓶中在所述的液体DM培养基中培养3d，采用常规镜检，其形 态一头空心不着色，其它部分是着色均匀的浅粉色，根据形态特征和习性可以确定它属于 慢生型根瘤菌。
[0035] 2、1防rDNA序列测定：
[0036] 将分离得到的降香黄檀根瘤菌送到北京三博远志生物技术有限责任公司进行测 序。经过比对，所鉴定的菌株与大豆根瘤菌的相似度为98%，所以断定这个菌株为根瘤菌 属。
[0037] 根瘤菌CGMCCNo. 11265菌株16SrRNA基因序列测定结果见附录1。
[0038] 所鉴定的菌株与大豆根瘤菌（Rhizobiumjaponicum)同源性最高。
[0039] 3、生理生化鉴定
[0040] ①牛肉膏-蛋白胨检测
[0041] 将根瘤菌LX-JX01菌株接种到牛肉膏-蛋白胨培养基中在恒温箱中在温度28 °C下 培养5天。培养液澄清，菌体未见生长，与未接种菌株的对照相同，这表明该菌株不能在牛 肉霄-蛋白胨培养基上生长。
[0042] 牛肉膏-蛋白胨培养基组成如下：5g牛肉膏、10g蛋白胨、5g氯化钠、1000ml蒸馏 水，ρΗ7· 2。
[0043] 在这个步骤以及后续步骤所使用的恒温培养箱是目前市场上销售的产品。
[0044] ②ΒΤΒ反应
[0045] 将根瘤菌LX-JX01菌株在ΒΤΒ平板上在恒温箱中在温度28°C下培养7天。平板颜 色变蓝，说明该菌株在BTB平板上产碱，属于慢生型菌株。
[0046] BTB反应培养基组成如下：10g甘露醇、0· 8g酵母浸膏粉、0· 25g磷酸氢二钾、0· 25g 磷酸二氢钾、〇.2g硫酸镁、0.lg氯化钠、15-20g琼脂、1000ml蒸馏水，lml以重量计0.25% 溴麝香草酚蓝，PH6. 8-7. 0。
[0047] ③石蕊牛奶反应
[0048] 将根瘤菌LX-JX-01菌株接种到石蕊牛奶培养基中，在温度28°C下培养7天，培养 基颜色变蓝，并形成乳清环，表明该菌株产碱，属于慢生型菌株。
[0049] 石蕊牛奶培养基组成如下：100ml脱脂牛奶，4ml2. 5%石蕊溶液，低压灭菌。
[0050] ④3-酮基乳糖反应
[0051] 根瘤菌LX-JX01菌株的反应呈阴性，菌落周围未出现黄褐色沉淀，表明该菌株为 非土壤杆菌。
[0052] 3-酮基乳糖培养基组成如下：10g乳糖、lg酵母浸膏粉、1000ml蒸馏水、15-20g琼 脂，ρΗ7· 2。
[0053] 综合以上鉴定结果表明，根瘤菌菌株CGMCCΝ〇11265为大豆慢生型根瘤菌 (Rhizobiumjaponicum)〇
[0054] 本发明涉及一种根瘤菌LX-JX01菌剂制备方法。
[0055] 该菌剂的制备方法的步骤如下：
[0056] A、液体DM培养基制备
[0057] 将1~3克酵母膏、8~12克蔗糖、1~3克硝酸钾、0.4~0.6克磷酸氢二钾、 0. 4~0. 6克磷酸二氢钾与0. 1~0. 2克氯化钠溶于蒸馏水中，并用蒸馏水定容到1000ml; 再使用无机酸或无机碱将其溶液的pH值调节至6. 8~7. 2,得到所述的液体DM培养基。
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