新的粘膜乳杆菌菌株的制作方法
【专利摘要】本发明涉及新的粘膜乳杆菌菌株，其能够降低肠屏障通透性。该菌株尤其用于减轻肠屏障功能障碍。
【专利说明】新的粘膜乳杆菌菌株
【技术领域】
[0001]本发明涉及新的粘膜乳杆菌(Lactobacillusmucosae)菌株及其用途,尤其是用于减轻肠屏障功能障碍。
【背景技术】
[0002]肠上皮充当防御屏障，以保护粘膜表面来抵抗肠腔内容物和外部环境。
[0003]由于细胞之间存在紧密连接(TJ)，肠上皮层具有低水平的通透性。紧密连接是细胞间的复合物，其功能是作为屏障来限制物质从肠腔到肠粘膜的转移。可以通过外部因素如一些肠道病原体或通过促炎症细胞因子(尤其包括TNF-α和IFN-Y)诱导这些复合物的损坏；这会导致增加的上皮细胞细胞旁通透性，其有助于各种肠道疾病，尤其包括肠易激综合征、慢性炎性肠疾病(克罗恩病(Crohn’ s disease)或溃疡性结肠炎)和乳糜泻(综述参见(CLAYBURGH 等人，Lab Invest，84，282-91，2004))。
[0004]已知各种益生乳酸菌通过不同的机制对肠上皮有保护作用(综述参见(OHLAND&MACNAUGHTON, American Journal of Phys1logy-Gastrointestinal and LiverPhys1logy, 298，G807-G19，2010)。然而，仅少数种类中的某些菌株被证明通过降低其通透性而改善上皮屏障功能。(RESTA-LENERT&BARRETT，Gastroenterology, 130, 731-46，2006)中报道，嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)和嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)防止由TNF-α和IFN-Y诱导的上皮通透性的增加。(MIYAUCHI等人，JDairy Sci, 92, 2400-8, 2009)研究了 4 种乳杆菌(德氏乳杆菌(L.delbrueckii)的一种菌株、干酪乳杆菌(L.casei)的一种菌株、加氏乳杆菌(L.gasseri)的一种菌株和鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)菌株0LL2838)对损伤的肠屏障功能和由TNF-α诱导的细胞旁通透性的作用。他们发现，鼠李糖乳杆菌0LL2838显著抑制了 TNF-α诱导的细胞旁通透性的增加，而其它测试菌株均无显著作用。(D0NAT0等人，Microb1logy，156，3288-97，2010)中表明鼠李糖乳杆菌菌株LGG减轻了 TNF- α或IFN- Y对上皮屏障完整性的影响。(EUN等人，Apmis, 119,49-56,2010)中表明干酪乳杆菌菌株DN114001 (CNCM 1-1518)也阻止了由TNF-α或IFN-Y诱导的上皮通透性的增加。Z.Zakostelska等人近期报道副干酪乳杆菌DN-11400KCNCM 1-1518)的裂解物在体内加强了肠细胞屏障的完整性(ZAK0STELSKA等人，2011。 Plos0ne6(ll)。
[0005]首次从猪小肠分离得到粘膜乳杆菌，后来也自人肠道和阴道以及自狗、牛犊和马的肠道中分离得到。
[0006] Roos和其合作者首先表征其为一种物种(R00S等人，Int J Syst Evol Microb1l,50Ptl, 251-8, 2000)。在分类学上，粘膜乳杆菌与发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)和桥乳杆菌(Lactobacillus pontis)密切相关。粘膜乳杆菌包含编码细胞表面蛋白的mub基因，该蛋白赋予了粘膜乳杆菌结合粘液的能力。Roos等人描述其为革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性、非孢子形成、非运动杆、生长于45°C而不是15°C。
[0007]粘膜乳杆菌中的一些菌株显示出具有抗微生物活性。Tzortis等人(TZ0RTZIS等人，JAppl Microb1l，96，552-9，2004)报道了，粘膜乳杆菌的菌株NCMB41149在存在麦芽寡糖或麦芽糖的情况下生长时，对大肠杆菌(Echerichia coli)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhymurium)具有体外抑制活性,而在存在葡萄糖、异麦芽寡糖、龙胆二糖或纤维二糖的情况下不具有该活性。PCT申请W02011/107960中描述了粘膜乳杆菌菌株DSM23409和DSM23408用于治疗或预防大肠杆菌感染的用途。
[0008]目前为止，未报道任何粘膜乳杆菌物种的菌株对肠屏障功能有影响。
【发明内容】
[0009]现在，本发明人鉴定了一种新的粘膜乳杆菌菌株，其除了抗微生物活性之外，还具有改善肠屏障功能的能力，尤其是通过减少肠上皮通透性。
[0010]本发明的一个主题是根据布达佩斯条约于2011年2月3日保藏于CNCM(Collect1n Nat1nale de Cultures de Microorganismes,25rue du Docteur Roux,Paris)编号为1-4429的菌株。
[0011]CNCM 1-4429菌株是革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性的微生物，非运动性，不形成孢子；细胞形状为大小I X 2-4 μ m的杆状，分离时成对或以短链形式出现。
[0012]其具有抗微生物的性质,尤其强烈地抑制肠炎沙门氏菌(Salmonella enterica)的生长。
[0013]其还具有减少肠屏障通透性的性质，换言之，保护或恢复上皮细胞旁的不透性，尤其是具有防止或恢复由TNF-α诱导的上皮细胞旁通透性的增加的性质。
[0014]本发明的主题还包括可通过诱变或通过遗传转化CNCM 1-4429菌株获得的粘膜乳杆菌菌株。优选地，这些菌株保留了 CNCM 1-4429菌株在降低肠屏障通透性上的性质。其可以是突变了 CNCM 1-4429菌株内源基因中的一个或多个的菌株，例如以修改其一些代谢性质(如该菌株代谢糖的能力、其对于肠转运的耐受、其对酸度的耐受、其后酸化或其代谢物生产)。其也可以是用一种或多种目标基因遗传转化CNCM 1-4429菌株所得到的菌株以使得可能如在所述菌株上赋予另外的生理特征或表达具有治疗性或疫苗兴趣的蛋白，其希望通过所述菌株的方法来施用。
[0015]这些菌株可以通过用于随机或定向诱变和乳杆菌的遗传转化的常规技术自CNCM1-4429 菌株获得，如 GURY 等人(Arch Microb1l.，182，337-45，2004)或 Velez 等人(ApplEnviron Microb1l.，73，3595-3604，2007)中所述的技术，或者被称为“基因组改组”的技术(Patnaik 等人，Nat B1technol, 20, 707-12, 2002 ;Wang Y.等人，J B1technol., 129,510-15,2007)。
[0016]本发明的一个主题还是一种用于获得能降低肠屏障通透性的粘膜乳杆菌菌株的方法，该方法包括诱变或遗传转化CNCM 1-4429菌株的步骤。
[0017]本发明的一个主题还是用于从根据本发明的粘膜乳杆菌菌株获得能够降低肠屏障通透性的细胞组分的方法。所述的细胞组分尤其是从所述菌株的培养物获得的DNA制剂或细菌壁制剂。其也可以是培养物上清液或这些上清液的组分。
[0018]本发明的主题还是组合物，其包括根据本发明的粘膜乳杆菌菌株，或可通过诱变或遗传转化CNCM 1-4429菌株而获得的粘膜乳杆菌菌株，或从所述菌株获得的细胞组分。
[0019]这些组合物尤其可以是乳酸发酵物，组合了根据本发明的粘膜乳杆菌和一种或多种其它的(可任选为益生的)乳酸菌菌株。可提及的乳酸菌菌株的举例包括乳杆菌属(Lactobacillus)、链球菌属(Streptococcus)、乳球菌属(Lactococcus)和双歧杆菌属(Bifidobacterium)，尤其是保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、嗜热链球菌菌株(Streptococcus thermophilus strain)、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、干酪乳杆菌(L.casei)、植物乳杆菌(L.pi ant arum)、罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)、约氏乳杆菌(L.johnsonii)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)、干酪乳杆菌亚种副干酪菌株(Lactobacillus casei ssp.paracasei strain)。
[0020]其也可以是食物产品，尤其是乳制品或药物或化妆品，其包括根据本发明的粘膜乳杆菌菌株，或通过诱变或遗传转化CNCM 1-4429菌株而获得的粘膜乳杆菌菌株，或从所述菌株获得的细胞组分。
[0021]当所述菌株以活菌形式存在时，其优选以每克至少15Cfu的比例存在，有利地每克产品至少106cfu，更有利地每克至少107cfu，甚至更有利地每克至少108cfu。
[0022]本发明的一个主题还是用于获得上述组合物的方法，其特征在于其包括:
[0023]-获得根据本发明的粘膜乳杆菌或可通过上述方法获得的粘膜乳杆菌菌株，或根据本发明的细胞组分，和
[0024]-将所述菌株或组分掺入到所述组合物中。
[0025]本发明的粘膜乳杆菌菌株、细胞组分和组合物可用于治疗或预防涉及肠屏障功能障碍的病况，尤其是与肠屏障通透性增加相关的病况。
【具体实施方式】
[0026]通过以下的进一步描述并参考阐述粘膜乳杆菌菌株CNCM 1-4429的表征和性质的实施例可以更清楚地理解本发明。
[0027]实施例1-粘膜乳杆菌菌株CNCM 1-4429的形态和发酵性质
[0028]形态
[0029]菌株CNCM 1-4429的电子显微镜图像示于图1。菌株CNCM 1-4429表现出扭曲的形状；其是扭曲的杆状菌。
[0030]碳水化合物代谢的分析:
[0031]在B1screen仪器(0y Growth Curves Ab Ltd)上进行糖发酵分析。选择21种糖用于分析。将其列于表1中。
[0032]用B1screen进行的分析历时24小时，在10秒振荡之后的每20分钟进行测量。进行2次分析，每次一式三份。为了避免分解代谢产物抑制葡萄糖的效果，对预培养使用具有半乳糖的培养基。
[0033]-预培养基MRS-半乳糖；
[0034]-培养基，含有I%待测糖的MRS
[0035]-在每个孔中；300μ L的培养基和I %的预培养基
[0036]-24h期间内，10秒振荡之后每隔20分钟测量OD
[0037]空白是由不含细菌的MRS表示。
[0038] 结果示于下述表1中:(+)表示存在生长，(+/-)表示适度生长和(_)表示没有生长。当OD值达到0.8或以上时，认为生长是阳性的。
[0039]
【权利要求】
1.一种以编号1-4429保藏于CNCM的粘膜乳杆菌(Lactobacillusmucosae)菌株。
2.一种获得能降低肠屏障通透性的粘膜乳杆菌菌株的方法，其特征在于其包括诱变或遗传转化CNCM 1-4429菌株的步骤。
3.一种获得能降低肠屏障通透性的细胞组分的方法，其特征在于所述细胞组分获取自权利要求1所述的粘膜乳杆菌。
4.一种组合物，其包括权利要求1所述的粘膜乳杆菌菌株，或通过权利要求2所述的方法所获得的粘膜乳杆菌菌株，或通过权利要求3所述的方法获得的细胞组分。
5.如权利要求4所述的组合物，其特征在于其是食品。
6.一种获得权利要求4和5所述的组合物的方法，其特征在于其包括获得权利要求1所述的粘膜乳杆菌菌株，或通过权利要求2所述的方法所获得的粘膜乳杆菌菌株，或通过权利要求3所述的方法获得的细胞组分，并将所述菌株或组分掺入到所述组合物中。
7.如权利要求1所述的粘膜乳杆菌菌株或如权利要求4所述的组合物，其用作治疗或预防由肠屏障功能障碍 所引起的病症的药物。
【文档编号】A61K35/74GK104053767SQ201180075632
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2011年12月21日 优先权日:2011年12月21日
【发明者】塔玛拉·什莫克维纳, 玛丽-克里斯蒂娜·德吉弗里 申请人:热尔韦·达诺尼公司