一种唾液乳杆菌及其制药用途
【专利摘要】本发明公开了一种分离自人胃粘膜的可用于防治由幽门螺杆菌引起的胃病的唾液乳杆菌(Lactobacillus?salivarius)，其保藏号为：CGMCC?No.8379。本发明还提供了用于预防和/或治疗由幽门螺杆菌引起的胃病的制品，其活性成分包括所述唾液乳杆菌。此外，本发明还提供了一种用于抑制幽门螺杆菌的制品，其活性成分包括所述唾液乳杆菌。本发明还证实了筛选出的所述唾液乳杆菌不仅能很好的适应人胃环境，具有很强的抗幽门螺杆菌生长、粘附、定值的能力，同时还能显著降低小鼠胃组织中由幽门螺杆菌引起的炎症。
【专利说明】一种唾液乳杆菌及其制药用途
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物生物【技术领域】，特别涉及一种分离自人胃粘膜的可用于防治由 幽门螺杆菌引起的胃病的唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius)。
【背景技术】
[0002] 幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, H. pylori)是一种革兰氏染色阴性、单极、多 鞭毛、末端钝圆、螺旋形弯曲的微需氧细菌。研究表明，它是慢性胃炎、十二指肠炎、消化性 溃疡的主要致病因素，也是胃癌的主要诱发因子，世界卫生组织已经将其列为I类致癌物 质。H. pylori在全球的感染率多达50%，发展中国家高达90%。所以防治H. pylori感染 对保护人类健康具有重要的临床意义。
[0003] H. pylori相关疾病的治疗策略是将其清除，从一种或多种抗生素联合杀菌发展为 抗生素与质子泵抑制剂、胃粘膜保护剂合用。这些措施曾一度取得有效的疗效，H. pylori的 根除率也能达到60% -90%。但随着治疗的深入，人们发现它们只在疾病早期效果显著，对 再次感染者的疗效差，并且停药后会复发，对不同个体间的疗效存在差异。长期治疗会产生 疗效不稳定，菌株抗生素耐药，药物副作用，患者依从性差等负面效应。
[0004] 面对上述问题，人们不得不寻找新的治疗途径，例如研发H. pylori相关疫苗和微 生态制剂，以彻底清除H. pylori。乳杆菌是人体胃内的重要菌群，在调节胃内微生态平衡和 抵御致病菌的侵犯中起到主要作用，并且越来越多的乳杆菌被证实可发挥益生菌的功能。 它们被应用到基础研究领域中治疗肥胖，肝脏损伤，胃炎，肠炎等疾病。目前围绕着乳杆菌 与H. pylori相互作用的研究很多，Yoon JH等报道利用乳杆菌抗H. pylori的效应，并联合 二联或三联疗法可根除H. pylori ;Rokka S等和Lorca GL等均发现小鼠模型中加氏乳杆菌 能有效降低H. pylori的定植及其对胃粘膜的炎症损伤。程胜平等利用复方嗜酸乳杆菌片 联合四联疗法治疗H. pylori阳性的消化性溃疡疗效显著，且不良反应少。但这些乳杆菌并 不是从人胃中分离得到的，同时没有验证其能否适应人胃环境，这使开发益生乳杆菌在人 胃中发挥抗幽门螺杆菌感染、定值和所致炎症的效果受到影响。
【发明内容】
[0005] 本发明基于上述领域的空白，对从人胃粘膜分离出的6株乳杆菌（Bacterium lacticum)菌株分别进行了体外耐胃环境测试及体外和体内抗幽门螺杆菌功能的验证，最 终筛选出一株唾液乳杆菌菌株（Lactobacillus salivarius)，该菌株于2013年10月21日 保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No. 8379。本发明证实了所述 唾液乳杆菌菌株能在PH2. 5和0. 2 %胆盐条件下生长，并能在体外抑制幽门螺杆菌生长和 粘附GES-1细胞。同时，本发明还发现所述唾液乳杆菌菌株在无菌昆明小鼠模型中能降低 幽门螺杆菌定值并缓解其导致的炎症。
[0006] 本发明的技术方案如下：
[0007] 一种唾液乳杆菌菌株，其保藏号为：CGMCC No. 8379。
[0008] 用于预防和/或治疗由幽门螺杆菌引起的胃病的制品，其特征在于：所述制品的 活性成分包括所述唾液乳杆菌菌株。
[0009] 用于预防和/或治疗由幽门螺杆菌引起的胃病的制品，其特征在于：所述制品的 活性成分是所述唾液乳杆菌菌株。
[0010] 所述制品还含有制备菌剂的常规辅料成分。
[0011] 用于抑制幽门螺杆菌的制品，其特征在于：所述制品的活性成分包括所述唾液乳 杆菌菌株。
[0012] 用于抑制幽门螺杆菌的制品，其特征在于：所述制品的活性成分是所述唾液乳杆 菌菌株。
[0013] 所述制品还含有制备菌剂的常规辅料成分。
[0014] 所述唾液乳杆菌在制备预防和/或治疗由幽门螺杆菌引起的胃病的制品中的用 途，其特征在于：所述制品的活性成分包括所述的唾液乳杆菌菌株。
[0015] 所述唾液乳杆菌在制备预防和/或治疗由幽门螺杆菌引起的胃病的制品中的用 途，其特征在于：所述制品的活性成分是所述的唾液乳杆菌菌株。
[0016] 本发明采集21例胃镜检查者的胃粘膜组织标本，经选择平板培养、分纯培养，并 结合形态、生化反应鉴定以及乳杆菌16S rDNA特异性引物确认，最终获得6株乳酸杆菌菌 株并分别命名为L1-L6。
[0017] 本发明在同等的实验条件下，分别对分离出的6株乳杆菌菌株及标准菌 株L. acidophilus ATCC4356进行了耐酸能力测定，耐胆盐能力测定，牛津杯法抑菌 (H. pylori)能力测定以及与H. pylori竞争性粘附GES-1细胞实验，结果发现：菌株L3在 pH2. 5、pH3. 0时，培养4小时后其菌量增加了 180%，且在pH4. 0、pH4. 5时，相对于其它菌株 也保持稳定生长优势；在耐胆盐能力测定中，菌株L3在胆盐浓度达到0. 2%时还能缓慢生 长；在用牛津杯法测定上述菌株抑制幽门螺杆菌的能力的实验中，菌株L3的抑菌环直径最 大；将上述各菌株分别加入含有H. pylori的GES-1细胞培养液中，测定最终幽门螺杆菌对 GES-1细胞的粘附率，结果发现经菌株L3处理的培养液中幽门螺杆菌对GES-1的粘附率最 低。上述实验结果充分说明菌株L3具有极好的耐胃环境的能力以及很强的抗幽门螺杆菌 生长和粘附胃黏膜细胞的作用。
[0018] 筛选出的这株乳杆菌菌株L3经16S rDNA特异性引物扩增比对确认为一株唾液乳 杆菌，菌落形态为菌落较大，圆形突起，乳黄色，表面光滑，革兰阳性，两端圆且排列不一杆 状，可发酵葡萄糖、乳糖等。所述菌株已经送保藏，其保藏信息如下：
[0019] 保藏信息
[0020] 菌种保藏名称：唾液乳杆菌
[0021] 保藏号：CGMCC No. 8379
[0022] 拉丁名：Lactobacillus salivarius
[0023] 保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0024] 保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
[0025] 保藏日期：2013-10-21
[0026] 此外，本发明还验证了所述唾液乳杆菌CGMCC No. 8379在模式生物：无菌的昆明 小鼠中的抑菌和抗炎症功能。结果证实了该菌株在小鼠体内能有效抑制幽门螺杆菌的感染 并能显著降低胃组织中的MPO等因子，从而改善胃粘膜局部的病例损伤达到降低胃组织炎 症的功效。
[0027] 本发明除提供了上述具有耐胃环境能力和抑制幽门螺杆菌作用的唾液乳杆菌 CGMCC No. 8379外，还提供了以该乳杆菌作为活性成分的用于预防和/或治疗由幽门螺 杆菌引起的胃病的制品，所述制品的制备方法是本领域技术人员熟知的常规手段，例如但 不限于：《一种稳定安全的微生态制剂及其制备方法和用途》（CN1663573B)，《灭活的乳酸 菌微生态制剂及其制备方法》（CN101612169B)，《一种乳酸杆菌微生态制剂的制备方法》 (CN101530160A)等现有技术中公开的制备方法或操作步骤，目前市场上公开销售使用的 "双歧杆菌乳杆菌三联活菌片"、"复方嗜酸乳杆菌片"的制备工艺等等。以所述唾液乳杆菌 菌株CGMCC No. 8379为活性成分，本领域技术人员可以按照所述常规手段和/或现有技术 文献中公开的制备方法或操作步骤或目前市场上公开销售使用的产品的制备工艺，或通过 合乎逻辑的分析、推理对上述制备方法进行适应性改进，可以获得用于预防和/或治疗细 菌性阴道病的制品，或者用于抑制致病性细菌的制品。
[0028] 所述制品的剂型优选但不限于：片剂、胶囊剂等。
【专利附图】
【附图说明】
[0029] 图1为分离出的6株人胃源乳杆菌菌株的PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测图谱。
[0030] 图2为6株人胃源乳杆菌菌株和标准菌株L.acidophilus ATCC4356在不同酸环 境下生长4小时后的菌量比较图谱。
[0031] 图3为6株人胃源乳杆菌菌株和标准菌株L. acidophilus ATCC4356在0· 05%胆 盐浓度下各自的生长率。
[0032] 图4为6株人胃源乳杆菌菌株和标准菌株L.acidophilus ATCC4356在0· 1 %胆盐 浓度下各自的生长率。
[0033] 图5为6株人胃源乳杆菌菌株和标准菌株L. acidophilus ATCC4356在0· 2%胆盐 浓度下各自的生长率。
[0034] 图6为经唾液乳杆菌菌株CGMCC No. 8379和/或幽门螺杆菌菌株H. pylori M13 处理的昆明小鼠中胃组织的ΜΡ0含量检测图谱。
【具体实施方式】
[0035] 下面结合【具体实施方式】对本发明作进一步的详细说明，但并不限制本发明的范 围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的 材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0036] 牛物材料的来源及记载出处
[0037] 21例无痛胃镜检查者胃粘膜组织标本采集自第三军医大学附属西南医院 (经患者许可后获取）。无菌的昆明小鼠来自第三军医大学实验动物中心，标准菌株 L.acidophilus ATCC4356来自美国菌种保藏中心，幽门螺杆菌菌株H. pylori M13来自第三 军医大学临床微生物学教研室。
[0038] 丰要试剂和耗材
[0039] MRS液体培养基（配方：称取MRS干粉55. 0g至1L水中），TTC (2, 3, 5-氯化三苯 基四氮唑），Skirrow血平板（配方：1L水中含蛋白胨15. Og，胰蛋白胨2. 5g，酵母提取物 5. Og，NaC15. Og，琼脂粉20. Og ;每200mL上述培养基中再加入10mL冻溶小牛血清、10%葡 萄糖lOmL，抗生素混悬液lmL(10y g/mL万古霉素，2500国际单位多粘菌素 Β，5μ g/mL甲 氧苄啶），GES-1细胞培养液（含10%胎牛血清的F12培养基（上海信裕生物科技有限公 司）），无菌牛津杯，细菌基因组提取试剂盒，MPO Elisa检测试剂盒。实施例1唾液乳杆菌 CGMCC No. 8379的分离与功能鉴定
[0040] 一、6株人胃源乳杆菌的分离
[0041] 方法和步骤:
[0042] 采集第三军医大学附属西南医院21例无痛胃镜检查者胃粘膜组织标本，（标本经 许可后获取），以分区划线法涂布于MRS选择性平板，37°C微需氧培养箱中培养2-5天，挑 取乳白色单个菌落，革兰染色阳性的进一步分纯培养，再对生长的菌落按《伯杰斯细菌鉴定 手册》进行形态和生化反应鉴定。提取经分离纯化后的细菌的基因组用乳杆菌16SrDNA特 异性引物（F:5, -AGCAGTAGGGAATCTTCCA-3'，R:5' -ATTTCACCGCTACACATG-3'）进行 PCR 扩 增，目的条带为344bp，纯化后测序，并在NCBI上比对该序列。结合形态、生化反应鉴定和 16SrDNA结果确定菌株名称。
[0043] 分离鉴定结果：
[0044] 21例人胃粘膜组织经MRS琼脂平板培养后，共分离出6株乳杆菌。分离菌株在 此平板上的菌落特征及镜下形态如表1，生化特性见表2。乳杆菌16SrDNA特异性引物扩 增平板上单个菌落细菌DNA后，1.5 %的琼脂糖凝胶电泳如图1 ;同时将PCR产物纯化送 invitrogen公司测序，将测序结果在NCBI中进行Blast相似性比对，结合分离菌株的菌落 特征及镜下形态，将上述6株乳杆菌确定为L1、L2为口腔乳杆菌，L3为唾液乳杆菌，L4为 卷曲乳杆菌，L5为加氏乳杆菌，L6为德氏乳杆菌。
[0045] 表1分离菌株的菌落特征及镜下形态
[0046]
【权利要求】
1. 一种唾液乳杆菌菌株，其保藏号为：CGMCC No. 8379。
2. 用于预防和/或治疗由幽门螺杆菌引起的胃病的制品，其特征在于：所述制品的活 性成分包括权利要求1所述的唾液乳杆菌菌株。
3. 用于预防和/或治疗由幽门螺杆菌引起的胃病的制品，其特征在于：所述制品的活 性成分是权利要求1所述的唾液乳杆菌菌株。
4. 根据权利要求2或3所述的制品，其特征在于：还含有制备菌剂的常规辅料成分。
5. 用于抑制幽门螺杆菌的制品，其特征在于：所述制品的活性成分包括权利要求1所 述的唾液乳杆菌菌株。
6. 用于抑制幽门螺杆菌的制品，其特征在于：所述制品的活性成分是权利要求1所述 的唾液乳杆菌菌株。
7. 根据权利要求5或6所述的制品，其特征在于：还含有制备菌剂的常规辅料成分。
8. 权利要求1所述的唾液乳杆菌在制备预防和/或治疗由幽门螺杆菌引起的胃病的制 品中的用途，其特征在于：所述制品的活性成分包括权利要求1所述的唾液乳杆菌菌株。
9. 权利要求1所述的唾液乳杆菌在制备预防和/或治疗由幽门螺杆菌引起的胃病的制 品中的用途，其特征在于：所述制品的活性成分是权利要求1所述的唾液乳杆菌菌株。
【文档编号】C12R1/225GK104195093SQ201410493719
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年9月24日 优先权日:2014年9月24日
【发明者】郭刚, 黄微微, 杜方川, 刘开云, 蒲瑞雪, 宋阳, 邹全明 申请人:中国人民解放军第三军医大学