专利名称：一株副干酪乳杆菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，涉及一株副干酪乳杆菌及其应用方法。
背景技术：
国际营养学界给“益生菌”的定义是指一类有益人类健康的肠道生理细菌， 还常被描述为“良性”或“健康”的细菌。它包括保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、双 岐杆菌、嗜酸乳杆菌、唾液乳杆菌、发酵乳杆菌等细菌。应用于人体的益生菌产品有益 生菌发酵的乳制品、肉制品、果蔬制品等，医药保健行业。乳酸菌是益生菌中的主要一 类，具有抗肿瘤、缓解乳糖不耐症、增强免疫力、降低胆固醇、调整肠道菌群等生理作 用。乳酸菌主要用于发酵肉制品、发酵水产品等发酵食品的生产中，抑制了腐败菌和致 病菌的生长及毒素的产生，使发酵食品的保存期大大延长，有利于储藏和流通，食用安 全性更好，营养成分更丰富。微囊藻毒素(MCs)是由富营养化水体中的铜绿微囊藻、水华鱼腥藻、念珠藻等 蓝藻产生的一种环状七肽物质。微囊藻毒素以动物肝脏为作用靶器官，能够特异性地抑 制蛋白磷酸酶活性从而诱发癌症等一系列病变。由于毒性强、在食物链中波及范围广以 及具有鲜明的地域特征，微囊藻毒素日益成为危害人类健康的重要杀手。目前，干预 MCs的手段可分为物理防治、化学防治以及生物防治。其中，微生物处理法中部分益生 菌对MCs的干预作用因其安全性(GRAS)而成为真正能够实现在清除MCs过程中与水 源、食品“零距离”接触的生物防治剂。同时，由于益生菌定殖人体肠道后在抑制有害 微生物生长、提高人体免疫力、协助消化和营养吸收等诸多方面发挥的长期功效，使得 益生菌作为体内MCs “清道夫”的价值更加突出。
发明内容
本发明提供了一株副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei BBE10-215)。本发明所提供的副干酪乳杆菌BBE10-215 {Lactobacillusparacasei),已于2010
年7月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为中国武汉，武汉大学，保藏 编号为CCTCC NO: M 2010169，分类学命名为副干酪乳杆菌(Lactobacillus pamcasei)； 其16SrDNA如核苷酸序列表中SEQ ID NO: 1所示，以其16SrDNA全序列为基础的系统发 育树如说明书附图1所示。本发明提供了一种所述副干酪乳杆菌的应用，是将培养好的副干酪乳杆菌用于 微囊藻毒素的清除。将培养好的副干酪乳杆菌调整菌浓的比例至适宜范围，接种至藻毒 素溶液中，室温下静止培养或不定时搅拌使溶液混合均勻。所述干酪乳杆菌为从泡菜、腊肠等传统发酵食品中筛选，其保藏条件如下从 生长良好的平板上取2-3环益生菌移入MRS培养基中，37°C静置培养20h，取0.7mL移 入盛有0.3mL无菌甘油的甘油管中，放_70°C冰箱保存。所述MRS培养基为葡萄糖20§1^，蛋白胨lOgL—1，牛肉膏lOgL—1，酵母浸出汁5β Λ无水乙酸钠5§ Λ磷酸二氢钾ZgL—1，柠檬酸三铵ZgL—1，MgSO4 · 7H20 0.2g L-1, MnSO4 · H2O 0.05g L1, Tween-80 ImL L1, pH5.5。所述干酪乳杆菌培养条件为将甘油管保藏的益生菌接入MRS液体培养基，在 37°C静置培养20h至对数中后期，以2%接种量取-70°C甘油贮存液接种于MRS培养基 中，37°C静置培养20h。在藻毒素浓度为1000 μ g L1的条件下，IO9CFUmI/1的菌体与之共培养24h后， 降解率高达到12% (图2)。在藻毒素浓度为100 μ g L-1的条件下，菌浓为IO9CFU mL1 的菌体与之共培养24h后，降解率最高达到76%。在藻毒素起始浓度为SOOygI/1的条 件下，菌浓为IO9CFUmI/1的菌体与之共培养24h后，降解率最高达到39%。微囊藻毒素的检测采用高效液相的方法色谱柱AgilentZORBAX Eclipse XDB-C18 (4.6 X 150mm, 5.0 μ m)流动相乙腈H2O(0.05% TFA) =40 60 (ν/ν)进样量20μ 1 ；流速lmL/min ；柱温40°C检测器DAD238nm ； MCs 保留时间3.48min本发明具有藻毒素清除效果好的特点，并且副干酪乳杆菌作为一种益生菌，特 别适合应用于食品领域，使藻毒素得到快速、安全和高效地清除。
图1 :乳杆菌系统发育树
具体实施例方式实施例1 副干酪乳杆菌筛选方法从泡菜、腊肠等传统发酵食品中取一定样品加入到30mL MRS培养基中富集培 养，37°C培养20h。将培养液梯度稀释，涂布于添加0.02%溴甲酚紫的MRS平板，37°C 培养箱中培养48h。挑取使溴甲酚紫变色圈明显的的单菌落。反复进行平板划线分离， 重复三次得到纯化的单菌落，供下一步鉴定用。鉴定主要通过1)菌落特征观察用肉眼直接观察，挑选菌落直径在1 3_ 之间，圆形隆起，表面光滑或稍粗糙，乳白、灰白或暗黄色等符合乳酸菌菌落特征的菌 株。2)个体形态观察用光学显微镜革兰氏染色观察。挑选革兰氏阳性、无芽孢菌株。 将满足鉴定条件的菌株挑出甘油管保藏。以2%接种量取-70°C甘油贮存液接种于MRS培养基中，37°C静置培养。取37°C 静置培养20h (对数中后期)的发酵液，离心IOmin (3200 Xg，4°C )收集菌体，再用磷酸 盐缓冲液(pH 7.0)洗涤离心2次，调整菌浓在IO9CFU mL1左右。将获得的菌体重悬于 含藻毒素(MC-LR)浓度为1000 μ g L1的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中，置于37°C摇床(150r min—1)避光培养。培养24h后取样，离心IOmin (12000 Xg，4°C )，取上清液用HPLC检 测MC-LR残存浓度。通过HPLC检测，筛选到一株具有较强MC-LR清除能力的菌株，通过16SrDNA 序列分析(见核苷酸序列表中SEQ ID NO: 1所示)可知该菌株为副干酪乳杆菌，于2010 年7月7日保藏于菌种保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2010169。
实施例2 MC-LR 初始浓度为 100 μ g I/1以2%接种量取-70°C甘油贮存液接种于MRS培养基中，37°C静置培养。取37°C 静置培养20h (对数中后期)的发酵液，离心IOmin (3200 Xg，4°C )收集菌体，再用磷酸 盐缓冲液(pH 7.0)洗涤离心2次，调整菌浓在IO9CFU ml/1左右。将获得的菌体重悬于含 MC-LR浓度为IOOygL1的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中，置于37°C摇床(ISOrmm1)避光 培养。培养24h后取样，离心IOmin (12000 Xg，4°C )，取上清液用HPLC检测MC-LR 残存浓度。计算获得菌株对MC-LR的清除率为76%。实施例3 MC-LR 初始浓度为 500 μ g L—1以2%接种量取-70°C甘油贮存液接种于MRS培养基中，37°C静置培养。取37°C 静置培养20h (对数中后期)的发酵液，离心IOmin (3200 Xg，4°C )收集菌体，再用磷酸 盐缓冲液(pH 7.0)洗涤离心2次，调整菌浓在IO9CFU ml/1左右。将获得的菌体重悬于含 MC-LR浓度为500 μ gL—1的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中，置于37°C摇床(lSOrmiiT1)避光 培养。培养24h后取样，离心IOmin (12000 Xg，4°C )，取上清液用HPLC检测MC-LR 残存浓度。计算获得菌株对MC-LR的清除率为39%。实施例4 MC-LR 初始浓度为 1000 μ g I/1以2%接种量取-70°C甘油贮存液接种于MRS培养基中，37°C静置培养。取37°C 静置培养20h (对数中后期)的发酵液，离心IOmin (3200 Xg，4°C )收集菌体，再用磷酸 盐缓冲液(pH 7.0)洗涤离心2次，调整菌浓在IO9CFU ml/1左右。将获得的菌体重悬于含 MC-LR浓度为1000 μ gL 1的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中，置于37°C摇床(ISOrmm1)避光 培养。培养24h后取样，离心IOmin (12000 Xg，4°C )，取上清液用HPLC检测MC-LR 残存浓度。计算获得菌株对MC-LR的清除率为12%。可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其 发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求 的保护范围。
权利要求
1.一株副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei) BBE10-215,保藏编号 CCTCC M 2010169。
2.一种培养权利要求1所述副干酪乳杆菌的方法，是在MRS培养基中静置培养副干 酪乳杆菌。
3.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于优选pH5.5 ；优选培养温度37°C。
4.权利要求1所述干酪乳杆菌的应用，是将培养好的干酪乳杆菌用于微囊藻毒素的清
全文摘要
本发明公开了一株副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)BBE10-215，已于2010年7月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2010169。该菌株具有较高的藻毒素清除效率，将该菌株用于保健食品领域，具有提高人体免疫力、协助营养消化等诸多方面的功效。
文档编号C12R1/225GK102021127SQ20101023867
公开日2011年4月20日 申请日期2010年7月28日 优先权日2010年7月28日
发明者吴重德, 堵国成, 张娟, 张茜, 毕洁, 王松, 王淼, 陈坚, 顾磊 申请人:江南大学