一种高效抑制禽致病性沙门氏菌的唾液乳杆菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株新菌种及其在生物制药工程中的应用，本发明涉及一种高效抑制 禽致病性沙门氏菌的唾液乳杆菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 唾液乳杆菌是动物体内具有重要生理功能的益生菌之一，也是动物体内肠道中的 正常菌群之一。多数唾液乳酸菌都可产生有机酸、过氧化氢、细菌素和类似抗菌素等物质， 并以此来抑制病原菌的生长。有机酸可透过病原菌的菌膜，阻碍其代谢活性如氧化和磷酸 化过程；过氧化氢可引起菌体蛋白质的氧化变性，使代谢过程中某些酶类失活，最终导致菌 体死亡。当动物摄入一定量的乳酸菌时，占有生长优势的乳酸菌可在动物消化道内迅速繁 殖，消耗大量的氧气，从而创造出有利于双歧杆菌和链球菌等益生菌的生长而不利于大肠 杆菌和沙门氏菌等有害的兼性厌氧菌的生长。同时，乳酸菌还能产生维生素、氨基酸、促生 长因子等各种营养物质，并能产生淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等多种酶类，提高消化酶活性、 减少肠源性内毒素吸收，从而促进动物采食和增重，提高饲料的利用率和转化率。
[0003]沙门氏菌是一类需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性肠道杆菌，是公共卫生学上具有重 要意义的人兽共患病之一。据统计，在世界各国的各类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的 食物中毒常列榜首，我国大陆地区也以沙门氏菌为首位。沙门氏菌是胞内寄生菌，能垂直传 播，禽类沙门氏菌可引起鸡白痢、鸡伤寒和鸡副伤寒等疾病，目前还没有有效的疫苗可供免 疫，一般通过种蛋消毒来控制此病。据调查，我国各地养殖场沙门氏菌的阳性率极高，虽然 有些鸡场通过使用药物等方法将感染控制在较低水平，没有出现发病现状，但如果鸡场管 理不当，鸡群免疫力下降，则容易爆发沙门氏菌病，导致严重的损失。
[0004] 动物刚出生时，处于无菌状态的消化道很快受到外界环境的细菌污染，之后大量 的细菌开始生长繁殖，并逐渐适应，定植，形成稳定的正常微生物菌群。由于雏鸡肠道天然 菌群进入体内太晚而不能及时定植，雏鸡很容易受到沙门氏菌感染。在动物养殖业上，由于 抗生素等抗菌药的滥用及不合理使用，细菌的耐药性和药物残留等问题严重危害食品安全 及人类健康。因此，运用乳酸菌等益生菌来研制安全、无毒副作用，既能防治疾病又能促进 动物生长的微生态制剂具有广阔的应用前景。
【发明内容】
[0005] 为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种高效抑制禽致 病性沙门氏菌的唾液乳杆菌。
[0006] 本发明的另一目的在于提供上述高效抑制禽致病性沙门氏菌的唾液乳杆菌的应 用。
[0007] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0008] -种高效抑制致病性沙门氏菌的唾液乳杆菌，是从健康鸡群中分离得到，命名为 Lactobacillus salivarius SCL87〇
[0009] 申请人将菌株保藏在位于武汉市武昌珞珈山武汉大学的中国典型培养物保藏中 心，保藏中心于2015年5月28日收到申请人提供的菌株。保藏中心给予该培养物的保藏 号为CCTCC NO :M2015338,提议的分类命名为Lactobacillus salivarius SCL87。
[0010] LactobacillussalivariusSCL87在制备防治致病性沙门氏菌感染的制剂中的 应用。
[0011] LactobacillussalivariusSCL87在制备防治禽类沙门氏菌感染的制剂中的应 用。
[0012] LactobacillussalivariusSCL87在制备改善肠道菌群生态平衡，防治腹泻疾病 并促进生长制剂中的应用。
[0013] Lactobacillus salivarius SCL87在制备改善禽类肠道菌群生态平衡，防治禽类 腹泻疾病并促进禽类生长制剂中的应用。
[0014] 本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
[0015] (1)本发明唾液乳杆菌LactobacillussalivariusSCL87是一种具有高效抑制沙 门氏菌的益生菌，可防治禽类沙门氏菌病，对保障食品安全和人类健康具有重要意义。
[0016] (2)本发明菌株是从健康动物分离出来的菌株，经过多重检查筛选，证明其安全可 靠且稳定。
[0017] (3)本发明菌株是以针对治疗沙门氏菌而开发的菌株，对沙门氏菌具有针对性，并 且效果良好。
[0018] (4)本发明菌株具有耐酸、耐胆盐、耐胰蛋白酶及良好的黏附能力，其分泌上清液 对禽类沙门氏菌具有很强的抑制作用，能有效的竞争抑制禽类沙门氏菌的生长、防治禽类 沙门氏菌病，并且能促进禽类生长，提高饲料利用率。
【附图说明】
[0019] 图1为唾液乳杆菌SCL87的PCR鉴定图；其中，泳道M:DL2000DNAMarker;泳道 1 :保加利亚乳杆菌ATCC393 ;泳道2 :菌株SCL87 ;泳道3 :鼠伤寒沙门氏菌CMCC50115 ; 泳道4 :金黄色葡萄球菌ATCC25923 ;泳道5 :空肠弯曲杆菌ATCC33291 ;泳道6 :大肠杆菌 ATCC25922。
[0020] 图2为唾液乳杆菌SCL87的光学显微镜图。
[0021] 图3为唾液乳杆菌SCL87的生长曲线。
[0022] 图4为唾液乳杆菌SCL87与鼠伤寒沙门氏菌CMCC50115在MRS固体培养基上的生 长情况。
[0023] 图5为不同处理组动物的平均体重。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0025] 实施例中所述的唾液乳杆菌，命名为LactobacillussalivariusSCL87;所述菌 株保藏单位：中国典型培养物保藏中心（CCTCC)，保藏日期：2015年5月28日，保藏地址： 中国?武汉?武汉大学，保藏编号：CCTCCN0:M2015338。
[0026] 下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规实验条件或按照制 造厂商所建议的实验条件。
[0027] 实施例1
[0028] 一、唾液乳杆菌Lactobacillus salivarius SCL87的来源
[0029] 该唾液乳杆菌为本发明人于2013年中从广东养殖场的健康鸡群中分离得到，现 由华南农业大学兽医学院禽病研究室保存和提供。
[0030]二、唾液乳杆菌Lactobacillus salivarius SCL87的鉴定和分类
[0031] 经过本发明人实验室系统鉴定表明该株为唾液乳杆菌。
[0032] (1)生化鉴定
[0033] 参照《伯杰细菌鉴定手册》，对分离的菌株SCL87过氧化氢酶试验、硝酸盐还原试 验、明胶液化试验、吲哚试验、硫化氢试验、V-P试验和动力试验这七项生化试验，结果均为 阴性。初步判定菌株SCL87属于乳酸菌（Lactobacillus)属。
[0034] (2)PCR鉴定
[0035] 参照Dubernet设计的引物对SCL87菌株基因检测，扩增的目的基因长度约为 200bp，引物序列为LbLMAl-rev (5, -CTCAAAACTAAACAAAGITTC-3'），R16-1 (5, -CTTGTACACACG CCCGTCA-3'），PCR反应参照宝生物公司rTaq DNA聚合酶的使用说明书进行，PCR反应体系 (25yL)为：ddH20 11 yL、rTaq(Premix Taq) 10 yL、引物LbLMAl-rev (20 ymol/L)lyL、弓| 物R16-1 (20 y mol/L) 1 y L，模板DNA2 y L。PCR反应条件为：95°C预变性5min ;95°C，30s， 55°C，30s，72°C，30s，30个循环；72°C延伸7min。PCR鉴定结果如图1所示，进一步确定 SCL87菌株属于乳酸菌（Lactobacillus)属。
[0036] 注：泳道M:DL2000DNAMarker;泳道1:保加利亚乳杆菌ATCC393;泳道2:菌株 SCL87 ;泳道3 :鼠伤寒沙门氏菌CMCC50115 ;泳道4 :金黄色葡萄球菌ATCC25923 ;泳道5 :空 肠弯曲杆菌ATCC33291;泳道6:大肠杆菌ATCC25922。
[0037]大肠杆菌（Escherichia coli)ATCC25922、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)ATCC25923、空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni)ATCC33291和保加利亚乳杆菌 (Lactobacillus bulgaricus)ATCC 393分别购于广东省微生物菌种保藏中心；
[0038] 鼠伤寒沙门氏菌（Salmonellatyphimurium)CMCC50115购于美国菌种保藏中心。
[0039] ⑶1防rRNA基因测序
[0040]参照Messick设计的引物对分离的SCL87菌株16SrRNA基因测序，引物序列 为fDl:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，rDl:5'-AAGGAGGTGATCCAGCC-3'，PCR反应体 系（50yL)为：rTaq(PremixTaq) 25yL、引物fDl(20ymol/L) 1yL、引物rDl(20ymol/ L) 1yL，模板DNA2yL、ddH20 21yL。PCR反应条件为：94°C预变性 5min;94°C，45s，55°C， 458,72°(：，908,35个循环；72°(：延伸10111111。反应结束后取71^?〇?产物经1%琼脂糖凝 胶（0.5yg/mLEB)电泳检测。将目的产物送上海美吉生物医药科技有限公司进行DNA双 向测序。将测序结果与Genbank数据库中不