一株调节畜禽肠道菌群平衡的丁酸梭菌的筛选及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于兽用微生物添加剂技术领域，具体涉及一株调节畜禽肠道菌群平衡的 丁酸梭菌的筛选及应用。本发明与抗生素添加剂技术应用领域有关。本发明涉及一株饲用 羊源益生丁酸梭菌（Clostridiumbutyricum)菌株的分离鉴定、安全性评价、抗逆性能及益 生性能鉴定及作为畜禽用饲料添加剂的应用。
【背景技术】
[0002] 在畜牧养殖生产中，抗生素以其在防治动物疾病，提升畜禽生产性能等方面的优 势而得以广泛应用，因此在一定程度上使养殖业从散养型更有效地转向了集约化、规模化， 从而带来更大的经济效益。然而近些年来，由于抗生素大量及不正当的使用，其带来的问题 也接踵而至，如耐药菌株的大量产生、动物正常菌群失调、畜产品中药物残留等，这都严重 制约着养殖业的发展，同时还影响人类健康，已引起各界人士的高度重视。目前，在世界各 国对畜禽用抗生素均有严格限制，而今后禁用抗生素添加剂也定是必然趋势。在当前的养 殖环境下，如何走出因抗生素限用禁用而给养殖业带来的困境，寻求一种既无毒、无残留、 无抗药性，又能防病、促生长的饲用添加剂是关键，而益生菌一一具备上述优势，因此被认 为事抗生素最有效的替代品之一。
[0003] 丁酸梭菌是一类具有内生芽孢结构的厌氧杆菌，是存在于人类和动物肠道内的有 益菌，丁酸梭菌能形成内生芽孢，能耐高温、耐酸、耐胆汁，耐多种抗生素，在通过消化道时 不失活，在体外能稳定保存。丁酸梭菌能调节肠道菌群平衡，增强机体免疫功能，其主要代 谢产物丁酸是肠道上皮组织细胞再生和修复的主要营养物质。因此，其作为饲料添加剂，与 其他微生物饲料添加剂相比具有独特优势。
[0004] 目前市场上的丁酸梭菌制剂大多从日本进口，价格偏高，因此在我国对其的研究 和应用也引起业内人士的关注。如公开号为CN1995330A文献公开了一种丁酸梭菌活菌制 剂的生产方法；公开号为CN102220269A文献公开了丁酸梭菌及丁酸梭菌饲料添加剂的生 产方法；公开号为CN103205373A文献公开了一株用于乳仔猪养殖的优良丁酸梭菌，主要 用于改善断奶仔猪的生产性能。上述专利文献主要涉及丁酸梭菌的发酵工艺及生产方法的 研究和临床应用，未涉及菌株的筛选过程。再如公开号为CN102321552A文献报道了一株 饲用丁酸梭菌及其应用，所述菌株来源于土壤，而非来自于同源性较高的动物机体。上述专 利文献均未涉及在动物体内实验中验证丁酸梭菌的对肠道致病菌的抑制作用及对常见益 生菌的促增值作用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一株安全、能调节畜禽肠道菌群平衡、抗病性能强的可用做 微生物饲料添加剂的丁酸梭菌。
[0006] 本发明通过以下技术方案实现：
[0007] 根据筛选目标和益生菌的生理生化特性及遗传学特性，本发明以经典的生理生化 手段及现代分子生物学方法，从健康山羊的直肠内容物中，经过大量分选，从湖北省武汉 市华中农业大学兽医院饲养的健康羊的肠道的内容物中分离筛选得到一株调节畜禽肠道 菌群平衡的丁酸梭菌菌株，申请人将其命名为丁酸梭菌HDRyYBl，Clostridiumbutyricum HDRyYBl，于2015年4月6日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心（CCTCC) 保藏，其保藏号为CCTCCN0:M2015200。
[0008] 本发明的丁酸梭菌（Clostridiumbutyricum)HDRyYBl的菌学特性：
[0009] 该菌株为严格厌氧的革兰氏阳性芽孢杆菌，菌体呈直或微弯的杆状，其直径为 0. 6~1. 2ymX3. 0~7. 0ym，端圆，单个或成对、短链、偶见长丝状菌体。以周身鞭毛运动。 孢子卵圆，呈偏生到次端生，无孢子外壁和附属丝。在葡萄糖琼脂平板上形成不太规则的圆 形菌落，呈煎蛋样，稍凸，不透明，直径1~3_，菌落粘稠而不易吹散，孔雀绿染色后可见红 色梭杆状菌体及绿色卵圆形芽孢。在厌氧条件下生长，生长温度范围为20°C~60°C，最适 温度为30°C~42°C;生长酸碱度范围为pH2~10,最适pH为7.0。该菌株生长代谢时产气 产酸，能利用木糖、蔗糖、乳糖、淀粉、葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、棉籽糖、鼠李糖、蜜二糖等碳 水化合物，但不发酵甘露醇和松三糖，不水解明胶，其生理生化特性符合《伯杰氏细菌手册》 上关于丁酸梭菌的描述。将其16SrRNA基因进行PCR鉴定并测序，结果在NCBI进行Blastn 比较，发现其16SrRNA与丁酸梭菌（KC195777. 1)的序列同源性最高，相似性为99%。同时 利用16S-23SrRNA间隔序列的差异性设计的一套丁酸梭菌的特异引物，对其16S-23SrRNA 间隔序列进行PCR扩增并测序，结果在NCBI进行Blastn比较，检索发现其16S-23SrRNA 间隔序列特异性片段与已报道的丁酸梭菌的16S-23SrRNA间隔序列（AB178159. 1)同源性 最高，相似性为100%。
[0010] 该菌株在酸性和高胆盐环境中的生存能力强，在pHl.O~3.0孵育后，其活菌数几 乎没有下降，耐受〇. 3%胆盐其活菌的数量级未有变化。另外，该菌株对肠上皮细胞有明显 的粘附性，粘附率达3%以上。由此推测，该菌株能够抵抗胃酸和小肠中高浓度胆盐的不利 影响，粘附于肠道存活下来发挥益生作用，这在动物试验中也得到证实。
[0011] 该菌株繁殖能力较强，在第l〇h进入对数生长期，第14h后进入稳定期，此后细菌 生长保持动态平衡。同时菌液pH由最初的中性而逐渐变成酸性。
[0012] 该菌株能产芽胞，对高温的耐受能力相对较强，经80°C以上水浴作用活菌数下降 迅速，但经80°C高温处理lOmin时芽孢存活率为61. 11 %，表明该菌株可以耐受饲料熟化和 制粒的高温，为其作饲料添加剂的应用于生产实际奠定了良好基础。
[0013] 对该菌株的急性毒性试验结果表明，实验组小鼠体征正常，未出现中毒和死亡现 象。这与后续的动物实验结果一致，确保了其作饲料添加剂应用的安全性。
[0014] 该菌株常见肠道致病菌（金黄色萄萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌）均有明显的抑菌 作用，对肠道有益菌（粪肠球菌、双歧杆菌）有明显的促增值作用。这与后续的动物实验结 果一致，表明了该菌株有调节肠道菌群平衡，增强抵抗力的功效。
[0015] 该菌株对常用兽药如阿莫西林、强力霉素、四环素、恩诺沙星、头孢西丁、氯霉素、 头孢哌酮敏感，但对多粘菌素B、复方新诺明、头孢吡肟、青霉素、新霉素、庆大霉素表现耐 药。这对该菌株与抗生素的配伍使用提供了依据。
[0016] 申请人将本发明的丁酸梭菌HDRyYBl通过液体发酵按常规离心喷雾干燥制微生 态制剂，应用于饲料添加剂，进行了仔猪饲喂试验以研究其益生特性，结果表明，对断奶仔 猪有降低料肉比，促进生长的作用，试验达到了预期的效果，从而完成了本发明的任务。
[0017] 本发明的丁酸梭菌具有如下优点：
[0018] (1)菌株来源于健康羊的肠道的内容物，从大量候选菌株中分离和筛选得到，该菌 株被命名为丁酸梭菌HDRyYBl，其对常见肠道致病菌（金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏 菌）具有明显的抑菌效果；对常见益生菌（乳酸杆菌和双歧杆菌）的促增值作用。完全耐 受胃酸及肠道胆盐高渗透压环境，且具有粘附能力，因此可在肠道定植发挥益生作用。同时 该菌株能产芽孢，抗逆性强。
[0019] (2)动物试验证明，该株丁酸梭菌可作畜禽饲料添加剂使用，对畜禽肠道致病菌的 抑制作用及对常见益生菌的促增值作用，可提高畜禽生产性能，并为其在饲料中的添加量 提供参考。
[0020] 更详细的技术方案见《具体实施方案》的内容。
【附图说明】
[0021] 序列表SEQIDN0 :1是本发明分离株丁酸梭菌HDRyYBl的16SrDNA基因部分序 列。
[0022] 序列表SEQIDN0 :2是本发明分离株丁酸梭菌HDRyYBl的16S-23SrRNA间隔序 列特异性片段序列。
[0023] 图1 :是本发明分离筛选的丁酸梭菌HDRyYBl在RCM培养基平板上的生长状态。附 图标记说明：图1A是在有氧条件下无菌落形成。图1B是在有氧情况下形成不规则的乳白 色菌落图。
[0024] 图2 :是本发明分离筛选的丁酸梭菌HDRyYBl的革兰氏染色反应和孔雀绿染色反 应镜检图。附图标记说明：图2A是丁酸梭菌菌体在革兰氏染色镜检图。图2B.是丁酸梭菌 菌体在孔雀绿染色镜检图
[0025] 图3 : 丁酸梭菌HDRyYBl的16SrRNA基因PCR扩增检测结果。附图标记说明： M:DL2000DNA分子量标准；泳道1 :阴性对照；泳道2 :丁酸梭菌HDRyYBl菌株；。
[0026] 图4 :丁酸梭菌HDRyYBl的16S-23SrRNA间隔基因PCR扩增检测结果。附图标记 说明：M:DL2000DNA分子量标准；泳道1 :丁酸梭菌HDRyYBl菌株；泳道2 :阴性对照。
[0027] 图5 :丁酸梭菌HDRyYBl的生长曲线和pH曲线图。
[0028] 图6 :丁酸梭菌HDRyYBl不同生长时间的菌体形态。附图标记说明：图6A是丁酸 梭菌HDRyYBl培养8小时的菌落形态图；图6B是丁酸梭菌HDRyYBl培养24小时的菌落形 态图；图6C是丁酸梭菌HDRyYBl培养36小时的菌落形态图；图6D是丁酸梭菌HDRyYBl培 养48小时的菌落形态图。
【具体实施方式】
[0029] 实施例1 :丁酸梭菌HDRyYBl菌株的分离和鉴定
[0030] 一、菌株的分离
[0031] (1)本发明的生物材料采集湖北武汉华中农业大学兽医院养殖场健康山羊的直肠 内容物，将直肠内容物样品分为6组，分别置于装有RCM液体（购自美国BD公司）培养基 的三角瓶中，于80°C水浴lOmin，冷却后置于37°C厌氧培养箱中静置培养18~24h，观察产 气情况，挑出产气瓶再次置于80°C水浴lOmin，冷却后以2% (v/v)的接种量转接于RCM液 体培养基中静置培养至产气。
[0032] (2)挑选产气较多的三角瓶，梯度稀释培养液，涂布于添加有CaC〇j9TSN琼脂（购 自美国130公司），置于厌氧培养箱（气体条件为112:〇) 2:1'12,5:10:85，￥八八）中进行厌氧分 离，37°C下培养48h。
[0033] (3)挑取平皿上符合丁酸梭菌菌落特征的菌落接种于装有RCM培养基的平皿，分 为两组，一组置于厌氧培养箱，另一组置于有氧条件下，于37°C静置培养18h，进行耐氧试 验，最后进行染色镜检。最终筛选出的1株符合丁酸梭菌耐氧实验结果和显微形态的候选 菌株，申请人将该候选菌株命名为丁酸梭菌HDRyYBl，ClostridiumbutyricumHDRyYBl，于 2015年4月6日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心（CCTCC)保藏，其保 藏号为CCTCCNO:M2015200。
[0034] 本发明的丁酸梭菌HDRyYBl在RCM培养基中于有氧和无氧条件下的生长特性见图 1，其革兰氏染色和孔雀绿染色特性见图2。