一株用于固体发酵的酿酒酵母及其应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一株用于固体发酵的酿酒酵母及其应用。
【背景技术】
[0002] 酵母培养物是指酵母菌在特定的培养基上经过充分的发酵后形成的微生态产品， 它主要由酵母细胞外代谢产物、经过发酵后变异的培养基和少量的酵母细胞所构成。代谢 产物是对细胞外各类代谢物的总称，包括肽、有机酸、寡糖、氨基酸、增味物质和芳香物质 等，还包括其他对促进动物生长有益的"未知生长因子"等物质。酵母培养物的功能可概括 为：通过向寄宿在动物胃肠道内的微生物提供额外的营养底物来刺激它们代谢活性和维护 内生态环境的相对稳定。以往的科学研究和生产应用实践证明，酵母培养物中所含有的细 胞外代谢产物可明显提高动物的生产性能、优化饲料的营养价值、改善动物的健康状态。酵 母培养物作为饲料添加剂可以改善动物的肠道菌群，抑制致病菌的繁殖，提高动物的免疫 力，增强对疾病的抵抗能力，同时可以改善动物的血液生化指标，促进动物生长。因此，酵母 培养物对于改善动物生产性能和降低养殖成本有着十分积极的意义。
[0003] 但目前的酵母培养物产品存在质量参差不齐，使用效果也不稳定等问题，亟需开 发质优价廉的品牌性产品。通过加强对酵母培养物作用机理的深入研究，充分利用丰富的 酵母菌资源，开发得到生物量高、代谢产物丰富的新菌株，并进一步通过优化发酵工艺，包 括液体和固体发酵工艺，研究发酵培养基的成分，高目的产物的表达，对于研发新型酵母培 养物产品具有十分重要的意义。
【发明内容】
[0004] 针对上述现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一株用于固体发酵的酿酒 酵母及其应用。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
[0006] -株用于固体发酵的酿酒酵母，该菌株命名为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)BLNJ03,已于2015年04月08日保藏于中国武汉市武汉大学的中国典型培养 物保藏中心（CCTCC)，其保藏编号为：CCTCC Ν0:Μ 2015209。
[0007] 本发明的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)BLNJ03的菌学特征如下：所述 酿酒酵母细胞呈圆形或椭圆形，大小为（3. 5 μ m~4. 5 μ m) X (7. 0 μ m~13. 0 μ m)，以多边 出芽方式进行无性繁殖，形成假菌丝；菌落呈乳白色，表面光滑湿润，有光泽或无光泽，边缘 整齐或菌丝状；化能异养型，能发酵葡萄糖、果糖和甘露糖，不发酵半乳糖、麦芽糖、乳糖、蜜 二糖；能同化尿素、铵盐和硝酸盐，不分解蛋白质和脂肪；兼性厌氧，有氧条件下，进行有氧 呼吸；无氧条件下，进行酒精发酵；最适生长温度30°C，最适生长pH为7. 0。
[0008] 本发明还提供了该酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)BLNJ03的固体发酵培 养方法，步骤为：将酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)BLNJ03的液体种子按4% -6% (体积分数）的接种量接种于固体发酵培养基中，发酵温度为28-30°C，有氧发酵时间为 36-60h，厌氧发酵时间为72-96h。本发明对发酵工艺进行了优化改进，采用两步两态法一一 液体深层发酵与固体发酵结合；有氧发酵与厌氧发酵相继进行，使其固体培养物中代谢产 物含量更加丰富。
[0009] 所述固体发酵培养基是由基质和水按lg: (0.5-0. 7)mL组成；其中，基质的组成 为：按质量百分比计，麸皮90%、玉米面3%、豆柏7%。本发明对固体发酵培养基中基质和 水的比例（即料水比）进行了优化，结果表明，过高和过低的料水比均不利于酵母菌的生 长，本发明将料水比控制在1:0. 5 -1:0. 7范围内，在该范围内培养得到的培养物中活菌数 较高。
[0010] 所述酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)BLNJ03的液体种子的制备方法，具体 步骤如下：
[0011] (1)向三角瓶中装入1/4-1/5体积的酵母菌液体培养基，灭菌，冷却后用接种环 接种两环固体斜面酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)BLNJ03, 30°C摇床200rpm培养 20h，得到一级种子酿酒酵母菌液；
[0012] (2)向种子罐中加入2/5-3/5体积的酵母菌液体培养基，实消温度为121°C，时间 为30min ;待培养基温度降为30°C时，按1. 5% (体积分数）接种一级种子酿酒酵母菌液， 培养温度28-30°C，罐压0. 05MPa，搅拌转速70-90rpm，培养14-20h ;
[0013] 步骤（1)和步骤（2)中，所述酵母菌液体培养基的组成为：葡萄糖2%、蛋白胨 1 %、酵母膏〇. 5%、磷酸氢二钾0. 2%、泡敌0. 05%，所述百分含量均为质量百分含量，纯净 水配制，pH值7.0。
[0014] 步骤⑴中，灭菌的条件为：121°C灭菌30min。
[0015] 本发明还进一步提供了酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)BLNJ03的发酵培 养物在水产动物和/或反刍动物养殖中的应用。
[0016] 本发明还提供了一种饲料添加剂，以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae) BLNJ03的发酵培养物为有效成分。
[0017] 具体的，该饲料添加剂是在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae) BLNJ03的发酵 培养物中添加4%。（质量分数）的高活性产朊假丝干酵母混合而成，复配后混合物中酵母菌 活菌数不低于5X10scfU/g。
[0018] 本发明的有益效果：
[0019] 本发明筛选出了一株用于固体发酵的酿酒酵母BLNJ03,该菌株具有高生物量、传 代稳定等优点；在固体发酵中，其氨基酸、有机酸等代谢产物产量较其他酵母菌固体发酵物 高。将酿酒酵母BLNJ03固体发酵培养物应用于草鱼，可显著提高生长指标、消化指标及免 疫指标；应用于奶牛可增加产奶量；应用于肉牛、肉羊可显著提高其生产性能。
【附图说明】
[0020] 图 I :BLNJ03 酿酒酵母 chromosome XII sequence 电泳图；
[0021] 图2 :酿酒酵母BLNJ03在发酵罐中培养的生长曲线；
[0022] 图3 :培养基初始pH对固体发酵活菌数的影响。
【具体实施方式】
[0023] 结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本 发明，并不对其内容进行限定。
[0024] 实施例 1 :酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)BLNJ03 的分离筛选
[0025] 1材料与方法
[0026] I. 1 材料
[0027] I. I. 1采样地点及样品类型
[0028] 分别从平度大泽山向阳山坡的两处葡萄架下采集了土壤样品。
[0029] I. 1. 2主要仪器设备
[0031] 1.1. 3 培养基
[0032] I. I. 3. 1分尚培养基
[0033] 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA培养基）：蔗糖20g，马铃薯200g，链霉素20mg，琼 脂粉 15g，水 lOOOmL，ρΗ7· 0,121°C 灭菌 20min。
[0034] I. I. 3· 2纯化培养基
[0035] 酵母浸出粉胨葡萄糖固体培养基（YPD培养基）：葡萄糖4g，蛋白胨4g，酵母膏2g， 琼脂粉 15g，蒸馏水 100mL，ρΗ4· 5,115°C灭菌 20min。
[0036] I. I. 3· 3液体发酵培养基
[0037] 葡萄糖20g、蛋白胨10g、酵母膏2g、磷酸二氢钾lg，水1000mL，pH值7. 0,121°C灭 菌 20min〇
[0038] 1. 2试验方法
[0039] I. 2. 1酵母菌的分离及纯化
[0040] 采用富集培养法进行酵母菌的分离。将样品在超净工作台中打开，用灭菌的药匙 获取样品IOg左右，加入到一个盛有40mL无菌水的带玻璃珠的三角瓶中，30°C振摇30min， 将样品充分打散、混匀。然后吸取ImL的液体加入到含链霉素的PDA液体培养基中，30°C摇 床培养1天，吸取ImL的培养液接种到一新的含链霉素的PDA液体培养基中，30°C摇床培养 1-2天。用接种针蘸取培养液在含链霉素的固体PDA培养基上进行4区划线。30°C培养箱 中倒置培养2-3天，挑取形态不同的酵母菌菌落在YH)培养基上进行划线纯化，将纯化好的 的菌株接入斜面备用。
[0041] 1. 2. 2酵母菌生物量的测定
[0042] 将分离到的酵母菌分别接入液体发酵培养基中，30°C摇床培养20h，取发酵液 3500g离心10min，收集菌体，蒸馏水洗涤3次，收集菌体，冷冻干燥后称重即得（g/100mL)。
[0043] L 2. 3菌株筛选
[0044] 挑选出15株菌落生长迅速、革兰氏染色镜检符合酵母菌特征的单菌株，经测定生 物量试验后，筛选出3株生物量较高者，在PDA斜面培养基传5代后（观察其稳定性），并与 初始菌株分别在三角瓶中发酵，以生物量为指标进行复筛，筛选出1株生物量高且稳定的 菌株。
[0045] 1. 2. 4菌株鉴定
[0046] 鉴定方法：菌种鉴定采用chromosome XII sequence的PCR鉴定法， 具体方法如下：酵母菌chromosome XII sequence基因片段扩增的引物序列 为：CXSl :5' -CACAGAAATCTCTCACCG-3'（如序列表中 SEQ ID NO. 1 所示），CXS2 : 5' -TTATGATATGCTTAAGTTC-3'（如序列表中SEQ ID NO. 2所示），序列由上海生物工程技术 服务有限公司合成。PCR 反应体系为：dNTP Mixture 4yL，5XPrime STAR Buffer 10yL， 上下游引物各 0.6 μ L，基因组模板 0.8 μ L，Prime STAR HS DNA Polymerase 0.6 μ L，用无 菌去离子水补充至 50yL。PCR 循环参数为：95°C 5min ;94°C lmin，52°C 15s，72°C 2min，30 个循环；72°C10min。将BLNJ03菌株的chromosome XII sequence基因目的片段切胶回收 (TAKARA胶回收试剂盒），送TAKARA测序，测序结果登