一种在蚕蛹上产孢梗束的蝙蝠蛾拟青霉菌株及其培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物领域，涉及一种在蚕蛹上产孢梗束的蝙蝠蛾拟青霉菌株及其培 养方法。
【背景技术】
[0002] 冬虫夏草[Ophiocordyceps sinensis (Berk.) G. H. Sung, J. M. Sung, Hywel_Jones& Spatafora ( ^Cordyceps sinensis (Berk. )Sacc.)]为我国传统名贵药材和滋补品，但是其 天然产量十分有限，因此寻找其替代品，满足人们的健康需求，缓解人类需求对自然资源压 力具有十分重要的意义。
[0003] 蝙蝠蛾拟青霉（卩&6(：;[101115^68116卩1&11(>).1'.01611&1?.( >).0&16叉1?.(>).0&;[，父· M. Li, A. J. Shao, Shu F. Lin, J. L. Lan, Wei H. Chen&C. Y. Shen)为中国中医研究院中药研究 所戴如琴等1989年从云南迪庆采集的冬虫夏草上分离得到拟青霉属新种，该分离菌种与 天然冬虫夏草的主要成分、药理作用基本相似。戴如琴等在1993年申请并获得国家专利， 专利号为93104709。中国医学科学院药物所有关人员从青海化隆分离得到蝙蝠蛾拟青霉 Cs-4菌株，已经在江西国药厂（现江西济民可信集团）发酵生产并制成国家中药一类新药 "金水宝"胶囊，具有"补益肺肾，秘精益气。用于肺肾两虚，精气不足，久咳虚喘，神疲乏力， 不寐健忘，腰膝酸软"等功效。2014年金水宝年产值已达22亿人民币。
[0004] 然而目前为止，蝙蝠蛾拟青霉的产品仅限于液体发酵菌丝体。蝙蝠蛾拟青霉菌株 来源于天然冬虫夏草标本，将其接种于昆虫虫体上，将更接近于其天然状态，而且对于真菌 而言，人工培养子实体或孢梗束其有效成分及药理功效都与液体发酵菌粉不同，但是目前 还没有蝙蝠蛾拟青霉菌株在蚕蛹上培养形成子实体或孢梗束的报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种在蚕蛹上产孢梗束的蝙蝠蛾拟青霉菌株及其培养方法。
[0006] 本发明所提供的蝙蝠蛾拟青霉具体为蝙蝠蛾拟青霉（Paecilomyces hepiali) DCH-60,已于2015年6月5日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保 藏编号为 CGMCC No. 10901。
[0007] 所述編幅蛾拟青霉（Paecilomyces hepiali)DCH-60CGMCC No. 10901 分离自天然 冬虫夏草标本。冬虫夏草标本于2013年采集自青海玉树地区，在马铃薯葡萄糖琼脂培养 基（PDA) 25°C培养2周，菌落直径5cm左右，菌落正面白色粉状，中部微突起，背面中部淡黄 色。菌丝有隔，透明，直径1.2-4μπι;分生孢子梗直接生于气生菌丝上，单生、对生或轮生， (5. 0-23) X (1. 5-3. 0) μ m ;分生孢子单细胞，透明，卵形，（2. 0-3. 0) X (1. 2-2. 0) μ m。
[0008] 培养所述蝙蝠蛾拟青霉（Paecilomyces hepiali)DCH_60得到的孢梗束也属于本 发明的保护范围。
[0009] 本发明所提供的培养所述蝙蝠蛾拟青霉（Paecilomyces hepiali)DCH-60获得孢 梗束的方法，是将所述蝙蝠蛾拟青霉（Paecilomyces hepiali)DCH-60接种于蚕蛹进行培 养，从而获得所述孢梗束。
[0010] 具体而言，所述方法可包括如下步骤：
[0011] (1)将所述蝙蝠蛾拟青霉（Paecilomyces hepiali)DCH_60的孢子接种于活蚕蛹 的蛹体内，每个所述活蚕蛹接种2 X IO5~8 X 10 5个（如5 X 10 5个）所述孢子；
[0012] (2)将步骤（1)接种后的所述蚕蛹置于15-20°C (如20°C )、黑暗下培养7-15天 (如15天），得到僵化蚕蛹；
[0013] (3)将步骤（2)所得的僵化蚕蛹置于18-25°C (如20°C )、空气相对湿度70-90% (如空气相对湿度80% )、光照下培养25-40天（如30天），从蚕蛹中上长出2-10cm长的 孢梗束，即可采收，然后进行阴干或冻干或烘干。
[0014] 在所述方法的步骤（3)中，所述光照的光强具体可为200-10001ux (如4001ux)。
[0015] 在所述方法中，所述蚕蛹为活的桑蚕蛹或柞蚕蛹。具体是无病、健壮、有活力、未发 育的活蛹，可用清水冲洗干净晾干后备用（不需灭菌处理）。
[0016] 在所述方法的步骤（1)中，所述蝙蝠蛾拟青霉（Paecilomyces hepiali)DCH_60的 孢子可按照包括如下步骤的方法制备获得：
[0017] (al)将所述蝙蝠蛾拟青霉（Paecilomyces hepiali)DCH_60的斜面菌种转接至马 铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上，18-25Γ (如20°C )静置培养10-20天（如14天），得到活 化菌种；
[0018] 其中，所述马铃薯葡萄糖琼脂培养基是按照包括如下步骤的方法制备获得的：制 备每1000 ml所述马铃薯葡萄糖琼脂培养基，取200g 土豆煮汁，过滤，加入20g葡萄糖，20g 琼脂，定容至l〇〇〇ml。
[0019] (a2)将步骤（al)获得的活化菌种接种于土豆汁葡萄糖液体培养基，18-25Γ (如 20°C ) 100-200转/分钟（如150转/分钟）振荡培养4-6天（如6天）后，用4-8层（如 4层）纱布过滤培养液（所述纱布的孔径为50目），去除菌丝体，得到含有所述蝙蝠蛾拟青 霉（Paecilomyces hepiali)DCH_60 的孢子的滤液。
[0020] 其中，所述土豆汁葡萄糖液体培养基按照包括如下步骤的方法制备获得的：制备 每1000 ml所述土豆汁葡萄糖液体培养基，取200g 土豆煮汁，过滤，加入20g葡萄糖，定容至 1000 ml0
[0021] 相应的，所述方法的步骤（1)具体为：用注射器将所述滤液注射到所述活蚕蛹的 蛹体内，使每个所述活蚕蛹接种2 X IO5~8 X 10 5个所述孢子，每个所述活蚕蛹中的所述滤 液的注射量为0.2-0. 5ml。
[0022] 所述蝙蝠蛾拟青霉（Paecilomyces hepiali)DCH_60或所述孢梗束在制备保健品 中的应用也属于本发明的保护范围。
[0023] 所述蝙蝠蛾拟青霉（Paecilomyces hepiali)DCH_60或所述孢梗束在生产腺苷中 的应用也属于本发明的保护范围。
[0024] 本发明从天然冬虫夏草上分离得到一株蝙蝠蛾拟青霉新菌株一一蝙蝠蛾拟青霉 (Paecilomyces hepiali)DCH_60,并在蚕蛹上培养得到了孢梗束，简单可行，成本低，其其 中腺苷含量高达〇. 21 ±0. 01 % (质量百分含量），远远高于《中华人民共和国药典》2015年 版规定的冬虫夏草腺苷含量0.010% (质量百分含量）。本发明对相关保健食品或药品的 开发具有重要意义，有着较好的应用前景。
[0025] 保藏说明
[0026] 建议分类命名：蝙蝠蛾拟青霉
[0027] 拉丁名：（Paecilomyces hepiali)
[0028] 参椐的生物材料：DCH-60
[0029] 保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0030] 保藏机构简称=CGMCC
[0031] 地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
[0032] 保藏日期：2015年6月5日
[0033] 保藏中心登记入册编号：CGMCC No. 10901
【附图说明】
[0034] 图1为本发明蝙蝠蛾拟青霉（Paecilomyces h印iali)DCH_60在PDA培养基上培 养性状（正面）。
[0035] 图2为本发明蝙蝠蛾拟青霉（Paecilomyces h印iali)DCH_60在PDA培养基上培 养性状（反面）。
[0036] 图3为本发明蝙蝠蛾拟青霉（Paecilomyces hepiali)DCH-60在蚕蛹上培养得到 的孢梗束。
[0037] 图4为其他蝙蝠蛾拟青霉菌株在蚕蛹上培养的照片。
[0038] 图5为蝙蝠蛾拟青霉蚕蛹孢梗束和腺苷标准品的HPLC图谱。其中，A为蝙蝠蛾拟 青霉蚕蛹孢梗束，保留时间15. 830min ;B为腺苷标准品，保留时间15. 969min。
【具体实施方式】
[0039] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0040] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0041] 实施例1、蝙蝠蛾拟青霉（Paecilomyces h印iali)DCH-60的获得及鉴定
[0042] 本发明菌株DCH-60分离自天然冬虫夏草标本（冬虫夏草标本于2013年采集自青 海玉树地区），通过对其菌落、菌丝和分生孢子体形态特征的观察，结合细胞核rDNA-ITS测 序，对该菌株进行分类鉴定。
[0043] 一、形态学特征
[0044] 将菌株DCH-60在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA)上25°C培养2周，菌落直径5cm 左右，菌落正面白色粉状，中部微突起，背面中部淡黄色，见图1和图2。菌丝有隔，透明，直 径1. 2-4 μm ;分生孢子梗直接生于气生菌丝上，单生、对生或轮生，（5. 0-23) X (1. 5-3. 0) μ m ;分生孢子单细胞，透明，卵形，（2. 0-3. 0) X (1. 2-2. 0) μ m。
[0045] 二、分子生物学特征
[0046] rDNA-ITS 序列作为条形码（Schoch, C. L. et al. Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS)region as a univ