[0035] 二、丁酸梭菌HDRyYBl的生理生化鉴定
[0036] 对筛选出的丁酸梭菌HDRyYBl进行体外抑菌试验，通过一系列的生化实验，进一 步进行种的鉴定。包括：木糖、蔗糖、乳糖、淀粉、明胶、葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、棉籽糖、甘露 醇、鼠李糖、蜜二糖、松三糖。将鉴定结果（见表1)与《伯杰氏细菌鉴定手册》中关于丁酸 梭菌属种间鉴别的描述相对照。初步确定分离株HDRyYBl是丁酸梭菌。
[0037] 表1 丁酸梭菌HDRyYBl生化鉴定结果
[0038]
[0039] 三、分离菌株种的确证
[0040] 在上述鉴定的基础上，进一步对上述梭菌分离株HDRyYBl进行16SrRNA基因序列 检测和种特异性基因检测，对菌株所属的种进行确证鉴定（见序列表SEQIDN0 :1所述的 序列）。
[0041] (一）分离株基因组提取步骤：
[0042] (1)分别取lmL分离株HDRyYBl纯培养物，加入1. 5mLEP管中，室温8000rpm离心 5min，弃上清，沉淀重新悬浮于lmLTE(pH8. 0)中。
[0043] (2)加入 6yL50mg/mL的溶菌酶，37°C作用 2h。
[0044] (3)再加2厘恥(：150 1^，10%十二烷基硫酸钠（303)110 1^，2011^/1^的蛋白酶1( 3yL，50°C作用3h或37°C过夜。
[0045] (4)将菌液均分到两个1. 5mLEP管，加等体积的酚：氯仿：异戊醇（体积比为 25 : 24 : 1)，混匀，室温放置5-10min;12000rpm离心lOmin;如此重复抽提两次。
[0046] (5)加0? 6倍体积的异丙醇，混勾，室温放置lOmin。12000rpm离心lOmin。
[0047] (6)用75 %的乙醇洗涤沉淀。风干后，溶于50yLddH20中，加入1yLlOmg/mL RNaseA，37°C消化 2-3h。
[0048] (7)取2-5yL电泳检测。贮存于-20 °C备用。
[0049] (二）扩增16SrRNA基因的引物设计：
[0050] 参照已发表的丁酸梭菌菌16SrRNA基因序列（基因登录号AB687551. 1)，应用 Primer5. 0分析软件设计引物，引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成，引物的DNA 序列如下所述：
[0051] 正向引物F: 5 ' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3 '，
[0052] 反向引物R: 5 ' -GGTTACCTTGTTACGACTT- 3 '。
[0053] (三）PCR扩增 16SrRNA基因
[0054] 以上述引物对分别扩增上述分离株基因组的16SrRNA基因。反应体系见表2。PCR 程序为：94°C5min, 94°Clmin, 61. 5°Clmin, 72°C1. 5min，30 个循环后 72°C延伸lOmin。取 PCR产物在0.8%的琼脂糖凝胶（含溴化乙锭）上进行电泳检测，扩增得到的目的片段大小 约为1500bp的特异性条带（见序列表SEQIDNO: 1所述的序列）。用DNA纯化试剂盒（购 自TIANGEN公司）回收目的片段，送至北京擎科新业生物技术有限公司测序。将测序结果 在NCBI数据库中进行Blast比较。检索发现，本发明分离的HDRyYBl菌株的16SrRNA与 已报道的丁酸梭菌的序列（KC195777. 1)同源性最高，相似性为99%，序列参见SEQIDNO: 1 ( 丁酸梭菌菌株HDRyYBl的16SrRNA基因部分序列）。
[0055] 表 2 丁酸梭菌HDRsEf16SrRNA的PCR体系
[0056]
[0057] (四）PCR扩增 16S-23SrRNA间隔序列
[0058] Nakanishi等[1]利用16S-23SrRNA间隔序列的差异性设计了一套丁酸梭菌的特 异引物，本发明参照其引物序列，以上述丁酸梭菌基因组为模板，扩增种特异性片段。
[0059] 引物对的DNA序列如下：
[0060] 正向引物F1:5 ' -CCTCCTTTCTATGGAGAAATCTAGCA- 3 '
[0061] 反向引物F2:5 ' -TGTAGCTTGACCTTTTTAAGTTTTGA- 3 '
[0062] ?0?程序为：94￡€51^11，941€3〇8,55 1€3〇8,721€3〇8,30个循环后72°(：延伸1〇111111。
[0063] 取PCR产物在0? 8 %的琼脂糖凝胶（含溴化乙锭）上进行电泳检测，扩增的目的 片段大小约为260bp(见序列表SEQIDN0:2所述的序列）。用DNA纯化试剂盒（购自 TIANGEN公司）回收目的片段，送至北京擎科新业生物技术有限公司测序。将测序结果在 NCBI数据库中进行Blast比较。检索发现，本发明分离的HDRyYBl菌株的16S-23SrRNA 间隔序列特异性片段与已报道的丁酸梭菌的16S-23SrRNA间隔序列（AB178159. 1)同源性 最高，相似性为100%，序列参见SEQIDNO:2( 丁酸梭菌菌株HDRyYBl的16S-23SrRNA间 隔序列特异性片段序列）。由此表明从本发明分离的丁酸梭菌HDRyYBl中能扩增出丁酸梭 菌16S-23SrRNA间隔序列特异性片段，进一步证明了本发明的分离株HDRyYBl为丁酸梭菌 (Clostridiumbutyricum)〇
[0064] 实施例2 :丁酸梭菌HDRyYBl对肠道致病菌抑制作用和对有益菌的增殖作用 [0065] 以猪霍乱沙门氏菌C78_l(购自中国兽医药品监察所）和猪致病性大肠杆 菌0157 (保藏号ATCC35150,购自中国农业微生物菌种保藏中心）、金黄色葡萄球菌 (ATCC25923,购自卫生部临检中心）为致病菌指示菌，以屎肠球菌HDRsEfl(专利公开 号：CN102747003A)和双歧杆菌（购自中国工业微生物菌种保藏中心，保藏号CICC6165,以 下简称双歧杆菌）这些媒介菌株为有益菌的指示菌（实施本发明并不限于上述菌株，只要 是同类菌株就可以）进行平行测试，对本发明的丁酸梭菌菌株HDRyYBl对肠道致病菌抑制 作用和对益生菌的增殖作用进行了系统比较研究。
[0066] 具体步骤如下：
[0067] 丁酸梭菌HDRyYBl活化：将其冻干菌粉于RCM琼脂平板上划线，置厌氧培养箱中厌 氧培养24h，挑取单菌落接种于装有RCM液体培养基中，静置厌氧培养箱培养36h，置80°C水 浴lOmin后转接小三角瓶，接种量为5% (v/v)，37°C培养16h，使其处于对数生长期备用。 [0068] 致病菌的活化：将保存的金黄色葡萄球菌、猪霍乱沙门氏菌C78-1、猪致病性大肠 杆菌0157转接斜面试管，37°C培养18h备用。
[0069] 益生菌的活化：将双歧杆菌、屎肠球菌的菌种分别接种于MRS液体培养基（购自美 国BD公司）、TPY液体培养基（购自美国BD公司），37°C静置厌氧培养24h备用。
[0070] 发酵液的制备和处理：将丁酸梭菌HDRyYBl菌液按2 % (v/v)接种于RCM液体培 养基中，静置厌氧培养48h，，10000rpm、30min离心，离心取上清液，再离心一次，收集上清， 4°C备用，
[0071] -、对肠道致病菌的抑菌作用
[0072] 将丁酸梭菌HDRyYBl分别与动物肠道致病菌猪致病性大肠杆菌0157和猪霍乱沙 门氏菌C78-1共培养，以研究丁酸梭菌HDRyYBl对动物肠道致病菌的抑制作用。
[0073] 1.试验方法：将活化好的大肠杆菌0157、猪霍乱沙门氏菌C78-1菌液稀释至 105-106CFU/ml，然后以10 %的接种量接种于RCM液体培养基中，再分别接入相同接种量的 丁酸梭菌HDRyYBl培养液进行混合培养，同时分别以大肠杆菌0157:H7、沙门氏菌单独培养 物作为对照，37°C静置厌氧培养24h，每4h取样检测各混合培养组、单独培养组的活菌数。 各组3个平行，结果取平均值，比较试验结果。
[0074] 2?试验分组：
[0075] A组：大肠杆菌0157和丁酸梭菌菌株HDRyYBl混合培养组；B组：大肠杆菌0157单 独培养组；C组：猪霍乱沙门氏菌C78-1和丁酸梭菌菌株HDRyYBl混合培养组；D组：猪霍乱 沙门氏菌C78-1单独培养组。
[0076] 表3 丁酸梭菌菌株HDRyYBl对常见致病菌的抑制作用
[0077]
[0078] 3.试验结果（见表12):试验过程中，混合培养组（A组、C组和E组）的肠道致病 菌（大肠杆菌0157、猪霍乱沙门氏菌C78-1和金黄色葡萄球菌）的数量始终低于单独培养 组（B组、D组和F组），且随着培养时间的增加，活菌数差异逐步增大，在培养24h后，A组 与B组中大肠杆菌0157活菌数差异大3个数量级，C组与D组中沙门氏菌C78-1活菌数差 异大5个数量级，E组与F组中金黄色葡萄球菌活菌数差异大3个数量级。由此可见丁酸 梭菌HDRyYBl对大肠杆菌0157、猪霍乱沙门氏菌C78-1和金黄色葡萄球菌有极显著的抑制 作用。
[0079] 二、对肠道益生菌的促增殖作用
[0080] 将丁酸梭菌HDRyYBl的发酵上清按1:2的比例加入双歧杆菌、屎肠球菌适宜生长 的液态培养基中培养，以此研究丁酸梭菌HDRyYBl的发酵提取物在促进肠道益生菌增殖方 面的作用，
[0081] 1.试验方法：将丁酸梭菌HDRyYBl的发酵上清液作为营养成分，按体积比为1 : 2 的比例分别添加到屎肠球菌和双歧杆菌生长的MRS、TPY液体培养基中，同时以不添加丁 酸梭菌HDRyYBl发酵提取物的相同培养基作为对照。试验组和对照组以相同的种子菌液， 10%的接种量接种后，37°C静置厌氧培养24h，每4h取样检测各组培养液中双歧杆菌、屎肠 球菌的活菌数。各组3个平行，试验结果取平均值。
[0082] 2?试验分组：
[0083] A:屎肠球菌+ 丁酸梭菌HDRyYBl的发酵提取物混合培养组；B:屎肠球菌单独培养 组；C:双歧杆菌+ 丁酸梭菌HDRyYBl的发酵提取物混合培养组；D:双歧杆菌单独培养组。
[0084] 表4 丁酸梭菌HDRyYBl发酵提取物对肠道有益菌增殖的影响（单位：X106CFU/ mL)
[0085]
[0086] 3.试验结果：添加了丁酸梭菌HDRyYBl发酵提取物的混合培养组（A组和C组） 的屎肠球菌和双歧杆菌均生长良好。其中屎肠球菌活菌数，其混合培养组（A组）与单独培 养组（B组）在整个培养过程中的早期（0-8h)差异不明显，而在生长后期较为明显。培养 24h后，试验组活菌数比对照提高了 75. 2%，差异显著（P〈0. 05)。而双歧杆菌活菌数，在整 个培养过程中混合培养组（C组）活菌数均高于同条件下的单独培养组（D组），且在生长后 期尤为明显。培养24h后，试验组活菌数比对照提高了近1倍，丁酸梭菌菌株HDRyYBl发酵 提取物对双歧杆菌的增殖有明显的促增殖作用。
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