087] 综上所诉，本发明的丁酸梭菌HDRyYBl能抑制肠道致病菌的生长，促进有益菌群 增殖，从而调节肠道内菌群紊乱，维持动物机体的肠道菌落平衡。
[0088] 实施例3 :丁酸梭菌菌株HDRyYBl的安全性评价
[0089] 一、急性毒性试验
[0090] 参照中华人民共和国国家标准GB15193. 3-2003的方法进行最大耐受剂量的试 验。
[0091] 具体步骤是：将40只体重在19g_22g的昆明小鼠（购自湖北省疾病预防控 制中心）随机分为试验组和对照组，雌雄各20只。适应环境5天后，试验组小鼠灌胃 1. 6X109CFU/mL的活化丁酸梭菌HDRyYBl菌液0. 5mL，对照组小鼠灌胃0. 5mL的生理盐水， 连续观察8天。记录实验过程中小鼠体征、中毒表现和死亡情况。试验期满，将小鼠处死， 取出肝脏和脾脏，观察形态并称重，计算肝体比和脾体比。
[0092] 试验期间各组小鼠体征正常，未出现中毒和死亡现象；试验组小鼠体重持续增长， 与对照组比较无显著性差异，结果见表4 ;解剖后肉眼观察试验组与对照组脏器也无显著 差异，且菌株对小鼠脏器系数的影响结果（表5)表明菌株对小鼠肝脏、脾脏的影响与对照 组相比无显著性差异。
[0093] 表5急性毒性试验中小鼠体重变化
[0094]
[0095]
[0096] 注：P>0. 05,与对照组相比无显著性差异
[0097] 表6急性毒性试验中小鼠脏器系数的影响结果
[0098]
[0099] 注：P>0. 05,与对照组相比无显著性差异
[0100] 二、抗生素敏感性试验
[0101] 选取多粘菌素B、青霉素、四环素、强力霉素、氯霉素等几种常用抗生素药敏纸片 自（购自杭州微生物试剂有限公司）进行药敏试验。用5%脱纤维羊血的强化布氏培养 基（购自美国BD公司），以脆弱拟杆菌（购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏号 CICC10398)作为质控菌，试验判断标准参照CLSI(美国临床和实验室标准协会）的执行标 准（2013版）。试验步骤如下：
[0102] (1)用接种环在RCM琼脂平板上挑取丁酸梭菌菌落，接种于3~5mLRCM液体培养 基中，放于37°C厌氧培养箱静置培养；
[0103] (2)培养2~8h，以有黑字的白纸为背景，调整浊度至0. 5麦氏标准比浊管浊度。
[0104] (3)用无菌棉签蘸取菌液，并在管壁上挤去多余的菌液后涂布于5%脱纤维羊血 的强化布氏琼脂平板上，每次将平板旋转60度，最后沿周边绕两圈，反复几次，保证涂均 匀；
[0105] (4)待平板上的水分被琼脂完全吸收后，用无菌镊子取药敏纸片贴在平板表面，纸 片一贴就不可再拿起。每个平板贴5张纸片，每张纸片间距不少于24mm，纸片中心距平皿边 缘不少于15mm。
[0106] (5)贴上纸片15min内，把平板倒放在37°C厌氧培养24h后，测量抑菌圈直径。
[0107] 试验结果见表6, 丁酸梭菌HDRyYBl对大多数常用抗生素敏感，但对部分第三代头 孢菌素、部分氨基糖苷类抗生素和复方新诺明表现耐药。
[0108] 表7 丁酸梭菌HDRyYBl的抗生素敏感性试验结果
[0109]
[0110]
[0111] 注："S"表示敏感；"I"表示中介；"R"表示耐药
[0112] 上述试验急性毒性试验及抗生素敏感性试验等结果，表明丁酸梭菌HDRyYBl是安 全的。
[0113] 实施例4 :丁酸梭菌HDRyYBl的抗逆特性及生长特性
[0114] 一、抗逆性试验
[0115] (一）胆盐耐受性试验
[0116] 将丁酸梭菌HDRyYBl活化2代后，取lmL接种于9mL含0. 1 %，0. 3 %，0. 5 %胆盐 的RCM液体培养基中，37°C静置培养12h，将培养液分别作连续10倍稀释，从每一稀释度取 0.lmL涂于RCM平板，观察生长情况并进行菌落计数。结果显示该菌株在3个胆盐浓度下 经过12h的耐受实验，活菌数仍在同一数量级即108以上，而猪小肠内胆盐的质量分数在 0. 03%~0. 3%范围内波动，说明丁酸梭菌HDRyYBl能够耐受肠道胆盐环境。
[0117] 表8 丁酸梭菌HDRyYBl对胆盐的耐受性
[0118]
[0119] (二）耐酸试验
[0120] 将活化的丁酸梭菌HDRyYBl以2%的接种量分别接种pHL5、pH2. 5、pH3. 5、pH 4. 5的的RCM液体培养基中，37°C静置培养。取接种Oh，lh，2h，3h的培养液，平板稀释法进 行活菌计数。
[0121] 表9 丁酸梭菌HDRyYBl对不同pH值的耐受性
[0122]
[0123] 仔猪出生时胃中pH值一般在5~6,后因乳酸菌的定植使pH值逐渐下降至4左 右，2月龄前pH值保持在3左右。通常胃酸pH值在3. 0左右，流体食物在胃中停留的时间 为1~2h，进食后很短时间内，胃内pH值可以上升到6. 0左右。益生菌通过胃肠道时，食糜 作为一种保护剂使益生菌受到伤害的程度减小，一旦在穿越胃和十二指肠中能存活下来， 随同食糜进入回肠、盲肠的细菌会急剧增加。由试验结果可见菌株在低pH环境下，经历数 小时活菌数仍在同一数量级（表8)。由此可知，本发明的丁酸梭菌HDRyYBl在低pH值胃酸 环境下，存活机率很大，有足够多的细菌存活下来，进而能顺利到达肠道。
[0124] (三）高温耐受性试验。
[0125] 接种2%已活化的丁酸梭菌HDRyYBl在RCM平板上厌氧培养48h以形成芽孢，收集 菌体以3mL的量分装于细菌瓶中，分80°C10min、90°C5min两个处理组，37°C设为对照，定 时取样测定活菌数，计算存活率。
[0126] -般丁酸梭菌经高温处理后其活菌数下降迅速，但能产生芽孢以抵抗不适生长环 境，试验表明丁酸梭菌HDRyYBl在90°C高温处理5min，芽孢存活率为2. 69%，而在80°C高 温处理lOmin，芽孢存活率达到61. 11 %说明菌株具有良好的耐热性能，可以耐受饲料熟化 和制粒的高温，为其作为饲料添加剂应用提供便利（见表9)。
[0127] 表10 丁酸梭菌HDRyYBl对高温的耐受性
[0128]
[0129] 二、生长曲线的测定
[0130] 取20只装有RCM液体培养基的厌氧管，将活化的丁酸梭菌菌液以1 % (v/v)的量 接种到各试管中，37°C静置厌氧培养，每隔2h取出一支混匀后测其0D_值、pH值，并观察期 产气情况，绘制生长曲线、pH曲线。同时将8h、24h、36h、48h培养液各取一滴，革兰氏染色 后显微镜观察生长情况。
[0131] 表11 丁酸梭菌HDRyYBl不同时间的0D600值、pH值以及产气情况
[0132]
[0133] 结果表明，本发明分离的丁酸梭菌HDRyYBl在0-10h为其生长无迟缓期，第lOh进 入对数增长期，细菌快速繁殖，菌数呈指数上升，第14h后进入稳定期，此后细菌生长保持 动态平衡。同时菌株在l〇_12h开始明显产气，代谢产酸使培养基pH也随之下降。随着培 养时间的延长，菌体在由革兰氏阳性的粗大杆状菌体逐渐变成革兰氏阴性的梭状菌体，在 约24h芽孢开始形成，到48h时菌体形态已经不一致。芽孢菌在其生长过程中，由于生长环 境中营养物质的消耗与代谢产物的抑制，会形成芽孢以抵御不良环境，因此该菌株繁殖能 力较快，抗逆能力很强，能进行工业化的大规模发酵生产，其生长曲线及菌体形态见图5、6 及表10。
[0134] 三、粘附性试验
[0135] (1)IPEC-J2上皮细胞的培养：将IPEC-J2上皮细胞（简称细胞，该细胞是测试用 的媒介细胞，由华中农业大学农业微生物国家重点实验室何启盖老师课题组惠赠）维持生 长于含5%胎牛血清、0. 1%青霉素和0. 1%链霉素的DMEM/F12培养液中，在37°C、5%C02 气体条件下培养，隔日更换培养液。当细胞铺满培养瓶底时用〇. 25%胰酶-EDTA消化传代。 细胞以2X105个的密度接种6孔细胞培养板，培养液成分不加抗生素，粘附试验前12h更 换培养液。
[0136] (2)细菌培养：活化的丁酸梭菌转接RCM液体培养基中厌氧培养24h，离心后用 0. 01MpH7. 2PBS(赛默飞世尔生物化学制品有限公司）缓冲液洗涤1次，然后用DMEM/F12 基础培养液（赛默飞世尔生物化学制品有限公司）稀释至106CFU/mL的菌液待用。
[0137] (3)菌株粘附能力的测定：将培养24h的IPEC-J2上皮细胞用PBS(pH7. 2)缓冲 液清洗1次，每孔加入106CFU/mL的丁酸梭菌lmL，37°C孵育lh，用PBS缓冲液清洗4次， 去除未粘附的细菌，然后每孔加入300yL含0. 05%TritonX-100的PBS缓冲液，室温作用 lOmin，用吸管反复吹打以分散细菌，再加入700yLPBS缓冲液以终止反应。10倍系列稀释 后进行活菌计数，计算粘附率。结果显示菌株对IPEC-J2细胞具有粘附性（表11)，这为丁 酸梭菌HDRyYBl在肠道中的存活、定植奠定了基础。
[0138] 表12 丁酸梭菌HDRyYBl菌株对IPEC-J2细胞粘附试验结果
[0139]
[0140] 抵抗pH较低的胃酸环境以及对胆汁的耐受是筛选益生菌的首要指标，本发明的 丁酸梭菌HDRyYBl在很低pH值胃酸环境下，存活机率很大，有足够多的细菌存活下来，进而 顺利到达肠道，而本菌对肠道胆盐的耐受使其可在宿主肠道中最后顺利定殖并发挥益生作 用。
[0141] 另外，益生菌在菌液浓缩或制粒过程中，都要进行高温加热处理，因此，对高温的 耐受性成为选择益生菌菌株的另一个关键指标。本发明的丁酸梭菌HDRyYBl会形成芽孢以 抵御不良环境，且在80°C条件下lOmin芽孢存活率在60 %以上，这为丁酸梭菌HDRyYBl发 挥益生作用提供了有利条件。
[0142] 实施例5 :本发明作为微生物添加剂的应用实施例：肉鸡饲喂试验
[0143] 将丁酸梭菌HDRyYBl添加至肉鸡饲料中，目的是研究本发明菌株在肉鸡体内的益 生特性和本发明菌株对肉鸡抗病能力的影响。
[0144] 一.试验材料与分组
[0145] 试验肉鸡品种为1日龄的Cobb500白羽肉鸡，分为2组（表13)，鸡苗购自湖北荆 州正康家禽有限公司。丁酸梭菌HDRyYBl(有效活菌数2X109CFU/g)，饲喂试验所用饲料为 市售的全价料，本发明将丁酸梭菌HDRyYBl作为益生菌与基础日粮（市售产品）混合均匀 后进行加工制粒得到含丁酸梭菌HDRyYBl的益生菌剂（由湖北省当阳市正阳养殖合作社饲 料厂统一生产）。
[0146] 表13试验分组
[0147]
[0148] 二.试验过程
[0149] 饲喂试验在封闭式鸡舍内进行，采取TEMPTRON607A-C全自动系统（市售产品，请 说明厂家）对饲养环境进行控制，以