同菌株16SrRNA基因序列进行同源性比较，比 较结果显示所筛选出的SCL87菌株与唾液乳杆菌成员相似度最高，说明其为唾液乳杆菌。 [0041]LactobacillussalivariusSCL87 菌株的 16SrRNA序列如下：1221bp
[0042] GCCCGGTAGCGGCGGCTATAATGCAAGTCGAACGAAACTTTCTTACACCGAATGCTTGCATTCACCGTA AGAAGTTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTAAAAGAAGGGGATAACACTTGGAAACAGGTG CTAATACCGTATATCTCTAAGGATCGCATGATCCTTAGATGAAAGATGGTTCTGCTATCGCTTTTAGATGGACCCGC GGCGTATTAACTAGTTGGTGGGGTAACGGCCTACCAAGGTGATGATACGTAGCCGAACTGAGAGGTTGATCGGCCAC ATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATG GAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTCTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGAGAAGAACACGAGTGAGAGTAAC TGTTCATTCGATGACGGTATCTAACCAGCAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGC AAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGGGAACGCAGGCGGTCTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAA CCGGAGTAGTGCATTGGAAACTGGAAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGC GTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAAGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGTTCGAAAGCGTGGGT AGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAACGATGAATGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAG TGCCGCAGCTAACGCAATAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGC CCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCCTTTGACC ACCTAAGAGATTAGGCTTTTCCCTTCGGGGACAAAGTGAACAGGTGGTTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGA GATGTTGGGTTAAAGTCCCCGCACGAGCGCACCCTTTGTTGTCAGTTGGCAGCATTAAGCGGGCCACCTCTTGGCGA GACTGGCCGGTGACAAACCGGTAGAATGTTGGGTACGACGTTCAAGTCATCATGCGCTTATGAACCTGGGGCTCo
[0043] 三、唾液乳杆菌SCL87的主要特性
[0044] (1)生物学形态特征
[0045] 菌体形态特征：菌体呈杆状，一般呈单个、成对或短链状存在，如图2所示。
[0046] 菌落形态特征：在MRS固体培养基（成分（g/L):蛋白胨10. 0,牛肉浸粉8. 0,酵母 浸粉4. 0,葡萄糖20. 0,磷酸氢二钾2. 0,柠檬酸氢二铵2. 0,乙酸钠5. 0,硫酸镁0. 2,硫酸锰 0. 04,琼脂14. 0,吐温801. 0，pH值6. 5±0. 2)上能形成乳白色的菌落，菌落圆形，边缘整齐， 不透明，不形成芽孢。
[0047] (2)生长特征：兼性厌氧生长，生长温度范围32~42°C(最适37°C)，生长pH范 围为pH6~8 (最适pH6. 5)。
[0048] (3)生长曲线
[0049] 复壮唾液乳杆菌，在MRS固体培养基上传代培养两次，再将菌株接种于MRS肉汤 (成分（g/L):蛋白胨10. 0,牛肉浸粉8. 0,酵母浸粉4. 0,葡萄糖20. 0,磷酸氢二钾2. 0,柠 檬酸氢二铵2. 0,乙酸钠5. 0,硫酸镁0. 2,硫酸锰0. 04,吐温801. 0,pH值5. 7±0. 2)，37°C 培养12h左右得到种子液。取种子液10yL分别接种于事先准备好的含等量MRS肉汤的10 个离心管中，于37°C静置培养。其间每隔2h轮流向每只离心管，漩涡混匀，用分光光度计检 测菌液的0D值，MRS肉汤调零，取500yL菌液检测0D_nni值，将实验结果绘制成SCL87的 生长曲线，如下图3所示。
[0050] 结果表明，唾液乳杆菌SCL87从第10h到第18h为对数增长期，20h后进入稳定期， 细菌几乎停止生长，活菌数量和凋亡数量处于一个平衡时。当乳酸菌在动物肠道内达到一 定数量时，在对动物无害的情况下，占有生长优势的乳酸菌会竞争性的抑制肠道中病原菌 的生长，其代谢产物如有机酸、过氧化氢等也可杀灭肠道病原菌。
[0051 ] 四、唾液乳杆菌SCL87对沙门氏菌的体外抑制作用
[0052] (1)牛津杯试验
[0053] 采用国内外测定抗生素效价通用方法及各国药典规定的方法--牛津杯定量扩 散法，来测定唾液乳杆菌的抑菌活力。
[0054] 将唾液乳杆菌SCL87、保加利亚乳杆菌（Lactobacillusbulgaricus)(购于美国 菌种保藏中心，编号ATCC393)、嗜酸乳杆菌（Lactobacillusacidophilus)(购于广东省 微生物菌种保藏中心，GIM编号：GIM1. 730)和植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum) (购于广东省微生物菌种保藏中心，编号ACCC11095)复壮，在MRS固体培养基上传代培养 两次，挑取单菌落接种于MRS肉汤，37°C，静置培养19~22h，10000r/min离心lOmin，上清 液经0. 22ym无菌微孔滤膜过滤后，4°C保存待用。取100yL1XlOlfu/mL经15h培养的 新鲜鼠伤寒沙门氏菌（Salmonellatyphimurium)(购于广东省微生物菌种保藏中心，编号 CMCC50115)LB肉汤菌液，放于37°C培养箱10min，待培养基表面水分蒸发完全。用无菌棉签 蘸取菌液均匀涂于LB(成分（g/L):胰蛋白胨10. 0,酵母浸粉5. 0,氯化钠10. 0,琼脂15. 0， pH值7. 0±0. 2)培养基表面，用镊子夹取牛津杯放置于平皿中，然后每个牛津杯中加入已 制备好的发酵上清液200iiL，200iiLMRS肉汤放于牛津杯作对照。然后将培养基平皿置于 37°C培养15~24h，观察牛津杯周围抑菌圈，并测量其直径。
[0055] 实验结果如下表1所示，与其它菌株相比，装有SCL87菌株发酵上清液的牛津杯周 围出现了明显的抑菌圈，抑菌圈直径为13mm左右，对照组MRS肉汤没有出现抑菌圈，说明该 唾液乳杆菌SCL87发酵上清液对鼠伤寒沙门氏菌的生长具有很好的抑制作用。
[0056] 表1菌株抑菌圈直径（mm)
[0057]
[0058] (2)竞争性抑制试验
[0059] 分别将新鲜培养出的鼠伤寒沙门氏菌（Salmonellatyphimurium)和唾液乳杆菌 SCL87划线接种于MRS固体培养基表面上，将培养基平皿置于37°C培养24h，结果发现，48h 后鼠伤寒沙门氏菌和唾液乳杆菌SCL87都能在MRS培养基生长，且都生长旺盛。与唾液乳 杆菌SCL87菌落不同，MRS培养基上的鼠伤寒沙门氏菌菌落呈微透明状，湿润，边缘整齐，而 菌株SCL87菌落为边缘整齐的乳白色，从菌落的形态和色泽可以在MRS培养基上肉眼区分 沙门氏菌和唾液乳杆菌，唾液乳杆菌SCL87与鼠伤寒沙门氏菌CMCC50115在MRS固体培养 基上的生长情况如图4所示。基于以上基础，可以做如下竞争抑制试验：
[0060] ①正向竞争试验
[0061] 将培养出的新鲜唾液乳杆菌SCL87划线接种于MRS固体培养基上，37°C培养24h， 24h后取出培养皿，将已准备好的新鲜鼠伤寒沙门氏菌100yLIXK^cfu/mL均匀涂布在长 有唾液乳杆菌SCL87的MRS固体培养基上，再将培养皿放入37°C培养箱，48h后观察MRS固 体培养基上细菌的生长情况。
[0062] 观察结果发现MRS固体培养基上只长有乳白色的唾液乳杆菌菌落，没有微透明的 鼠伤寒沙门氏菌菌落，为进一步确定MRS固体培养基上没有活的鼠伤寒沙门氏菌，用灭菌 的接种环粘取涂过鼠伤寒沙门氏菌的MRS固体培养基表面，然后划线于SS固体培养基（成 分（g/L):牛肉浸粉5. 0,月示胨5. 0,乳糖10. 0,三号胆盐8. 5,枸橼酸钠8. 5,硫代硫酸钠 8. 5,枸橼酸铁1. 0,中性红0. 025,煌绿0. 00033,琼脂17. 0)上，37°C培养24小时，24h后观 察SS培养基，结果发现SS培养基上没长任何菌落。
[0063] 以上结果证明唾液乳杆菌SCL87对沙门氏菌有很好的竞争性防御效果，可能的原 因是唾液乳杆菌在MRS固体培养基上分泌的有机酸和过氧化氢创造了一个酸性环境，抑制 了沙门氏菌的生长。
[0064] ②反向竞争试验
[0065] 将培养出的新鲜鼠伤寒沙门氏菌划线接种于MRS固体培养基上，37°C培养24h， 24h后取出培养皿，将已准备好的100yL新鲜唾液乳杆菌SCL873X10scfu/ml均匀涂布在 长有鼠伤寒沙门氏菌的MRS固体培养基上，再将培养皿放入37°C培养箱，24h后观察MRS固 体培养基上细菌的生长情况。
[0066] 观察结果发现在微透明的鼠伤寒沙门氏菌菌落周围出