一株植物乳杆菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株植物乳杆菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 中国传统发酵食品历史悠久，风味独特，备受消费者的青睐。传统发酵食品包括发 酵蔬菜、发酵肉制品、发酵乳制品、白酒及发酵调味品等，是我国食品工业的重要组成部分。 传统发酵食品中的乳酸菌不仅有利于改善发酵食品的风味、口感和质地等，一些乳酸菌还 具有优良的益生特性。
[0003] 长白山地区优越的地理环境造就了当地丰富的自然资源，形成了极具特色的发酵 食品，如泡菜、咸菜等。经过长期的自然驯化，乳酸菌成为这些传统美食中的优势菌群，是益 生菌的良好来源。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一株植物乳杆菌及其应用。
[0005] 本发明提供的植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum)NC301，已于2015年06月 23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市 朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏登记号为CGMCCN0. 11013。 植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum)NC301CGMCCNO. 11013,简称植物乳杆菌NC301。
[0006] 植物乳杆菌NC301在制备用于调节肠道菌群的产品中的应用也属于本发明的保 护范围。所述"用于调节肠道菌群的产品"的功能为（a)和\或（b)和\或（c)和\或⑷： (a)促进乳杆菌增加；(b)促进双歧杆菌增加；（c)促进肠球菌减少；（d)促进肠杆菌减少。
[0007] 本发明还保护一种用于调节肠道菌群的产品，其活性成分为植物乳杆菌NC301。所 述"用于调节肠道菌群的产品"的功能为（a)和\或（b)和\或（c)和\或（d):(a)促进 乳杆菌增加；(b)促进双歧杆菌增加；（c)促进肠球菌减少；(d)促进肠杆菌减少。
[0008] 本发明还保护植物乳杆菌NC301在制备抗氧化剂中的应用。所述抗氧化剂的功能 为清除自由基。所述自由基为羟自由基和\SDPPH自由基和\或超氧阴离子自由基。
[0009] 本发明还保护一种抗氧化剂，其活性成分为植物乳杆菌NC301。所述抗氧化剂的功 能为清除自由基。所述自由基为羟自由基和\SDPPH自由基和\或超氧阴离子自由基。
[0010] 本发明还保护植物乳杆菌NC301在制备食品、保健品或药品中的应用。所述食品 具体可为酸奶。
[0011] 本发明从传统发酵辣白菜中分离得到了一株植物乳杆菌，通过体外酸耐受和胆盐 耐受、黏附能力、抗氧化作用及改善肠道功能和调节肠道菌群等试验，证实了该菌株是一株 具有潜在益生特性的优良乳酸菌新菌株，可以作为调节肠道菌群、改善肠道功能的益生菌 应用于食品、保健品和药品领域，应用前景十分广阔。
【附图说明】
[0012] 图1为植物乳杆菌NC301在光学显微镜下的照片。
[0013] 图2为植物乳杆菌NC301在透射电镜下的照片。
[0014] 图3为植物乳杆菌NC301对肠道主要菌群的调节能力。
【具体实施方式】
[0015] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平 均值。牛胆粉：河南利伟生物药业股份有限公司，产品编号为P333004,CAS号为8008-63-7。 Caco-2细胞：中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。
[0016]BCP液体培养基：酵母膏2. 5g/L、蛋白胨5g/L、葡萄糖5g/L、溴甲酚紫0.04g/L，溶 剂为水，PH7. 0 ;121°C灭菌15min。在BCP液体培养基的基础上添加琼脂至15g/L，即为BCP 固体培养基。
[0017]MRS液体培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、KH2P042g/L、乙酸钠 5g/L、柠檬酸钠 5g/L、MgS04 ? 7H20 0? 2g/L、MnS04 ? 4H20 0? 05g/L、吐温 801mL、葡萄糖 20g/ L，溶剂为水，pH6. 6 ;121°C灭菌15min。在MRS液体培养基的基础上添加琼脂至15g/L，即为 MRS固体培养基
[0018] pH7. 2 的PBS缓冲液的制备方法：NaCl8g，KC1 0? 2g，Na2HP04l. 42g，K2HP040 . 27g， 加水定容至1L，浓盐酸调pH7. 2。
[0019]pH7. 4 的PBS缓冲液的制备方法：NaCl8g，KC1 0?2g，Na2HP04l.42g，K2HP040. 27g， 加水定容至1L，浓盐酸调pH7. 4。
[0020] 鼠李糖乳杆菌LGG，为一株现有的益生菌，用LGG表示。提及鼠李糖乳杆菌LGG的 文献：张齐麟、马春丽、李艾黎、曹楠、宋兰兰，鼠李糖乳杆菌LGG在Cottage干酪中的应用， 《食品工业》2015年04期。
[0021] 实施例1、菌株的分离和鉴定
[0022] 用于菌株分离的样品为中国延边地区的传统发酵辣白菜。
[0023] 经BCP固体培养基平板反复划线培养，挑取产黄圈的单菌落接种于MRS固体培养 基平板上继续培养，经MRS固体培养基平板反复划线培养纯化，得到多株纯培养的菌株。其 中一株均命名为NC301菌株。
[0024] 二、菌株的鉴定
[0025] NC301菌株在光学显微镜下的照片见图1。菌体细胞呈圆端直杆状，大多数为单 个、成对或呈细胞链。
[0026]NC301菌株在透射电镜下的照片见图2。长杆状，细胞壁、细胞膜完整，胞质均匀。
[0027] NC301菌株为不运动的杆菌。
[0028]NC301菌株最适生长温度37~42 °C，适宜pH为5. 0~7. 0。
[0029]NC301菌株的生理生化特征：革兰氏阳性，过氧化氢酶阴性，在15°C和45°C能够生 长，耐受6. 5%NaCl，不水解淀粉，不液化明胶，不产生硫化氢，发酵葡萄糖产酸不产气，联 苯胺试验阴性，吲哚试验阴性，乙酰甲基甲醇试验阳性。
[0030] API 50CH(法国梅里埃公司）鉴定结果表明NC301菌株为植物乳杆菌。NC301菌 株能利用：核糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、甘露醇、山梨醇、苦杏仁苷、熊果苷、N-乙 酰-葡萄糖胺、七叶醇、柳醇、纤维二糖、麦芽糖、乳糖、蜜二糖、蔗糖、海藻糖、松三糖、棉籽 糖、栊牛儿糖、D-阿拉伯糖醇、葡萄糖酸盐。NC301菌株不能利用：阿拉伯糖、木糖、阿东醇、 山梨糖、鼠李糖、卫矛醇、肌醇、a_甲基-D-葡萄糖苷、a-甲基-D-甘露糖苷、菊糖、淀粉、 糖原、木糖醇、D-松二糖、D-塔格糖、D-米苏糖、岩糖、L-阿拉伯糖醇、2-酮基-葡萄糖酸 盐、5-酮基-葡萄糖酸盐。
[0031]NC301菌株的16srDNA部分序列如序列表中序列1所示。
[0032] 以上鉴定结果表明，NC301菌株属于植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum)。
[0033] 三、菌株的保藏
[0034] 本发明提供的植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum)NC301，已于2015年06月 23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市 朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏登记号为CGMCCN0. 11013。 植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum)NC301CGMCCNO. 11013,简称植物乳杆菌NC301，用 NC301表示。
[0035]实施例2、植物乳杆菌NC301的耐受性测定
[0036] 1、将植物乳杆菌NC301接种至MRS液体培养基，得到菌悬液（菌悬液中的菌浓度： log1(]cfu/ml= 8. 57±0. 17)，将菌悬液分成4组（每组5个重复处理），分别进行如下操作：
[0037] 第一组：用盐酸调pH为2. 0, 37 °C静置培养3h;
[0038] 第二组：用盐酸调pH为3. 0, 37 °C静置培养3h;
[0039] 第三组：加入牛胆粉并使其浓度为0. 3g/100ml，37°C静置培养3h ;
[0040] 第四组：加入牛胆粉并使其浓度为0. 6g/100ml，37°C静置培养4h;
[0041] 完成上述操作后，取50y1涂布MRS固体培养基平板，37°C静置培养48h后菌落计 数。
[0042] 结果见表1。植物乳杆菌NC301对pH2. 0具有一定的耐受能力，存活率20. 63%。 植物乳杆菌NC301对pH3. 0具有很好的耐受作用，存活率仍超过80 %。植物乳杆菌NC301 对0. 3g/100ml和0. 6g/100ml的牛胆盐均具有较强的耐受性。
[0043] 2、将鼠李糖乳杆菌LGG接种至MRS液体培养基，得到菌悬液（菌悬液中的菌浓度： log1(]cfu/ml= 8. 25±0. 37)，将菌悬液分成4组（每组5个重复处理），分别进行如下操作：
[0044] 第一组：用盐酸调pH为2. 0, 37 °C静置培养3h;
[0045] 第二组：用盐酸调pH为3. 0, 37 °C静置培养3h;
[0046] 第三组：加入牛胆粉并使其浓度为0.3g/100ml，37°C静置培养3h ;
[0047] 第四组：加入牛胆粉并使其浓度为0. 6g/100ml，37°C静置培养4h;
[0048] 完成上述操作后，取50y1涂布MRS固体培养基平板，37°C静置培养48h后菌落计 数。
[0049] 结果见表1。
[0050] 表1菌株对酸和胆盐的耐受能力
[0051]
[0052]实施例3、植物乳杆菌NC301的黏附能力
[0053] 表面疏水性与菌株的黏附能力有关。菌株表面的疏水特性是影响菌株肠道上皮细 胞黏附能力的重要因素之一。
[0054] -、疏水性测定
[0055] 1、取待测菌株，用pH7. 2的PBS缓冲液悬浮菌体，得到0D6QQnni= 0? 4的菌悬液。
[0056] 2、取3mL步骤1得到的菌悬液，与lmL有机试剂混合，漩涡震荡30s，然后室温静置 30min，取水相。
[0057] 3、取步骤2得到的水相，测定600nm下的吸光度值（记为Ax)。
[0058]菌株疏水能力（％ ) =[1-(Ax/A。)] X 100% ;AQ= 0? 4。
[0059] 待测菌株为植物乳杆菌NC301或鼠李糖乳杆菌LGG。
[0060] 有机试剂为二甲苯、三氯甲烷或乙酸乙酯。
[0061] 进行三次重复试验，结果取平均值。
[0062] 结果见表2。与鼠李糖乳杆菌LGG相比，植物乳杆菌NC301对二甲苯、氯仿和乙酸 乙酯均具有较强的疏水能力，表明其表面具有极强的电子供体特性。
[0063] 二、Caco-2细胞黏附试验
[0064] 待测菌株为植物乳杆菌NC301或鼠李糖乳杆菌LGG。
[0065] 1、在24孔细胞培养板中，采用含10% (体积比）新生牛血清、100U/mL青霉素和 100U/mL链霉素的DMEM培养液培养Caco-2细胞，长至单层细胞贴壁时进行计数，每孔细胞 数目为3. 5X105个。
[0066] 2、取待测菌株，用pH7. 2的PBS缓冲液悬浮菌体，