专利名称：：植物乳杆菌在制备预防、治疗肠道真菌感染药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及植物乳杆菌的新用途，特别涉及植物乳杆菌在制备预防、治疗肠道真菌感染药物中的应用
背景技术：
临床深部真菌感染发生率的升高，与患者长期大剂量使用抗生素导致的肠道菌群紊乱具有密切关系。抗生素的副作用以肠道菌群紊乱为起点，以条件性致病菌增多、细菌移位为标志，最终造成病死率才及高的院内二重感染。白假丝酵母是最主要的内源性条件致病真菌，已有研究显示白假丝酵母在人胃肠道内增殖进而引发深部感染是抗生素治疗的一种常见副作用，抗厌氧菌活性较强的抗生素，如头孢曲松的使用，能够为其在人肠道的定植提供条件，从而为真菌的系统感染提供入口。虽然国内外大量研究证明乳杆菌可对肠道菌群的失衡进行有效调节，但是乳杆菌对于真菌的体内外拮抗作用有待进一步深入研究和应用。
发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一种植物乳杆菌在制备预防、治疗肠道真菌感染药物中的应用。本发明通过体外实验证实，该植物乳杆菌可极显著降低白假丝酵母的出芽率，有效抑制其由酵母相向菌丝相的转换，进而降低白假丝酵母的黏附能力和侵袭致病力；体内实验结果表明，该植物乳杆菌可显著减少感染小鼠肠道内白假丝酵母的数量，其中，以预防组疗效最为显著。4吏用才直物乳4干菌治疗真菌的肠源性感染，可为肠道真菌感染的预防、控制及药物研发提供新方法、新策略。为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中附图为植物乳杆菌中性培养乏液(SCS)和活菌对白假丝酵母的出芽抑制情况。其中**，；KO.01,表示与对照相比具有^l^差异具体实施方式以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。(一)本发明涉及的植物乳杆菌的分离实验用植物乳杆菌分离自上海信谊药业有限公司生产的益生菌药物培菲康，根据供试药品产品标签标注的菌种组成，选用MRS培养基，无菌取5粒胶嚢内容物(0.2g/粒)溶于9ml灭菌生理氯化钠溶液中，置漩涡震荡器上充分混匀，作十倍梯度稀释，取最后三个稀释度IOOn1加入MRS选择性琼脂培养基平皿上，并以L形棒涂布均匀，置厌氧培养罐37。C培养，分离单菌落。(二)植物乳杆菌的培养1.向新鲜配置的MRS液体培养基中接种一个单菌落，置于37。C需氧培养24h;2.取出试管，十倍梯度稀释对新鲜培养的植物乳杆菌进行活菌计数。(三)体外实验植物乳杆菌中性培养乏液(SCS)和活菌对白假丝酵母的出芽抑制以培养时长为2小时、12小时和24小时的植物乳杆菌中性培养乏液(SCS)与白假丝酵母在同一体系中进行共孵育，根据白假丝酵母的出芽率为指标，检测白假丝酵母芽管的形成情况，芽管形成的越少，出芽率越低，说明本发明植物乳杆菌对于白假丝酵母的体外抑制能力越强。详细方法如下1.获厌氧培养2小时、12小时和24小时的植物乳杆菌，离心后各收集5ml培养上清，使用Na0H将上清调节至pH-7.4,使用0.22um微孔滤膜过滤获得中性培养乏液(SCS);收获厌氧培养24小时的植物乳杆菌，lxPBS漂洗2次，使用1xPBS调节其浓度至5x107CFU/ml的活菌悬液；2.新鲜培养的白4叚丝酵母(ATCC90028)菌液，使用1xPBS漂洗2次，洗涤后的样品使用100%的胎牛血清重悬，将白假丝酵母的菌浓度调节为5x106cfu/ml，调节好浓度的白假丝酵母按照100m1/孔的量加入96孔板中，实验组在96孔板中添加100jul的植物乳杆菌SCS或者活菌悬液，对照组则在96孔板中添加100n1的生理盐水,将96孔板置于37。C下孵育2小时以诱导出芽。孵育后的样品使用70%的乙醇洗涤一次；吸去乙醇后，每孔中加入200)il的0.25。/。的sds,弃去sds,去离子水洗涤3次以清除sds;显微镜观察，确定没有出芽黏附的白假丝酵母已经被洗掉后，每孔中添加0.1%的结晶紫100jul，染色10分钟；倒掉染液后，96孔板使用去离子水洗涤3次，使用0.25。/。的SDS洗涤一次，去离子水再洗涤两次；96孔板自然干燥后，每孔加入200jj1的异丙醇-0.04N的HC1和50ia1的0.25%SDS在摇床上进行短暂固定；酶标仪读取A590纳米的值；计算出芽率，公式为出芽率(％)=(实验孔OD590-空白孔OD590)/(对照孔0D590-空白孔OD590)。数据分析采用SPSS12.0软件，"企验组间比较，p《0.05表明有显著性差异，p《0.Ol表示有极显著差异，结果见附图。(四)体内实验，植物乳杆菌对肠道白假丝酵母感染小鼠的保护作用SPF级BALB/c小鼠，全雌，体重1820g。小鼠饲养于顶部有空气过滤膜的封闭小鼠笼内，食物与饮用水经高温高压灭菌后随机提供，寄养于第三军医大学实验动物中心spf动物房内，小鼠分笼前饲养于同一鼠笼中以适应环境。小鼠灌胃125mg/ml的头孢曲松溶液0.2ml/次，每天2次，时间间隔6h,连续灌胃5d，模拟抗生素诱导.的肠道菌群严重失衡。1，植物乳杆菌对肠道白^f艮丝酵母感染的预防肠道菌群严重失衡后，乳杆菌预防组小鼠于第6d开始连续灌胃0.5ml2x108CFU/ml的植物乳杆菌(相当于108CFU)，连续5d,每天2次，时间间隔6h;之后连续5d灌胃0.5ml2xio7CFU/ml的白假丝酵母菌SC5314(相当于107CFU),连续5d，每天2次，时间间隔6h。本组小鼠实验周期为15d。2,植物乳杆菌对肠道白假丝酵母感染的保护肠道菌群严重失衡后，乳杆菌保护组小鼠于第6d开始同时灌胃108CFU植物乳杆菌和107CFU白假丝酵母菌混合物，连续5d,每天2次，时间间隔6h。本组小鼠实验周期为10d。3，植物乳杆菌对肠道白假丝酵母感染的治疗肠道菌群严重失衡后，小鼠连续5d灌胃IO'CFU白假丝酵母菌SC5314,造成肠道菌群严重失衡状态下的真菌感染，乳杆菌治疗组小鼠于第lld开始连续灌胃108CFU植物乳杆菌，.连续5d,每天2次，时间间隔6h。本组小鼠实验周期为15d。对照组肠道菌群严重失衡后，自第6d起连续5d灌胃107CFU白假丝酵母菌SC5314,造成肠道菌群严重失衡状态下真菌感染。自第lld开始给真菌感染小鼠模型每天灌胃2次生理盐水，每次O.2ml，连续治疗5d;本组小鼠实验周期为15d。治疗结束后，处死预防组、保护组、治疗组、对照组小鼠，无菌取其盲肠内容物、结肠内容物及粪便进行白假丝酵母活菌计数，评价植物乳杆菌治疗后感染小鼠肠道内感染真菌的清除情况，结果如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>植物乳杆菌治疗7.47±0.087.62±0.17a8.51±0.10组结果以(平均值士标准差)的形i^会出，ap<0.01,表示与对照纟J^目比具有才碰著差异；b;K0.05,表示与对照纟財目比具有錢差异。由上i^吉果表明，预防组中，该植物乳杆菌可以极显著减少感染小鼠不同肠段内容物及粪便中的白假丝酵母数量；保护组中，该植物乳杆菌可以显著减少感染小鼠结肠内容物中的白假丝酵母数量；治疗组中，该植物乳杆菌在可以极显著减少感染小鼠结肠内容物中的白假丝酵母数量。说明该植物乳杆菌可显著緩解'J、鼠肠道内的白假丝酵母感染，尤其是预防效果极其显著。尽管通过参照本发明的某些优选实施例，已经对本发明进行了图示和描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。权利要求1.植物乳杆菌在制备预防、治疗肠道真菌感染药物中的应用。全文摘要本发明公开了植物乳杆菌在制备预防、治疗肠道真菌感染药物中的应用；植物乳杆菌可显著缓解肠道内的白假丝酵母感染，尤其是预防效果极其显著。文档编号A61K35/74GK101244091SQ20081006947公开日2008年8月20日申请日期2008年3月14日优先权日2008年3月14日发明者欢唐,曾本华,静袁,泓魏申请人:中国人民解放军第三军医大学