专利名称：北冬虫夏草菌丝体中多种有效成分的综合提取方法
技术领域：
本发明涉及中草药中有效成分的提取方法，特别涉及北冬虫夏草 菌丝体中多种有效成分的综合提取方法。
背景技术：
虫草是一类具有显著医疗保健功效的食药用真菌，其中最著名的是冬虫夏草(Cor办ce戸w力e/w&)。由于冬虫夏草生境特殊、寄主专一， 人工培养难度很大，加之滥采滥挖造成的资源破坏，使冬虫夏草的价 格严重背离了本身价值。在虫草属中最有可能代替冬虫夏草的是北虫 草(Cor办ce戸/m7/ton's)，又称北冬虫夏草、蛹虫草。北虫草是冬虫夏 草的近缘种，也是虫草属的模式种，北虫草是优良的药材和冬虫夏草 替代品。北虫草菌粉在我国作为一类新药(中药)以获得国家药品监 督管理局批准进入临床，产品标识具有补肺益肾、止咳化痰之功效， 能够调节机体免疫功能，提高机体综合抗病能力，主要用于慢性支气 管炎、各种肿瘤及其它免疫系统疾病的治疗，主要原因是北虫草中含 有大量的生物活性物质，主要有虫草甾醇(麦角甾醇、P-谷甾醇等)、 虫草多糖、虫草素及甘露醇、腺苷、多种氨基酸、维生素和无机盐等。 虫草中的甾醇类成分已鉴定的有P-谷甾醇、麦角甾醇等。甾醇能阻断胆固醇的吸收，降低机体及血液中胆固醇的含量，防止高胆固醇血症的形成，从而防止动脉粥样硬化、静脉血栓的发生保证人体健康；具有类似于羟基保泰松或氢化可的松的抗炎作用，还可以阻断致癌物诱 发癌症的形成，同时在皮肤营养和保护方面都有良好的生理效能，总 之具有防癌、治疗、减毒及营养保护等作用。虫草多糖是虫草中含量 最高的生物活性物质，大量医学证实，虫草多糖对单核巨噬细胞系统 有增强作用，对细胞免疫功能具有调节作用，能增强体液免疫功能， 可活化巨噬细胞剌激抗体产生，提高人体免疫能力，并具有降血糖、 抗肿瘤及对肝损伤具有保护作用，并可作为抗辐射保护剂。虫草素又 称虫草菌素，它是第一个从真菌中分离出来的核苷类抗菌素，是一种 具有多种生物活性的核苷类物质，具有抗病毒、抗菌，明显抑制肿瘤生长，干扰人体RNA及DNA合成的作用，在临床上可用于治疗癌症、 白血病、有扩张支气管，显著增强肾上腺激素和抗衰老等作用。北虫草中的有效成分提取方法较多，但几乎都只侧重于虫草素、 虫草多糖和虫草酸等单方面的提取方法上或是简单地对虫草素和虫草 多糖的复合提取进行了研究，然而对其他成分，如虫草甾醇、维生素、 色素类等，作为杂质除去或不予考虑忽略掉了，这样就造成资源利用 不充分从而造成巨大的资源浪费。申请号为200610023578.4的中国专 利提供了一种连续提取北冬虫夏草子实体有效成分的方法涉及甾醇 类、虫草多糖和虫草素的综合提取，但是其仍有以下缺陷原料为北 虫草子实体，这样成本较高；其所采用的甾醇类的超临界萃取以及虫草素的正相低压硅胶色谱和制备型反相高效液相色谱等纯化方法，操作步骤多，过于复杂等， 一般中小企业很难实现；其制备得到的甾醇、虫草多糖没有进一步纯化处理，纯度不高。发明内容本发明的目的是提供了一种节省原料、提取充分、纯度较高并且 操作简单的北冬虫夏草菌丝体中多种有效成分的综合提取方法。采用 的技术方案如下 (1)虫草甾醇的提取粉碎取新鲜北冬虫夏草菌丝体置于低于95"C的环境条件下干燥， 干燥的菌丝体使用粉碎机进行粉碎至粉末状；所述的北冬虫夏草菌丝体包括液体发酵菌丝体、固体培养菌丝体、栽培子实体及子实体收获后的下脚料或其混合物；提取向干燥、粉碎后的北冬虫夏草菌丝体中加入有机溶剂，按每1克菌丝体加入3 40毫升有机溶剂，30 95。C下提取0. 5 5小时， 过滤，得滤液，重复提取1 4次；将每次滤液混合，残留物备用；其 中所述的有机溶剂是正已垸、正丁烷、环己垸、丙酮或石油醚中的一 种；浓縮将滤液在温度30 95°C、常压或减压下浓縮至无有机溶剂 味，回收有机溶剂，得浓縮物；皂化常温下每1克浓縮物中加入0.2 5毫升碱性溶液，混匀， 静置0.5 24小时，除去下层可皂化物，得不皂化液，重复皂化1 3次，其中所述的碱性溶液是浓度为1%至50%的氢氧化钠或氢氧化钾 溶液；萃取向不皂化液中加入0.2 10倍体积的有机溶剂，混匀，静 置0.5 24小时，分取有机溶剂层，得萃取液，重复萃取1 5次，其 中所述的有机溶剂是正已烷、正丁垸、环己垸、丙酮或石油醚中的一 种；干燥将萃取液在30 95'C下常压或减压浓縮至无有机溶剂味， 回收有机溶剂，浓縮物经干燥处理后，即得到虫草甾醇。 (2)虫草多糖的提取提取将步骤(1)提取后所得的残留物加水，按每l克残留物加 入3 20毫升水，混匀，50 10(TC提取0.5 4小时，过滤，得滤液 和水提残留物，重复提取1 4次；水提残留物可作饲料；浓縮:将滤液在50 10(TC、减压或常压浓縮至原体积的1/3 1/8，得浓縮液；第一次醇沉向浓縮液中加入2 6倍体积的乙醇，置于-15 40。C 下0. 5 48小时；过滤将醇沉溶液过滤，可得滤液和滤饼，滤饼为粗虫草多糖；除蛋白将粗虫草多糖溶于O. 1 10倍体积水后，再加入0.5 3 倍体积的Sevage试剂除蛋白，重复1 6次；第二次醇沉经过除蛋白的粗虫草多糖液中加入2 5倍体积的乙 醇，置于-15 40。C下0. 5 24小时;过滤将醇沉溶液过滤，得滤液和滤饼；干燥滤饼置于25 10(TC下烘干，可得高纯度的虫草多糖。 (3)虫草素的提取浓縮取步骤(2)两次醇沉后的滤液混合在40 8(TC、常压或减 压下浓縮至无醇味，得浓縮液；调pH:取浓縮液用酸性溶液调pH至1.5 6.0，其中所述的酸性 溶液是浓度为1%至50%的盐酸或硫酸溶液；柱层析选取阳离子交换树脂，装柱，按说明书预处理树脂；将 上述pH调好的浓縮液上阳离子交换柱，然后用碱性溶液洗脱，收集碱 性溶液洗脱液，其中所述的碱性溶液是0. 05 5. Omol/L的氨水溶液； 选取的阳离子交换树脂可以是苯乙烯系大孔强酸性阳离子交换树脂、 苯乙烯系凝胶强酸性阳离子交换树脂等；结晶将洗脱液在50 100。C、常压或减压下浓縮至干，加热乙醇 溶解，置于-15 25'C中结晶，收集晶体，置于25 10(TC烘干，得高 纯度虫草素晶体。步骤(1)所述虫草甾醇的提取方法优选回流提取法，也可采取浸 提法、超声或微波提取法等。步骤(2)所述虫草多糖的提取方法可以用水热回流法、热水浸提 法、超声或微波提取法等，本发明优选水热回流法。步骤(2)所述的分离滤液和滤饼的方法可以用过滤法或离心法， 本发明优选过滤法。通过采用本发明技术方案实现了北冬虫夏草菌丝体中虫草甾醇、虫草 多糖、虫草素等主要三大类有效成分的综合提取，而且最终残留物可 作为优质的动物词料。附图1清晰地显示了这三类有效成分综合提取 的方法流程。为证实所得提取物的纯度，我们对虫草素的纯度进行了分析通 过732阳离子交换树脂、结晶等技术进行纯化处理；其中732阳离子 交换树脂处理步骤为，将含虫草素溶液用HC1调pH为2上柱，用0. 15 mol/L氨水洗脱，收集氨水洗脱液，在205nm下检测虫草素的液相纯度 达74.0% (见附图2);再将收集液经过浓縮、乙醇溶解、结晶等步骤 获得晶体，取晶体溶于水中进行高效液相色谱分析，在205nm下检测 虫草素的液相纯度(见附图3)，从图中可见，几乎所有的杂质都被除 去，此时虫草素的纯度已达98%以上。本发明技术和工艺主要表现在以下几点①本发明利用有机溶剂 将弱极性的甾醇类有效成分提取出来，所用原料包括液体发酵菌丝体、 固体培养菌丝体、栽培子实体及子实体收获后的下脚料，而己有其他 的技术都有将这部分成分作为杂质除去，基本上以虫草子座(子实体) 为原料，价格昂贵，成本高；本发明充分利用了资源，避免浪费；这 是本发明的一个亮点。②在提取虫草多糖或虫草素方面，现有技术先 大多采用乙醇提取、再水提、再用乙醇沉淀，这样要浪费大量的乙醇， 生产成本较高；而本发明则是先水提、浓縮、再用醇析，这样节约乙 醇用量而且一次性就能得到虫草多糖和虫草素，与其相比生产成本大降低。③已有的工艺提取虫草多糖的含量较低，而本发明提取的虫草多糖含量大于90%。④大多数已有的工艺方法是单一或两种成分简 单复合提取，提取后在进行一系列的纯化工作，操作繁琐；⑤大多数 已有技术得到的产品纯度不高，而本发明得到的虫草甾醇、虫草多糖 和虫草素等三类产品纯度均较高，其中虫草素的纯度高达98%，分别 是无色、灰白色和白色晶体。本发明的有益效果是所用原料上及提取过程中节约了成本，北虫 草中的多种有效成分提取充分，经过反复提取、去除杂质使所得提取 物纯度较高，并且操作简单，能实现多种有效成分的综合提取。
图1是北冬虫夏草菌丝体中多种有效成分的综合提取方法的工艺流 程2是阳离子交换树脂处理洗脱液高效液相图谱 图3是结晶纯品高效液相图谱具体实施方式
(共3例)实施例1: (1)虫草甾醇的提取粉碎取新鲜北冬虫夏草固体培养菌丝体1000克置于5(TC烘箱烘 干至恒重，干燥的菌丝体使用粉碎机进行粉碎；提取在粉碎的100克菌丝体中加入1000毫升正丁垸，4(TC下提 取2小时，过滤，得滤液，重复提取3次，残留物备用；浓縮将滤液在4(TC下常压浓縮至无正丁垸味，得浓縮物，回收正丁烷；皂化在常温下向浓縮物加入其2倍体积的10。^的氢氧化钠溶液， 混匀，静置2小时，除去下层可皂化物，得不皂化液，重复2次；萃取加入不皂化液3倍体积的正丁烷，混匀，静置2小时，萃 取，取正丁垸液，重复3次；干燥将上述萃取液在4(TC下常压浓縮至无正丁烷味，回收正丁烷，浓縮物经干燥处理后，得0.56克虫草甾醇。 (2)虫草多糖的提取提取将步骤(1)提取后的残留物加水，残留物与水重量体积比1: 20，混匀，95"C提取3小时，重复提取2次；过滤将水提残留物过滤，得到滤液和滤饼，滤饼可作词料，将滤液在85。C减压浓縮至原体积的1/4左右；第一次醇沉在浓縮后的滤液中加入3倍体积的乙醇，置于-4°C 下24小时；过滤将醇沉溶液过滤，可得含虫草素的滤液和含虫草多糖的滤 饼，滤饼为粗虫草多糖，滤液备用；除蛋白粗虫草多糖沉淀溶于2倍体积水后，再加入加水量3倍 体积的Sevage试剂(氯仿与正丁醇的体积比是4: 1)除蛋白，重复2次；第二次醇沉将除蛋白的粗虫草多糖液中加入3倍体积的乙醇，置于-4'C下24小时；过滤将醇沉溶液过滤，滤饼置于65'C烘干，得3.4克虫草多糖。 (3)虫草素的提取浓縮取步骤(2)两次醇沉后的滤液混合，在65T:下减压浓縮至 无醇味；调pH:取浓縮液用10X盐酸溶液调pH至2.0， pH计跟踪检测；柱层析732阳离子交换树脂按说明书预处理；然后将上述pH调好的浓縮液上732阳离子交换柱，然后用0. lmol/L氨水溶液洗脱，收 集洗脱液；结晶将洗脱液浓縮，加热乙醇溶解，置于-4。C中结晶，收集晶体， 置于45"C烘干，得0.2克虫草素。实施例2: (1)虫草甾醇的提取粉碎取新鲜北冬虫夏草液体发酵培养的菌丝体12000克置于 65"C烘箱烘干至恒重，使用粉碎机粉碎；提取准确称取粉碎的菌丝体1000克加入8升正己烷，65'C下提 取3小时，过滤，得滤液，重复提取2次，残留物备用；浓縮将提取滤液在50。C减压浓縮至无正己垸味，得浓縮液；皂化上述浓縮液在常温下加入浓縮液3倍体积的10%的氢氧化钠溶液，混匀，静置4小时，除去下层可皂化物，得不皂化液，重复皂化2次；萃取加入不皂化液3倍体积的正己烷进行萃取，混匀，静置2 小时，重复萃取3次；干燥将上述有机溶剂萃取液在5(TC下减压浓縮至无正己垸味，回收正己烷，浓縮物经干燥处理后，即得到4.7克虫草甾醇。(2) 虫草多糖的提取提取将步骤(1)提取后的残留物加水，残留物与水重量体积比1: 8，混匀，9(TC提取3小时，重复提取2次；过滤将水提残留物过滤，得到滤液和滤饼，滤饼用作词料，将滤液在85"C减压浓縮至原体积的1/5;第一次醇沉在浓縮后的滤液中加入3倍体积的乙醇，置于-4t:下12小时；过滤将醇沉溶液过滤，可得含虫草素的滤液和含虫草多糖的滤 饼，滤饼为粗虫草多糖；除蛋白粗虫草多糖沉淀溶于2倍体积水后，再加入加水量l倍 体积的Sevage试剂(氯仿与正丁醇的体积比是5: 1)除蛋白，重复3 次；第二次醇沉将除蛋白的粗虫草多糖液中加入3倍体积的乙醇， 置于-4'C下12小时；过滤将醇沉溶液过滤，滤饼置于6(TC烘干，得虫草多糖28.3 克。 -(3) 虫草素的提浓縮取步骤(2)两次醇沉后的滤液混合减压浓縮至无醇味；调pH:取浓縮液用10%的盐酸溶液调pH至2. 5;柱层析732阳离子交换树脂按说明书预处理；将上述调好pH的浓縮液上该阳离子交换柱，然后用O. lmol/L氨水洗脱，收集洗脱液；结晶将洗脱液浓縮，加热乙醇溶解，置于-4。C中结晶，收集晶体，置于45'C烘干，得1.6克高纯度虫草素。实施例3:(1) 虫草甾醇的提取粉碎取栽培北冬虫夏草子实体收获后的下脚料9000克置于65°C 烘箱烘干至恒重，使用粉碎机粉碎；提取称取粉碎的下脚料1000克加入8升石油醚，65"C下提取3 小时，过滤，得滤液，重复提取2次，残留物备用；浓縮将提取滤液在5(TC减压浓縮至无石油醚味，得浓縮液；皂化上述浓縮液在常温下加入浓縮液3倍体积的10%的氢氧化 钠溶液，混匀，静置4小时，除去下层可皂化物，得不皂化液，重复皂化2次；萃取加入不皂化液3倍体积的石油醚进行萃取，混匀，静置2 小时，重复萃取3次；干燥将上述有机溶剂萃取液在5(TC下减压浓縮至无石油醚味，回收石油醚，浓縮物经干燥处理后，即得到5.7克虫草甾醇。(2) 虫草多糖的提取提取将步骤(1)提取后的残留物加水，残留物与水重量体积比 1: 8，混匀，98"C提取2小时，重复提取2次；过滤将水提残留物过滤，得到滤液和滤饼，滤饼用作饲料，将 滤液在85'C减压浓縮至原体积的1/5;第一次醇沉在浓縮后的滤液中加入3倍体积的乙醇，置于-4'C 下12小时；过滤将醇沉溶液过滤，可得含虫草素的滤液和含虫草多糖的滤 饼，滤饼为粗虫草多糖；除蛋白粗虫草多糖沉淀溶于2倍体积水后，再加入加水量l倍体积的Sevage试剂(氯仿与正丁醇的体积比是3: 1)除蛋白，重复3 次；第二次醇沉将除蛋白的粗虫草多糖液中加入3倍体积的乙醇， 置于-4"C下12小时；过滤将醇沉溶液过滤，滤饼置于6(TC烘干，得虫草多糖42.5克。(3)虫草素的提取 浓縮取步骤(2)两次醇沉后的滤液混合，减压浓縮至无醇味； 调pH:取浓縮液用10X的盐酸溶液调pH至3.0;柱层析732阳离子交换树脂按说明书预处理；将上述调好pH的浓縮液上该阳离子交换柱，然后用O. lmol/L氨水洗脱，收集洗脱液；结晶将洗脱液浓縮，加热乙醇溶解，置于-4"C中结晶，收集晶体，置于45-C烘干，得3.2克高纯度虫草素。
权利要求
1、一种北冬虫夏草菌丝体中多种有效成分的综合提取方法，其特征是按以下步骤进行(1)虫草甾醇的提取提取向干燥、粉碎后的北冬虫夏草菌丝体中加入有机溶剂，按每1克菌丝体加入3～40毫升有机溶剂，30～95℃下提取0.5～5小时，过滤，重复提取1～4次，将每次所得的滤液混合，残留物备用；其中所述的有机溶剂是正己烷、正丁烷、环己烷、丙酮、石油醚中的一种；浓缩将滤液在温度30～95℃、常压或减压下浓缩至无有机溶剂味，回收有机溶剂，得浓缩物；皂化常温下每1克浓缩物中加入0.2～5毫升碱性溶液，混匀，静置0.5～24小时，除去下层可皂化物，得不皂化液，重复皂化1～3次，其中所述的碱性溶液是浓度为1％至50％的氢氧化钠或氢氧化钾溶液；萃取向不皂化液中加入0.2～10倍体积的有机溶剂，混匀，静置0.5～24小时，分取有机溶剂层，得萃取液，重复萃取1～5次，其中所述的有机溶剂是正己烷、正丁烷、环己烷、丙酮、石油醚中的一种；干燥将萃取液在30～95℃下常压或减压浓缩至无有机溶剂味，回收有机溶剂，浓缩物经干燥处理后，得虫草甾醇；(2)虫草多糖的提取提取将步骤(1)提取虫草甾醇后的残留物加水，按每1克残留物加入3～20毫升水，混匀，50～100℃提取0.5～4小时，过滤，得滤液和水提残留物，重复提取1～4次；浓缩将滤液在50～100℃、减压或常压下浓缩至原体积的1/3～1/8，得浓缩液；第一次醇沉向浓缩液中加入2～6倍体积的乙醇，置于-15～40℃下0.5～48小时；过滤将醇沉溶液过滤，可得滤液和滤饼，滤饼为粗虫草多糖；除蛋白将粗虫草多糖溶于0.1～10倍体积水后，再加入0.5～3倍体积的Sevage试剂除蛋白，重复1～6次；第二次醇沉经过除蛋白的粗虫草多糖液中加入2～5倍体积的乙醇，置于-15～40℃下0.5～24小时；过滤将醇沉溶液过滤，得滤液和滤饼；干燥将滤饼置于25～100℃、减压或常压下烘干，得高纯度虫草多糖。(3)虫草素的提取浓缩取步骤(2)两次醇沉后的滤液混合，在40～80℃、常压或减压下浓缩至无乙醇味，得浓缩液；调pH取浓缩液用酸性溶液调pH至1.5～6.0，其中所述的酸性溶液是浓度为1％至50％的盐酸或硫酸溶液；柱层析选取阳离子交换树脂，装柱，按说明书预处理树脂；将上述pH调好的浓缩液上阳离子交换柱，然后用碱性溶液洗脱，收集碱性溶液洗脱液，其中所述的碱性溶液是0.05～5.0mol/L的氨水；结晶将洗脱液在50～100℃、常压或减压下浓缩至干，加热乙醇溶解，置于-15～25℃中结晶，收集晶体，置于25～100℃烘干，得高纯度虫草素。
2、 如权利要求1所述的北冬虫夏草菌丝体中多种有效成分的综合 提取方法，其中步骤(1)所述的北虫草菌丝体包括液体发酵菌丝体、 固体培养菌丝体、栽培子实体及子实体收获后的下脚料或其混合物。
3、 如权利要求1所述的北冬虫夏草菌丝体中多种有效成分的综合 提取方法，其中步骤(2)除蛋白所用Sevage试剂的组份氯仿与正丁 醇的体积比是2 8: 1。
4、 如权利要求3所述的北冬虫夏草菌丝体中多种有效成分的综合 提取方法，其中步骤(2)除蛋白所用Sevage试剂的组份氯仿与正丁 醇的体积比是4: 1。
5、如权利要求1所述的北冬虫夏草菌丝体中多种有效成分的综 合提取方法，其中步骤(3)所述的阳离子交换树脂是苯乙烯系强酸 性凝胶型阳离子交换树脂。
全文摘要
本发明提供了一种北冬虫夏草菌丝体中多种有效成分的综合提取方法。将干燥粉碎的北冬虫夏草菌丝体先用有机溶剂提取、过滤，得滤液和残留物；将滤液浓缩回收溶剂，浓缩液经皂化、萃取、干燥，可得虫草甾醇；将残留物用水提取、过滤，滤液经浓缩、醇沉、离心，得沉淀物和上清液；将沉淀物溶解于水中进行除蛋白等操作，可得虫草多糖；将离心上清液通过离子交换树脂柱、结晶等手段，可得虫草素。该方法节省原材料，所得提取物纯度较高，成本较低，操作简单，能实现北冬虫夏草菌丝体中多种有效成分的综合提取。
文档编号A61K36/06GK101229199SQ20081006924
公开日2008年7月30日 申请日期2008年1月15日 优先权日2008年1月15日
发明者刘洪波, 伟 叶, 朱华李, 毛先兵 申请人:重庆和润生物工程有限公司