专利名称：富铬冬虫夏草菌丝体生产工艺的制作方法
技术领域：
本发明属于生物发酵技术，具体地说是一种利用生物发酵技术制取药用保健品的方法。
随着社会发展带动人民物质生活的提高，人们的饮食结构会产生很大变化，高糖、高蛋白、高脂肪美食物的大量摄入，使得人们新陈代谢类的疾病发病率大大提高，糖尿病做为其中的一个病种正在迅速地在蔓延。经初步统计我国糖尿病人已达4000万人，且以每年1‰速度增加。如没有有效方法加以遏止，则2010年左右会达1亿名患者。糖尿病人全身乏力，体质下降，且久治不愈，对人类的健康已经构成重大威胁，而且至目前为止尚未有彻底根除糖尿病的有效方法和药物。按现代医学理论观点对糖尿病应当采取预防为主的措施。根据糖尿病发病的机理进行有效预防是最有效的保健措施。根据美国现代医学杂志的报导，40岁以上的人体内缺少微量元素铬是导致糖尿病产生的重要因素之一，人每天对铬的摄入量仅为5-80微克，相差甚远。铬是胰岛素不可缺少的辅助成份，它参与糖的代谢过程能够促进脂肪和蛋白质的合成，所以当人身缺铬和饮食结构异常多种因素交织在一起时，往往是糖尿病突发的最好时机。所以，及时补进铬元素不仅是极好的预防措施，而且对糖尿病的治疗和康复也会起到极重要的作用。经反复的实验证明，人体补充微量元素的原则和补充常量元素一样，关键在于人体的吸收率与其化学状态相关。通常微量元素吸收价值是无机态低于有机合成态，而有机态又低于生物源活性态。无极态的三价铬盐进入人体后吸收率仅为0.5％，而以真菌经生物工程方式得到的生物源活性铬，其吸收率可达5％-10％，因而引起越来越多人的兴趣。
本发明的目的即是提供一种富铬菌丝体的生产工艺，以其达到补铬，预防和治疗糖尿病的功效。
本发明的关键的设计在于以预防和治疗糖尿病而提供富铬生物源产品，在选择菌种时首先要考虑的是菌丝体本身也应是有利于强体、健肾，防治糖尿病有一定辅助药效的品种。冬虫夏草菌(caedyceps sinensis)，自古以来列为我国名贵滋补强壮中药，1757年《本草从新》记载“冬虫夏草，甘平，保肺益肾，补精髓，止血化痰，已劳嗽，治膈症皆良”，中医认为入肺、肾，既能滋肺阴，又能补肾阳，为治虚症，虚痞，虚痛的良药，不但药用价值很高而且在国内广泛用于食疗。近代中医药理研究表明，虫草具有降血脂，防治动脉硬化，保护心肝、脑组织、镇静催眠，调节免疫功能，抗炎、抗缺氧均有良好效果，特别是近代报导中强调其具有明显降糖效果，强体固肾为防止糖尿病发生有较好的保健预防作用。所以，选取冬虫夏草菌株做为菌种去培育富铬菌丝体会起到事半功倍的效果。和冬虫夏草菌同属同种的还有蛹虫菌株(caesyceps nilicais)也有相类似的药用价值，所以也可以选取蛹虫菌菌株，以后叙述本发明的工艺处理方法细则时均可同时另选蛹虫菌株做种，不再重复叙述。
本发明所采用的基本工序步骤包括菌种选取，适应性培养，驯化富集菌种，工业浓缩发酵，菌丝体提取，其关键在于是在培养基的配方中加入20-120mg/1000ml三价氯化铬。经过适应性育种、驯化富集、工业浓缩发酵后最终使菌丝体内含有50-500ppm的三价铬离子，成为优良补铬生物源产品。
下面结合给出的实施例进一步说明本发明的目的是如何实现的同属同种的冬虫夏草菌株或蛹虫菌株的商业菌种可从中国医学院药物研究所或北京农科院购得，购得的菌种可以按常规方法保管、运输和处理后直接在下道工序中接种。
在适应性育种这道工序，冬虫夏草菌株采用试管斜面式培养做适应性育种，所选用的培养基可按以下重量百分比配制 按以上配方制得的培养基在试管中接种按斜面培养方式保温于24℃-28℃，时间2-3天即可获得适应性菌种。
下一道工序是驯化富集菌种工序，在这道工序中需利用三价铬离子浓度含量逐步梯度增加的专用培养基中通过3-6代的驯化培养生成富集的菌种集群，所采用的三价铬盐即氯化铬含量可从首代0.002％浓度开始，每代增加0.001个百分点直至培养基中三价氯化铬含量达0.01％为止产生工业发酵种群。
在驯化富集菌种工序中所用的培养基可按以下实施例配制 将以上配方配制的培养基置入摇床，接种上道工序育出的适应性菌种按三价氯化铬浓度梯度增加的顺序做3-6代驯化培育，温度控制为24℃-28℃，每代3-5天，最后获得富集菌种集群。
也可以采用三角烧瓶在固态条件做驯化富集培育，此时的培养基可按以下参考配制(重量百分比) 将以上配比制成的培养基置入三角烧瓶中，接种上道工序制成的适应性菌种，再将三价氯化铬浓度按梯度增加从0.002％开始至0.10％做出3-6代培育获得驯化富集菌群，温度控制在24-28℃，时间为4-7天。
将驯化后的菌种收集就可以向工业浓缩发酵工序中做种源使用。此时所用的培养基配比如以下实施例(按重量百分比)
将以上组份配制的培养基置入工业发酵罐内接种已驯化的富集菌种，其菌种重量可按占总重1-5％，保持环境温度24-28℃，搅拌速度为140-200转/分，通入发酵罐气体流量每分钟的体积(V1)为培养基体积(V2)的40％-100％。罐压保持1.96-3.92千帕，发酵时间4-7天，当PH值为4.5-5.0，残糖量下降至0.2-0.4％时中止发酵。
也可以按照固态发酵的方式完成工业浓缩发酵制取富铬的冬虫夏草菌丝体，具体做法是在以上培养基的基础上将蛋白胨组分改为0.5、0.75、1.0，在分别加入1.5％、1.75％和2.5％的琼脂就可以配成固态发酵用的培养基。采用固态发酵法时可直接将培养基置入500ml-1000ml的烧瓶中接种上驯化种菌做扩大培养，然后在转置入2500ml-5000ml烧瓶中在24-28℃下连续培养5-8天即可完成发酵。
最后一道工序是菌丝体的提取、收集。在工业发酵罐中获取的菌丝体可通过清水冲洗、过滤收集，然后在60-80℃下干燥，粉碎即制成富铬冬虫夏草的菌丝体工业化产品。
在烧瓶中直接培育而成的菌丝体采取直接采割、分离，然后在60-80℃温度下干燥、粉碎，即可制成成品。
以上工艺经过反复的试验，其生产工艺重复性好，生成菌丝体内的三价铬离子含量可非常稳定地保持在200ppm，其基本含量符合医用补铬的要求，并经临床试用对血糖11.0mmol以下者不用化学药物具有明显的降糖效果。长期服用并加配降糖中药则作用更加显著，可以预料富铬冬虫夏草菌丝体的产生，将为糖尿病的治疗药物增加了一个优秀的医药产品，对糖尿病的治愈，特别是预防性治疗将起到难以估量的作用。
权利要求
1.富铬冬虫夏草菌丝体生产工艺，工艺中包括菌种选取，适应性育种，驯化富集菌种，工业浓缩发酵、菌丝体提取工序，其特征在于本生产工艺的培养基中含有0.002-0.01％重量百分比三价氯化铬，所选取的菌种为冬虫夏草属冬虫夏草种的冬虫夏草菌株或蛹虫菌株。
2.根据权利要求1所说的生产工艺，其特征在于适应性育种工序是将选取的商用冬虫夏草菌株种采用试管斜面方法做适应性育种，选用的培养基按以下重量百分比配制琼脂 1.5-2.5 蛋白胨0.2-0.5葡萄糖 1.5-2.5 酵母膏1.0-1.5磷酸二氢钾 0.1-0.12硫酸镁0.02-0.04氯化铬(三价) 0.002-0.005 水余量培养温度24℃-28℃，时间2-3天。
3.根据权利要求1所说的菌丝体生产工艺，其特征在于驯化富集菌种工序是利用三价铬离子浓度含量逐步成梯度增加的培养基中通过三至六代培养生成适应高浓三价铬离子环境的驯化菌种富集群，所采用的培养基中三价氯化铬含量可从0.02％开始，每代增加0.001-0.002％浓度，直至含三价氯化铬含量达0.01％。
4.根据权利要求3所说的菌丝体生产工艺，其特征在于驯化培养富集菌种工序中采用的培养基配方的重量百分比为葡萄糖1.5-2.5蛋白胨0.4-0.6酵母膏1.0-1.5磷酸二氢钾0.1-0.12硫酸镁0.05-0.08 氯化铬(三价) 0.02-0.1水余量按以上配方配成的培养基置入摇床，接种上道工序育出的菌种按三价氯化铬浓度含量梯度增加，做3-6代驯化培育，温度24-28℃，每代3-5天。
5.根据权利要求3所说的菌丝体生产工艺，其特征在于驯化富集菌种工序中所制备的培养基还可以采取以下重量百分比琼酯 1.5-2.5 葡萄糖1.5-2.5蛋白胨 0.4-0.6 酵母膏1.0-1.5磷酸二氢钾 0.1-0.12硫酸镁0.02-0.04氯化铬(三价) 0.002-0.01 水余量将按以上配方制备的培养基置入三角烧瓶，接种上道工序育出的菌种，再将三价氯化铬含量浓度按梯度增加做出3-6代培育富集，温度24-28℃，时间4-7天。
6.根据权利要求1所说的菌丝体生产工艺，其特征在于工业浓缩发酵工序中的培养基按以下重量百分比配比蔗糖 2-2.5葡萄糖2-2.5蛋白胨 1.0-2.0 酵母膏1.0-1.5磷酸二氢钾 0.15-0.2 硫酸镁0.05-0.1氯化铬(三价) 0.06-0.12水余量将以上组份培养基置入工业发酵罐内，接入富集驯化菌种1-5％重量菌种，保持环境温度24-28℃，搅拌速度140-200转/分钟，每分钟通入发酵罐的气体体积(V1)与发酵罐内培养基体积(V2)之比为1∶0.4～1，罐压1.96-3.92帕，发酵时间4-7天，PH为4.5-5.5，残糖量0.2-0.4％时中止发酵。
7.根据权利要求1所说的菌丝体生产工艺，其特征在于在工业浓缩发酵工序还可以采取固态发酵方法，在权利要求6所述培养基配方中将蛋白胨的配比加减少至0.5-1.0，加入1.5％-2.5％的琼脂即可配制成固态发酵培养基，本工序可将培养基置入500ml-2000ml烧瓶中将驯化菌种扩大培养，然而接种于2500ml-5000ml烧瓶内在24-28℃温度下连续培养5-8天即可以完成工业发酵。
8.根据权利要求6所说的菌丝体生产工艺，其特征在于菌丝体的提取工序是工业发酵罐生成的菌丝体经清洗过滤收集后在60-80℃下干燥粉碎即可完成。
9.根据权利要求7所说的菌丝体生产工艺，其特征在于将烧瓶内生成的菌丝体可直接采割分离，并在60-80℃下干燥粉碎即可完成。
全文摘要
本发明提供了一个富含二价铬的冬虫夏草菌丝体的生产工艺。该工艺选取冬虫夏草属的冬虫夏草菌株或蛹虫菌株做种源,采取含三价氯化铬的培养基做基料实行梯度驯化的方式富集富铬菌种,在工业发酵罐中完成浓缩发酵,最后通过清洗,过滤干燥,粉碎制取对防治糖尿病有疗效的菌丝体。
文档编号C12N1/14GK1297995SQ0110053
公开日2001年6月6日 申请日期2001年1月12日 优先权日2001年1月12日
发明者杨忠才, 杨迎工 申请人:杨忠才