篮霉菌木聚糖酶的制作方法

专利名称：篮霉菌木聚糖酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及新型木聚糖酶，比如来自篮霉菌属(Talaromyces)的木聚糖酶，以及它们用于降解纤维素中的木聚糖的用途。发现这些木聚糖酶可以用于焙烤中、动物饲料中(提高饲料转化)和造纸中。
植物半纤维素包括木聚糖、阿拉伯木聚糖、葡糖醛酸阿拉伯木聚糖和木糖葡聚糖。木聚糖(CAS注册号9014-63-5)由β-1，4-连接D-吡喃木糖基(xylopyranosyl)单元的主链组成，任选的被测链比如阿拉伯糖和/或葡糖醛酸残基取代。其结构是→4)-β-D-Xylp-(1→4)-β-D-Xylp(2←1A)-(1→4)-β-D-Xylp-(1→4)-β-D-Xylp(3←1B)-(1→(Xylp＝吡喃木糖基单元；A＝α-(4-O)-甲基-(D-吡喃葡糖醛酸基)单体，有时是乙酰基；B＝α-(L-呋喃阿拉伯糖基)单体，有时是乙酰基)。
木聚糖可能占陆生植物干重的30％多。因此，木聚糖是自然来源材料的重要组分，所述材料用于焙烤工业，提高动物饲料转化和造纸过程这一系列工业工艺中。
单子叶植物(例如谷类和草类)和双子叶植物(例如三叶草、油菜和大豆)之间，植物的果实部分和营养部分有根本性不同。单子叶植物的特性在于具有阿拉伯木聚糖复合物为主要的半纤维素主链，双子叶植物的半纤维素主要结构是木糖葡聚糖复合物。在双子叶植物中发现其果胶浓度比单子叶植物的高。果实一般多含有胃蛋白酶类物质，但是其纤维素类物质相对比较低。
纤维素降解酶被用于处理食物中的植物材料，也用于饲料应用或者食物或饲料添加剂，因为它能够作用于主要植物细胞壁取代物。
工业上可获得的大多数纤维素降解酶是相对低分子量的木聚糖酶，并在高温度下有中等稳定性。然而，对于特定的应用，使用具有相当高耐热性的木聚糖酶比较有利。如果木聚糖酶用作动物饲料添加剂，优选高耐热性，因为动物饲料颗粒化时会采用高温条件。
因此，本发明提供了(分离的)β-木聚糖酶多肽，其包含(i)SEQ ID No2的氨基酸序列；或(ii)能够切割β-D-木聚糖的(i)的变体；或(iii)能够切割β-D-木聚糖的(i)或(ii)的片段。
根据本发明另一个方面，提供了多核苷酸，其包含(a)SEQ ID No1的核酸序列，或编码本发明的多肽的序列；(b)与(a)定义的序列互补或可杂交的序列；(c)(a)或(b)的序列的片段；(d)具有与(a)、(b)或(c)定义的序列至少60％同一性的序列；或(e)(a)到(d)定义的任一序列的遗传密码简并性序列。
本发明也提供了-包含本发明的多核苷酸，并能够表达本发明多肽的(例如表达)载体；
-包含本发明的载体的细胞系；-生产本发明的多肽的方法，该方法包含在适于表达多肽的条件下培养本发明的细胞系，如果需要，分离多肽；-降解β-D-木聚糖的方法，该方法包含把本发明的多肽与含有β-D-木聚糖的材料相接触；和-鉴定调节木聚糖酶活性的化合物的方法，该方法包含把本发明的多肽与测试化合物在β-D-木聚糖存在下相接触，并监测或探测任何调节活性。序列简述SEQ ID No1是编码本发明中来自Talaromyces emersonii的木聚糖酶的DNA序列；SEQ ID No2是木聚糖酶的氨基酸序列；和SEQ ID No3和4是可与SEQ ID No1杂交的人工合成的PCR引物。发明详述A，多核苷酸本发明提供了编码本发明的多肽的多核苷酸(例如分离的和/或纯化的)。因此本发明提供了编码木聚糖酶的多核苷酸，该木聚糖酶氨基酸序列如SEQ ID No2所示(比如氨基酸23到408的成熟序列)。本发明进一步提供编码与SEQ ID No2所示氨基酸序列有显著氨基酸序列同源性的多肽的多核苷酸。也包括多核苷酸，其选择自(a)包含SEQ ID No1所示的核苷酸序列(例如核苷酸69-1224)，或其互补序列的多核苷酸；(b)包含能够与SEQ ID No1所示的核苷酸序列(比如选择性)杂交的核苷酸序列，或其片段的多核苷酸；(c)包含能够与SEQ ID No1所示的核苷酸的互补序列(比如选择性)杂交的核苷酸序列，或其片段的多核苷酸；和/或(d)包含与(a)、(b)或(c)定义的多核苷酸有遗传密码简并性的多核苷酸序列的多核苷酸。
本发明也包括选自下述的多核苷酸(a)编码具有木聚糖酶活性的多肽，其多核苷酸是(1)SEQ ID No1的编码序列(例如核苷酸69-1224)；(2)可选择性与(1)定义的序列的互补序列杂交的序列；或(3)(1)或(2)定义的序列的遗传密码简并性序列；或(b)是(a)定义的多核苷酸的互补序列。
除非正文需要，否则上面提及SEQ ID No1时也可以用成熟编码序列(多核苷酸69到1224)来代替。可杂交序列名词“能够杂交”是指本发明的目标多核苷酸能够与用作探针的核酸(例如SEQ ID No1所示的核苷酸序列，或它的片段或它的互补序列)杂交，其杂交水平显著高于背景。本发明也包括编码木聚糖酶或它的变体的核苷酸序列，也包括与此处序列互补的核苷酸序列。核苷酸序列可能是RNA或DNA，因而包括基因组DNA、合成的DNA或cDNA。优选核苷酸序列是DNA序列，更优选cDNA序列。通常本发明的多核苷酸包含连续核苷酸序列，它能在选择性条件下与SEQ ID No1的编码序列(例如成熟)或其互补序列杂交。这些核苷酸可以依据本领域所周知的方法合成1。
本发明的多核苷酸能够与SEQ ID No1的编码序列或(例如成熟)编码序列的互补序列杂交，其杂交水平显著高于背景。发生背景杂交可能是例如因为cDNA文库中存在的其他cDNA。信号水平(例如本发明的多核苷酸和编码序列或编码序列的互补序列的相互作用产生的)通常是至少10倍，优选至少100倍于其他多核苷酸和SEQ ID No1的(例如成熟)编码序列之间相互作用的强度。作用强度可以通过例如用放射性例如32P标记探针。选择性杂交通常可以用低严格性(0.3M氯化钠和0.03M柠檬酸钠，约40℃)，中严格性(例如，0.3M氯化钠和0.03M柠檬酸钠，约50℃)或高严格性(例如，0.3M氯化钠和0.03M柠檬酸钠，约60℃)来进行。杂交可以采用任何本领域周知的适当条件，作为指导，低严格性可以是在55℃使用2X SSC缓冲液，中严格性可以是在60℃使用0.5到1.0X SSC缓冲液，高严格性可以是在60℃或更高温度(例如68℃)使用0.1或0.2X SSC缓冲液，它们全部含有0.5％的SDS。修饰本发明的多核苷酸可能包含DNA或RNA。它们可能是单链或双链。它们也可能是在其中含有一个或多个合成的或修饰过的核苷酸的多核苷酸。本领域周知的有许多不同类型的多核苷酸修饰。这些包括甲基磷酸酯和硫代磷酸酯主链和/或，在分子的3’端和/或5’端添加吖啶或聚赖氨酸链。为了本发明的目的，此处要理解描述的多核苷酸可能用本领域的任何可以得到的技术进行修饰。
应当理解，熟练技术人员可以使用常规技术取代核苷酸，而不影响本发明的多核苷酸编码的多肽的序列，以反映任何特定宿主生物体(例如待在其中表达本发明多肽的宿主)的密码子用法。
SEQ ID No1的(例如成熟)编码序列可以用核苷酸取代修饰，例如从1，2，或3到10，25，50或100个取代。多核苷酸可以变通地或另外还被一种或多种插入和/或删除和/或一端或两端的延伸所修饰。修饰的多核苷酸一般编码具有木聚糖酶活性的多肽。可以进行简并性取代和/或翻译后相对于后文多肽产生保守性氨基酸取代的取代。同源物能够与SEQ ID No1的DNA编码序列(或核苷酸69-1224)选择性杂交(如其互补物)的核苷酸序列，可能与SEQ ID No1的编码序列有至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性(或同源性)。这可能是至少20个核苷酸的区域，优选至少30或60，例如至少100，至少200，更优选至少300个连续核苷酸或最适宜地SEQ ID No1的全长。
任何联合上面提到的同源程度和最小尺寸可以用于定义本发明的多核苷酸，优选比较严格的组合(例如在较长范围有较高同源性)。因而，例如，在25个核苷酸长度、优选30个核苷酸的长度上有至少80％或90％的同源性的多核苷酸构成本发明的一个方面，在40个核苷酸长度上有至少90％的同源性的多核苷酸也构成本发明的另一方面。
多核苷酸(或蛋白质)序列的同源性一般是例如在至少20，25，30，100个或更多连续核苷酸(或氨基酸)的区域上有至少70％同源性，优选至少80，90％、95％、97％或99％的同源性。同源性可以基于氨基酸同一性(有时指“严格同源性”)进行计算。
例如UWGCG软件包提供了BESTFIT程序，可以用来计算同源性(例如在它的默认设置下使用5)。PILEUP和BLAST算法可以用来计算同源性或排布序列(比如例如在它们的默认设置下鉴定等价或相应序列6，7)。
执行BLAST分析的软件可以通过国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnology Information，http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。这个算法涉及首先鉴定高得分序列配对(high scoring sequence pair，HSPS)，这通过鉴定查询序列中长度W的序列在与数据库序列中相同长度的序列比对时匹配或符合一些正-数值阈得分T的短序列而进行。T是附近序列初始得分阈值6，7。这些附近序列起始命中(hit)可以用于寻找含有它们的HSPs的起点。命中序列向两个方向延伸，直到累积比对得分不再增加。下述情况下命中序列的延伸在某一个方向终止累积比对评分从它的最大得分数下降量X；累积比对评分达到0或更低(由于累积一种或多种负-得分残基比对所致)；或到达了该序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLAST程序使用下列默认值序列长度(W)是11，BLOSUM62计分矩阵8比对(B)是50，期望值(E)是10，M＝5，N＝4，并且比较两条链。
使用BLAST算法统计分析两个序列之间的相似性9。BLAST算法提供的一种相似性度量是最小和概率(smallest sum probability，P(N))，它提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指标。例如，如果比较第一个序列和第二个序列的最小和概率大约小于1，优选大约小于0.1，更优选少于约0.01，最优选少于约0.001，就视作一个序列与另一个序列相似。引物和探针本发明的多核苷酸包括并可以用作引物，例如PCR引物、用于其它扩增反应的引物、探针，或可将多核苷酸克隆进载体。这些引物、探针和其他片段是至少或多达20、25、30或40，例如至少25、30或40个核苷酸长度。它们一般可多达30、40、50、60、70、100、150、200或300个核苷酸长度，或(甚至少至5或10个核苷酸)比SEQ ID No.1的(例如成熟)编码序列短的数目。
一般情况下，引物用合成的方法生产，涉及逐步地一次一个核苷酸合成期望的核酸序列。采用自动化的此技术在本领域很容易获得。本发明的引物的实例如SEQ ID No.3和4所示。
较长的多核苷酸一般用重组方式合成，例如采用PCR(聚合酶链式反应)克隆技术。这将涉及制备待克隆木聚糖酶区域的一对引物(例如大约15到30个核苷酸)，使引物和来自目标(例如酵母、细菌、植物、原核或真菌的，优选篮霉菌菌株)细胞的mRNA或cDNA相接触，在可扩增期望区域的条件下执行聚合酶链式反应，分离扩增片段(例如用琼脂糖凝胶纯化反应混合物)，回收扩增的DNA。引物设计为含有适当的限制性酶识别位点，因而可以把扩增的DNA克隆进适当的克隆载体中。
这些技术可以用来获得此处所述的木聚糖酶序列的全部或部分。SEQ ID No.1相应的染色体组克隆或含有例如内含子和启动子区域的木聚糖酶基因也包括在本发明中，也可以用相似的方式(例如重组方式、PCR和克隆技术)从真菌、酵母、细菌、植物或原核的基因组DNA中获得。
多核苷酸或引物可以携带可检测标记，例如放射性活性或非放射性活性标记。适当的标记包括放射性同位素比如32P或35S，酶标记，或其他蛋白质标记比如生物素。这些标记可以加入到本发明的多核苷酸或引物中，然后可以用本身所知的技术检测。
多核苷酸，无论是标记的或是未标记的，均可以用在基于核酸的测试中，对(例如真菌)样品中的木聚糖酶或它的变体进行检测或测序。这些检测测试一般包括使(怀疑)含有DNA的(例如真菌)样品在杂交条件下与本发明的探针或引物相接触，并检测探针和样品中的核酸形成的任何双链形式。这些检测可以用一些技术获得，比如PCR或把探针固定在固相支持物上，去除样品中不能和探针杂交的核酸，接着检测与探针杂交的核酸。另外，样品核酸可以被固定在固相支持物上，并检测结合到支持物上的探针的量。
本发明的探针可以容易地以测试试剂盒形式包装在适当容器中。在这些试剂盒中，，若其中试剂盒的设计处理模式需要这种结合则探针可以结合到固相支持物上。试剂盒也包含适当的处理待检测样品的试剂、使样品中的核酸与探针杂交的试剂、对照试剂和说明书等。
优选地，本发明的多核苷酸可以自与所述多肽相同的生物体中获得，比如篮霉菌属真菌。
本发明的多核苷酸也包括SEQ ID No.1的具有木聚糖酶活性的序列的变体。变体可以通过添加、取代和/或删除形成，并可能具有切割β-D-木聚糖聚合物的能力。多核苷酸的生产与SEQ ID No.1(例如其成熟编码序列)没有100％同一性，但属于本发明范围的多核苷酸可以通过多种方法获得。此处描述的木聚糖酶序列变体可能例如通过筛选由多种生物体，例如本发明的多肽的来源生物体构建的染色体DNA文库而获得。另外，其他真菌、植物或原核木聚糖酶同源物也可以获得，这些同源物和它的片段一般能够与SEQ ID No.1杂交。这些序列可以通过筛选其它物种的cDNA文库或基因组DNA文库，用探针在中等到高等严格性条件(如前面所述)下筛选这些文库而获得，所述探针含有SEQ ID No.1的全部或部分序列。含有SEQ IDNo.1的全部或部分序列的核酸探针可以用于探测来自其他物种比如本发明多肽的来源物种的cDNA文库。
物种同源物也可能用设计针对变体和同源物内编码保守氨基酸序列的序列的引物，使用简并性PCR获得。引物可包含一种或多种简并性位置，并可以在比利用针对已知序列的单序列引物克隆序列时严格性更低的条件下使用。
或者，这些多核苷酸可以通过对木聚糖酶序列或它的变体进行定点诱变而获得。这在下述情况下可能非常有用，其中例如需要用沉默密码子改变来针对待在其中表达多核苷酸序列的特定宿主细胞进行偏爱密码子优化。为了引入限制性酶切位点，或改变多核苷酸编码多肽的性质或功能，其他序列改变也可能是合乎要求的。
本发明包括双链多核苷酸，其包含本发明的多核苷酸和它的互补链。
本发明也提供编码下面所述的本发明多肽的多核苷酸。因为这些多核苷酸是本发明的多肽重组生产非常有用的序列，他们不需要能够与SEQ ID No.1的序列杂交，当然能够杂交一般是比较理想的。否则，如果必需，这些多核苷酸能够以上面所述的方法标记、使用和制备。DNA片段可以用特异引物通过PCR技术制备33，34。B，多肽本发明涉及(例如(基本上)纯化的和/或分离的)木聚糖酶和它的变体。本发明的多肽可能基本上由SEQ ID No.2的氨基酸序列，或其部分(比如23位到408位的成熟序列)，或其变体组成。多肽也可能由上面所述的本发明的多核苷酸编码。除非正文需要，否则SEQ ID No.2可以只用成熟序列(残基Ala23到Leu408)来代替表示。
本发明的多肽可能对阿拉伯木聚糖和芳基-β-D-木糖苷具有活性(比如有阿拉伯木聚糖酶和木糖苷酶活性)。
本发明的多肽可能是分离的或基本上纯化的形式。应当理解，本发明多肽可以与不会影响多肽预期的使用和/或功能的载体或稀释剂混合，这仍然可以称为基本分离的。本发明的多肽一般包含以制剂中多肽的重量计百分比浓度大于20％，例如大于30％、40％、50％、80％、90％、95％或99％的多肽。它们是相对纯的组合物对于一些用途，多肽在组合物中的量可以为10％、5％、2％。1％或甚至小于0.5％。可以用常规方法纯化和/或合成蛋白质1。对于一些配方(例如非药物用途)多肽的存在量可能很少，例如从0.01到10％，比如从0.1到5％，或2％或甚至从0.2到1％。
优选地，本发明的多肽可以从拥有编码具有木聚糖酶活性的酶的基因的微生物中获得。更优选的微生物是真菌，任选丝状真菌。优选的微生物是篮霉菌属，比如Talaromyces emersonii(例如CBS 393.64或814.70)。活性本发明的多肽可能具有一种或多种下面的性质，即就是(1)具有β-D-木聚糖酶活性；(2)最佳pH范围为pH2-6的，比如pH3-5，最理想是pH3.5-5.0；(3)最佳温度为50℃到95℃，比如70到90℃，最理想是75到85℃；(4)分子量(去糖基化的)为30到50kDa，优选35到45kDa，最理想40到44kDa，或(糖基化)形式分子量为50到75kDa，优选从55到70kDa，最理想是从60到66kDa；和/或(5)等电点为3.0到3.6的。
该多肽具有EC.3.2.1.8的活性。优选地，多肽来自家族10(以前的F-型)。
“木聚糖酶活性”定义为切割纤维素或β-D-木聚糖聚合物(例如在植物例如燕麦或大麦中存在的)的能力。因此，活性容许切割β-D-木聚糖，比如在邻近的吡喃木糖基末端和/或非末端单元之间的切割。优选切割发生在[吡喃木糖基(1-4)吡喃木糖基]的连接键。多肽可能优选在两个邻近的(例如非取代的)单元之间切割。因此它可具有内切酶活性(例如内切木聚糖酶)。底物聚合物可能有或可能没有被取代。它也可具有外切酶活性(即木聚糖外切酶)，比如末端吡喃木糖基单元的切割。优选多肽没有葡聚糖酶活性。
本发明的多肽也对阿拉伯木聚糖有活性(或显示活性)。阿拉伯木聚糖是木聚糖的一部分，在木糖主链的C-2或C-3或两者上连接有L-阿拉伯糖-呋喃基侧链。阿拉伯木聚糖具有CAS注册号98513-12-3。它的结构可以为(1→4)-β-D-木聚糖，连有三个α-L-阿拉伯糖支链。这种类型的木聚糖正常情况下发现存在于斯佩尔特燕麦(oat spelt)木聚糖中。
这个活性是水解未处理的阿拉伯木聚糖的能力。这意味着阿拉伯木聚糖没有进行处理或修饰过，例如没有用阿拉伯呋喃糖苷酶处理过。这个酶能够去除阿拉伯糖侧链。本发明的多肽能够水解(切除)没有预先用阿拉伯呋喃糖苷酶处理过的阿拉伯木聚糖。
阿拉伯木聚糖发现于斯佩尔特燕麦中，在本说明书中，所述多肽的活性(EXU，以及PAHBAH活性)活性用来自小麦粉的阿拉伯木聚糖来测试(阿拉伯糖∶木糖的比例为41∶59)。阿拉伯木聚糖(作为底物)的测试在后面的实施例中进行描述。
本发明的多肽也可具有木糖苷酶活性，例如能够水解取代的(例如芳基)-β-D-木糖苷(也称为木糖吡喃糖苷)。例如，他们能够水解4-甲基伞形基-β-D-木糖吡喃糖苷(CAS注册号6734-33-4，可来自Sigma化学公司)。这个活性是释放底物上的荧光标记物的能力。它也可以水解(活性作用于)5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-β-D-木糖吡喃糖苷(CAS注册号207606-55-1)。兼具作用于阿拉伯木聚糖和芳基-β-D-木糖苷双方的活性是不寻常的36，37，这是具有木聚糖酶活性的新型多肽的活性联合。变体和同源物本发明的多肽可包含SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或基本上同源的序列，或这两个序列之一的片段，而且具有木聚糖酶活性。一般，如SEQ ID No.2所示天然产生的氨基酸序列是优选的。
尤其是，本发明的多肽包含a.SEQ ID No.2(残基23到408)的(成熟)多肽序列或SEQ IDNo.2的全部序列。
b.其天然产生的变体或物种同源物；或c.与(a)或(b)相比具有至少70、至少75、至少80、至少90、至少95、至少98、或至少99％的序列同一性的蛋白质。
变体可能是天然产生的，例如在真菌、细菌、酵母或植物细胞中存在的，并以与SEQ ID No.2的蛋白质基本上相同的方式起作用(例如具有木聚糖酶活性)的多肽。相似地，蛋白质的物种同源物是在另一个物种内天然产生的具有木聚糖酶活性的相当的蛋白质。变体包括等位基因变体，其来自与本发明多肽相同的菌株或来自不同的菌株，但是来自相同的属，或来自相同的种。
变体和物种同源物可以依照此处描述用于SEQ ID No.2的多肽生产的程序并在适当来源的细胞上执行这些程序(例如细菌、酵母、真菌和植物细胞)而获得。它也可能用上面定义的探针来探测酵母、细菌、真菌或植物细胞的文库，以获得包括变体或物种同源物的克隆。克隆可以用常规技术操作生成本发明的多肽，然后可以用本领域周知的重组或合成技术生产。
本发明的多肽优选地与SEQ ID No.2的蛋白质具有至少70％序列同一性，更优选至少80％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性(在例如至少40、60、100、150、200、300或400个连续氨基酸的区域上或SEQ ID No.2的全长上)。
SEQ ID No.2的多肽和变体和物种同源物的序列可以被修饰以提供本发明的多肽。可以产生氨基酸取代，例如从1、2或3到10、20、30、50或100个取代。相同数目的删除或插入也可以制成。这些改变可以位于对多肽的功能很关键的区域之外，因而可能仍产生有活性的酶。修饰过的多肽通常保持了木聚糖酶活性。
本发明的多肽包括上面提到的全长多肽和它的变体的片段，包括SEQ ID No.2所示的序列的片段。这些片段典型性保留了木聚糖酶活性。片段可能至少50、60、70、80、100、150、200或250个氨基酸长度或全长序列(SEQ ID No.2所示)减去这些数目的长度。片段或变体包含或代表了β-D-木聚糖结合区域或β-D-木聚糖切割区域。
虽然通常他们用下面所述的重组方法生产，但是如果必需，也可以用合成方法生产本发明的多肽。他们可能被修饰，例如加入组氨酸残基或T7标签，有助于他们的鉴定或纯化，或加入信号肽序列来促进他们从细胞内分泌。
名词“变体”是指具有与木聚糖酶同样的基本性质或基本生物学功能的多肽，包括等位基因变体。木聚糖酶的基本性质是它是一种能够切割β-D-木聚糖内的1→4连接键的酶。具有与木聚糖酶相同的基本性质的多肽可以用后面描述的纤维素降解实验来鉴定。
SEQ ID No.2的变体也包括与SEQ ID No.2不同、但不必衍生自天然发生的木聚糖酶蛋白质的序列。这些变体可能描述成与SEQ ID No.2的同源性百分比或序列中的取代数目。或者，变体可能由能与SEQ IDNo.1杂交的多核苷酸编码。
变体可以与SEQ ID No.1的变体相同的方式定义。因而这些变体可能包含衍生自篮霉菌属其他菌株的不同序列。其他变体可以自其他篮霉菌属菌株中通过寻找木聚糖酶活性、用与前面相同的方法克隆和测序而进行鉴定。变体可能包括在蛋白质序列内删除、修饰或添加单个氨基酸或氨基酸组，只要该肽维持木聚糖酶的基本生物学功能即可。
保守取代可以例如依据下面的表格制备。在第二栏同一区块内的氨基酸、优选地在第三栏同一行可能相互取代。优选取代不影响多肽的折叠或活性。
修饰本发明的多肽可能被化学修饰，例如翻译后修饰。例如，他们可能被糖基化(一次或多次，被相同或不同的糖)或包含修饰的氨基酸残基。他们也可能被组氨酸残基(有助于他们的纯化)的加入或被信号肽序列(促进插入细胞膜)的加入而修饰。多肽可能有一种或多种(N)氨基端或(C)羧基末端延伸，比如氨基端甲硫氨酸残基，多达大约20到25个残基的小连接肽，或有助于纯化的(小)延伸，比如多聚组氨酸或T7标签，抗原决定簇或(例如麦芽糖)结合域14(例如在C-末端)。这些延伸可能通过或可能没有通过连接物添加。
本发明的多肽可能用显色标签进行标记。显色标签可能是任何适当的可以探测多肽的标签。适当的标签包括放射性同位素，例如125I、35S、酶、抗体、多核苷酸和连接物比如生物素。
多肽可能被修饰以包括非天然产生的氨基酸或增加多肽的稳定性。当蛋白质或肽用合成方式生产时，这些氨基酸可以在生产中引入。蛋白质或肽也可能用合成或重组生产的方式进行修饰。
本发明的多肽也可能包含(一种或多种)D-氨基酸或用其生产。在这些情况下，氨基酸残基可能用本申请中所述的常规的N到C序列方法连接。
大量的侧链修饰是本领域公知的，并可以对本发明的蛋白质或多肽的侧链进行这样的修饰。这些修饰包括，例如通过与醛反应、随之用NaBH4还原而进行的还原性烷基化修饰，甲基乙酰亚胺酯的脒基化或乙酸酐的酰基化。
本发明提供的序列也可被用作构建“第二代”酶的起始材料。“第二代”木聚糖酶可能是已用基因诱变技术(例如定点诱变)改变酶，它的性质不同于那些野生型或重组木聚糖酶，比如用本发明的方法生产的酶。例如，其最适温度或pH、比活性、底物亲和性或热稳定性，可能进行改变从而更加适合在定义的过程中使用。
对本发明的木聚糖酶活性重要、因此优选对它进行取代的氨基酸，可以用本领域周知的方法鉴定，比如定点诱变或丙氨酸-扫描诱变10。在后一个的技术中，在分子的每个残基都引入突变，对所得突变分子进行生物活性(例如木聚糖酶活性)测试，以鉴定分子活性的关键氨基酸残基。酶-底物相互作用位点也可以用晶体结构的分析来确定，确定晶体结构的技术比如核磁共振、结晶学或光亲和标记11，12，13或分子模建(modelling)。
使用酵母和真菌宿主细胞预计可提供对本发明的重组表达产物赋予最适宜生物活性所必需的翻译后修饰(例如蛋白水解加工、肉豆蔻酰化、糖基化、截短，和酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸磷酸化)。
本发明的多肽可以处于其中天然细胞环境之外的形式提供。因此，它们可以是如上所述基本上分离的或纯化的，或者处于自然界中并不存在它们的细胞内，例如其它真菌物种、动物、酵母或细菌细胞内。C，重组体方面本发明也提供包含本发明的多核苷酸的载体，包括克隆和表达载体，以及在适当的宿主细胞中例如在本发明的多肽进行表达的条件下生长、转化或转染这些载体的方法。也提供了包含本发明的多核苷酸或载体的宿主细胞，其中所述多核苷酸是宿主细胞基因组异源的。名词“异源的”通常与宿主细胞有关，意味着多核苷酸不在宿主细胞基因组内自然产生，或多肽不在该细胞内天然产生。优选地，宿主细胞是酵母细胞，例如克鲁维酵母属(Kluyveromyces)或酵母属(Saccharomyces)酵母细胞或真菌细胞，例如曲霉属(Aspergillus)细胞。
本发明的多核苷酸可以引入到重组的可复制的载体中，例如克隆或表达载体。载体可能用来在相容性宿主细胞中复制核酸。因而，在另一个实施例中，本发明提供了制备本发明的多核苷酸的方法，包括把本发明的多核苷酸导入可复制载体中，把载体导入相容性宿主细胞，和在使载体复制的条件下培养宿主细胞。载体可以从宿主细胞中回收。适当的宿主细胞在下面与表达载体一起进行描述。载体本发明的多核苷酸可以插入表达盒中。插入了本发明的表达盒或多核苷酸的载体，可能是可以方便的执行重组DNA步骤的任何载体，载体的选择将常常依赖于要导入的宿主细胞。因而，载体可能是自主复制载体，例如以染色体外形式存在的载体，其复制不依赖于染色体的复制，例如质粒。或者，载体可能是在导入宿主细胞内时能整合到宿主细胞基因组中并与它所整合的染色体一起复制的载体。
优选地，本发明的多核苷酸在载体内可操作性连接了能够提供宿主细胞对编码序列的表达的调控序列，即载体是表达载体。名词“可操作性连接”是指并置位置，其中描述的组分处于能以预期的方式发挥功能的关系。调控序列比如启动子、增强子或其他表达调控信号“可操作性连接”编码序列是指它们所处的位置能使得在与控制序列相容的条件下进行编码序列的表达，或它们协同地发挥预定功能，例如转录起始于启动子，并通过编码多肽的DNA序列。
载体可能是质粒、粘粒、病毒或噬菌体载体，通常提供复制起点，任选地多核苷酸表达的启动子，任选地启动子的增强子和/或调控子。终止子序列可能存在，例如多聚腺苷酸化序列。载体可能含有一种或多种可选择标记基因，例如，氨苄青霉素抗性基因(在细菌质粒的实例中)或新霉素抗性基因(哺乳类载体中)。载体可能用于体外，例如RNA的生产或用于转染或转化宿主细胞。他们可能包含两个或多个本发明的多核苷酸，例如为了进行过量表达。
编码多肽的DNA序列优选地被导入适当宿主，作为表达盒(或构建体)的一部分，其中DNA序列可操作性连接能够指导宿主细胞内该DNA序列表达的表达信号。为了把表达构建体转化适当宿主，可采用技术人员公知的容易获得的转化步骤3，4。表达构建体可能作为携带选择标记的载体的部分用于宿主细胞的转化，或表达构建体可能作为单独分子与携带选择标记的载体一起进行共转化。载体可能包含一种或多种选择标记基因。
优选的选择标记15，16包括但并不限于可补充宿主细胞的某种缺陷或获得某种药物抗性的标记物。他们包括例如可用于多数丝状真菌和酵母的转化的通用性标记基因，比如乙酰胺酶基因或cDNA(amdS、niaD、facA基因或来自构巢曲霉(A.nidulans)、米曲霉(A.oryzae)或黑曲霉(A.niger)的cDNA)，或提供针对抗生素比如G418、潮霉素、博莱霉素、卡那霉素、腐草霉素、苯菌灵抗性(benA)的抗性基因。或者，可以用特定选择标记物，比如营养缺陷型标记，它需要相应突变宿主菌株例如URA3(来自酿酒酵母或其他酵母的类似基因)，pyrG或pyrA(来自构巢曲霉或黑曲霉)，argB(来自构巢曲霉或黑曲霉)或trpC。在优选的实施方案中，选择标记在表达构建体导入后从转化的宿主细胞中删除，从而获得能够产生不含选择标记基因的多肽的被转化宿主细胞。
其他标记物包括ATP合成酶、亚基9(oliC)、乳清酸核苷-5’-磷酸-脱羧酶(pvrA)、细菌G418抗性基因(这也可能用于酵母，但不用于真菌)、氨苄青霉素抗性基因(大肠杆菌)、新霉素抗性基因(芽孢杆菌)和编码β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)的大肠杆菌uidA基因。载体可能用于体外，例如RNA的生产或用于转染或转化宿主细胞。
对多数丝状真菌和酵母，为了获得稳定转化体，载体或表达构建体优选地整合到宿主细胞基因组中。然而，对于某些酵母，也可以用适当的游离体型载体，其中可掺入表达构建体以稳定和高水平表达，其例子包括分别衍生自酵母属和克鲁维酵母属的2μ和pKD1质粒的载体，或含有AMA序列(例如来自曲霉(Aspergillus)的AMA13，20)的载体。若表达构建体整合进宿主细胞基因组，则构建体或者在基因组随机位点整合，或者用同源重组在预定目标位点整合，其中目标位点优选包含高表达基因。高表达基因是mRNA能占到总细胞mRNA至少0.01％(w/w)的基因(例如在诱导条件下)，或者，基因产物可能达到全部细胞蛋白质的至少0.2％(w/w)的基因，或在分泌基因产物的例子中，是分泌水平可达到至少0.05克/升的基因。下面提供了大量高表达基因的适当的例子。
用于指定的宿主细胞的载体或表达构建体可能包含下面的元件，从5’端到3’端相互可操作性连续连接编码第一个发明多肽的序列的编码链(1)能够指导在指定的宿主细胞中编码该多肽的DNA序列的转录的启动子序列；(2)任选地，能够指导从指定的宿主细胞向培养基中分泌多肽的信号序列；(3)编码成熟、优选活性形式多肽的DNA序列；也优选地(4)能够终止编码该多肽的DNA序列下游的转录的转录终止区(终止子)。
编码多肽的DNA序列下游可能是3’非翻译区，其中含有一种或多种转录终止位点(例如终止子)。终止子起点不是很关键。终止子可能例如是编码多肽的DNA序列天然的。然而，优选地酵母终止子用于酵母宿主细胞，丝状真菌终止子用于丝状真菌宿主细胞中。更优选地，终止子是宿主细胞(其中待表达编码多肽的DNA序列)内源的。
增强编码本发明多肽的多核苷酸的表达可能也可通过选择异源调控区，例如启动子、分泌引导区和/或终止区域来达到，这些区域可用来提高目的多肽从表达宿主中的表达以及分泌水平(若期望的话)，和/或提供本发明的多肽表达的诱导控制。
除了编码本发明的多肽的基因天然的启动子，其他启动子可能用于指导表达本发明的多肽。启动子的选择依据是在期望的表达宿主中指导表达本发明的多肽的效率。
启动子/增强子和其他表达调控信号可能选择成与表达载体的宿主细胞相兼容。例如可使用原核启动子，尤其适用于大肠杆菌株的启动子。当在哺乳类细胞中进行表达时，可使用哺乳类启动子。组织特异性启动子，例如肝细胞特异性启动子，也可使用。病毒启动子也可使用，例如莫洛尼氏鼠白血病病毒长末端重复序列(Moloney murineleukaemia Virus long terminal repeat，MMLV LTR)、劳氏肉瘤病毒(rouse sarcoma virus，RSV)长末端重复序列启动子、SV40(例如大T抗原)启动子、人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，CMV)IE启动子、单纯疱疹病毒(herpes simplex virus)启动子或腺病毒启动子，HSV启动子比如HSV IE启动子，或HPV启动子，尤其HPV上游调控区(upstream regulatory region，URR)。酵母启动子包括啤酒酵母(S.cerevisiae)GAL4和ADH启动子，粟酒裂殖酵母(S.pombe)nmt 1和adh启动子。哺乳类启动子包括金属硫蛋白(metallothionein)启动子和β-肌动蛋白启动子，前者可应答重金属如镉而被诱导，。组织特异性启动子尤其内皮或神经细胞特异性启动子(例如DDAHI和DDAHII启动子)是尤其优选的。
可使用能够在本发明的宿主细胞中指导转录的多种启动子15，16。优选启动子序列是衍生自上面所定义的高表达基因。优选衍生本发明的启动子和/或包含在优选的预定靶位点、用于整合表达构建体的高表达基因的实例，包括但不限于编码糖酵解酶比如丙糖磷酸异构酶(triose-phosphate isomerases，TPI)，甘油醛-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-phosphate dehydrogenases，GAPDH)，磷酸甘油酸激酶(phosphoglycerate kinases，PGK)，丙酮酸激酶(pyruvate kinases，PYK或PKI)，乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenases，ADH)的基因，也包括编码淀粉酶、葡糖淀粉酶、蛋白酶、木聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-半乳糖苷酶、乙醇(甲醇)氧化酶、延伸因子和核糖体蛋白质的基因。适当高表达基因的特定例子包括例如来自克鲁维酵母(Kluyveromyces sp.)的LAC4基因、来自汉逊酵母(Hansenula)和毕氏酵母(Pichia)的甲醇氧化酶基因(AOX和MOX)，来自黑曲霉和泡盛曲霉(A.awamori)的葡糖淀粉酶(glaA)基因、米曲霉TAKA-淀粉酶基因，构巢曲霉gpdA基因和半知菌木霉(T.reesei)的纤维二糖水解酶基因。
强组成性和/或诱导性启动子中优选用于真菌表达宿主15，16，35中的例子是可得自编码木聚糖酶(xlnA)、肌醇六磷酸酶(phytase)、ATP合成酶、亚基9(oliC)、丙糖磷酸异构酶(tpi)、乙醇脱氢酶(AdhA)、α-淀粉酶(amy)、淀粉葡萄糖苷酶(AG来自glaA基因)、乙酰胺酶(amdS)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gpd)的真菌基因的启动子。
强酵母启动子的例子是可从乙醇脱氢酶、乳糖酶、3-磷酸甘油酸激酶和丙糖磷酸异构酶的基因中获得的启动子。
强细菌启动子的例子有α-淀粉酶和SPo2启动子，以及来自细胞外蛋白酶基因的启动子。
编码木聚糖酶的基因的天然启动子可能用另外一种受到不同调控的启动子替换。
植物细胞适合的启动子包括胭脂碱合成酶(nos)、章鱼碱合成酶(ocs)、甘露碱合成酶(mas)、核酮糖小亚基(rubisco ssu)、组蛋白、水稻肌动蛋白、菜豆球蛋白、花椰菜花叶病毒(cauliflowermosaic virus，CMV)35S和19S和环病毒(circovirus)启动子。所有这些启动子都是本领域容易获得的。
载体可能进一步包括产生RNA的多核苷酸侧翼的序列，其中包含与真核基因组序列、优选哺乳类基因组序列或病毒基因组序列同源的序列。这将容许本发明的多核苷酸通过同源重组的方式导入真核细胞或病毒的基因组。尤其，包含侧翼为病毒序列的表达盒的质粒载体能够用于制备适于把本发明的多核苷酸投递给哺乳类细胞的病毒载体。其他适当病毒载体的例子包括单纯疱疹病毒载体18，19和逆转录病毒，包括慢病毒(lentivirus)、腺病毒、腺伴随病毒和HPV病毒(比如HPV-16或HPV-18)。使用这些病毒的基因转移技术是本领域技术人员所公知的。逆转录病毒载体例如可能用来稳定性整合产生反义RNA的多核苷酸进入宿主基因组。相反，复制缺陷的腺病毒载体可处于游离体状态，因而容许瞬时表达。
载体可能包含定向在反义方向的本发明的多核苷酸，提供反义RNA的生产。如果需要，这可能用来减少多肽的表达。宿主细胞和表达在下一个方面，本发明提供了制备依据本发明的多肽的方法，它包含在可提供编码多肽的编码序列的表达(如由载体表达)的条件下培养宿主细胞(例如用上面所述的表达载体转化或转染)，和任选的回收表达的多肽。本发明的多核苷酸可以掺入到重组的可复制载体中，例如表达载体中。载体可能用于在相容性宿主细胞中复制核酸。因而在又一个实施方案中，本发明提供了制造本发明的多核苷酸的方法，包括把本发明的多核苷酸导入可复制载体，把载体导入相容性宿主细胞，和在使载体复制的条件下培养宿主细胞。载体可以从宿主细胞中回收。适当的宿主细胞包括细菌比如大肠杆菌、酵母、哺乳类细胞系和其他真核细胞系，例如昆虫细胞比如SF9细胞和(例如丝状)真菌细胞。
优选地多肽以分泌蛋白质形式生产，在这种情况下，在表达构建体中编码多肽成熟形式的DNA序列可操作性连接编码信号序列的DNA序列上。优选地信号序列是编码多肽的DNA序列天然(同源)的。或者，信号序列是编码多肽的DNA序列外来的(异源的)，其中信号序列优选地是表达DNA序列的宿主细胞内源的。用于酵母宿主细胞的适当信号序列的例子是来自酵母α-因子基因的信号序列。相似地，来自丝状真菌宿主细胞的适当信号序列的例子是，例如来自丝状真菌淀粉葡萄糖苷酶(AP)基因的信号序列，例如黑曲霉glaA基因。这可能与淀粉葡萄糖苷酶(也叫做(葡萄糖)淀粉酶)启动子本身，以及与其他启动子联合使用。杂合信号序列也可能用在本发明中。
优选的异源分泌前导序列是来自真菌淀粉葡萄糖苷酶(AG)基因(glaA的18和24个氨基酸变型(例如来自曲霉))、α-因子基因(酵母例如酵母属和克鲁维酵母属)或α-淀粉酶基因(芽孢杆菌)的序列。
载体可能如上面所描述转化或转染进入适当的宿主细胞，以提供本发明的多肽的表达。这种方法可能包含在适于载体表达所述多肽编码序列的条件下培养转化有上述表达载体的宿主细胞。
因而，本发明的另一个方面提供用或包含本发明的多核苷酸或载体转化或转染的宿主细胞。优选地多核苷酸携带于复制和表达多核苷酸的载体中。选择与该载体相兼容的细胞，可能是例如原核(例如细菌)、真菌、酵母或植物细胞。
也可能选择异源宿主，其中生产的本发明的多肽基本上不含其他纤维素降解酶。这可能通过选择正常不能产生这些酶的宿主比如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)来获得。
本发明包含以重组表达编码该多肽的DNA序列的方式生产本发明的多肽的方法。为了此目的，本发明的DNA序列可用于基因扩增和/或表达信号的交换，比如启动子、分泌信号序列，以便在适当的同源或异源宿主细胞中经济化生产多肽。同源宿主细胞是与从中衍生DNA序列的物种相同的物种或变种的宿主细胞。
适当的宿主细胞优选的是原核微生物比如细菌，或更优选的真核微生物，例如真菌，比如酵母或丝状真菌，或植物细胞。一般，与真菌细胞相比优选酵母细胞，因为它们容易操作。然而，一些蛋白质不是从酵母中分泌不佳，就是在某些情况下不能正确加工(例如酵母中的高糖基化)。在这些例子中，应该选择真菌宿主生物。
宿主细胞可能过量表达多肽，工程化过量表达的技术是众所周知的3。宿主可能因此有两个或多个编码多核苷酸拷贝(因此载体可能相应的具有两个或多个拷贝)。
来自芽孢杆菌属的细菌非常适合于作为异源宿主，因为它们能够分泌蛋白质到培养基中。其他适于作宿主的细菌来自链霉菌属(Streptomyces)和假单胞菌属(Pseudomonas)的菌株。优选的表达编码所述多肽的DNA序列的酵母宿主细胞来自酵母属、克鲁维酵母属、汉逊酵母属(Hansenula)、毕氏酵母属(Pichia)、Yarrowia和裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)。更优选的酵母宿主细胞可选择自包含物种酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母(也称作马克斯克鲁维酵母乳酸变种(Kluyveromyces marxianus var.lactis))、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、Yarrowia lipolytica和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)的组。
然而，最优选的是(例如丝状)真菌宿主细胞。优选的丝状真菌宿主细胞选自包含曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、镰孢属(Fusarium)、Disporotrichum、青霉属(Penicillium)、枝顶孢属(Acremonium)、脉孢菌属(Neurospora)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、毁丝霉属(Myceliophtora)、侧孢属(Sporotrichum)、梭孢壳属(Thielavia)和篮霉菌属(Talaromyces)的组。更优选丝状真菌宿主细胞选自物种米曲霉、酱油曲霉(Aspergillus sojae)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)，或来自物种黑曲霉23。这些包括但不限于黑曲霉、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、构巢曲霉、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、米曲霉和无花果曲霉(Aspergillus ficuum)，进一步包含物种Trichoderma reesei、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)、Acremonium alabamense、粗糙脉胞菌(Neurosporacrassa)、嗜热毁丝霉(Myceliophtora thermophilum)、Sporotrichumcellulophilum、Disporotrichum dimorphosporum和Thielaviaterrestris。本发明范围内优选的表达宿主的例子是真菌比如曲霉24，25和木霉；细菌比如芽孢杆菌26，27，例如枯草芽孢杆菌、地衣型芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、假单胞菌；酵母比如克鲁维酵母28，例如乳酸克鲁维酵母29和酵母菌，例如酿酒酵母。
依据本发明的宿主细胞包括植物细胞，因此本发明延伸到转基因生物体，比如含有一种或多种本发明的细胞的植物和它的部分。细胞可能异源表达本发明的多肽，或异源含有一种或多种本发明的多核苷酸。因此，转基因(或基因修饰)植物的基因组内可能插入(例如稳定地)了编码一种或多种本发明的多肽的编码序列。植物细胞的转化可以采用已知的技术，例如用根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的Ti或Ri质粒。因而，质粒(或载体)可含有感染植物必需的序列，并且可能采用Ti和/或Ri质粒的衍生物。
或者，可直接感染植物的一部分，比如叶、根或茎。在这个技术中，要进行感染的植物可通过，例如用刀片切植物或用针刺植物或用研磨剂摩擦植物而造成创伤。接着用土壤杆菌接种伤口。然后可将植物或植物部分在适当培养基上生长，使之发育为成熟植物。可以用已知的技术使转化细胞再生为基因修饰的植物，例如通过用抗生素选择转化的幼芽，并在含有合适营养物、植物激素等17的培养基上对这些幼芽进行次培养。培养宿主细胞和重组生产本发明也包括已经修饰而表达木聚糖酶或其变体的细胞。这些细胞包括瞬时的，或优选稳定的高等真核细胞系，比如哺乳类细胞或昆虫细胞，低等真核细胞，比如酵母和(例如丝状)真菌细胞或原核细胞比如细菌细胞。
本发明的蛋白质也可能在细胞系或在膜上瞬时表达，比如例如在杆状病毒(baculovirus)表达系统中。这些适于表达本发明的蛋白质的系统，也包括在本发明的范围内。
依据本发明，本发明的多肽可以通过在常规营养发酵培养基中培养微生物表达宿主而有效生产，该宿主已转化有一种或多种本发明的多核苷酸。
依据本发明的重组宿主细胞可能用本领域已知的方法培养。对每一种启动子和宿主细胞的组合，有助于表达编码多肽的DNA序列的培养条件是可以获得的。到达期望的细胞密度或多肽水平之后，停止培养，采用已知的方法回收多肽。
发酵培养基可能包含已知培养基，其含有碳源(例如葡萄糖、麦芽糖、糖蜜等)、氮源(例如硫酸铵、硝酸铵、氯化铵等)、有机氮源(例如酵母提取物、麦芽提取物、蛋白胨等)和无机营养源(例如磷酸盐、镁、钾、锌、铁等)。任选地，可能包括诱导物(例如纤维素、果胶、麦芽糖、麦芽糊精或木糖聚半乳糖醛酸(xylogalacturonan))。
合适培养基的选择可能基于表达宿主的选择和/或基于表达构建体调控的需要。这些培养基是本领域技术人员周知的。如果需要，培养基可能含有有助于转化的表达宿主优于潜在的其它污染微生物而生长的其它组分。
发酵可能在0.5到30天的期间内执行。它可能是批量、持续或补料-分批过程，适于在温度范围0到45℃，在例如pH2到10之间进行。优选的发酵条件是温度在20到37℃之间，和/或pH在3到9之间。合适条件的选择通常基于表达宿主和所表达蛋白质的选择。
如果需要，发酵后用离心或过滤的方式从发酵肉汤种去除细胞。发酵终止后或去除细胞后，可能获得本发明的多肽，如果需要，用常规方法纯化和分离。D，木聚糖酶的应用和处理植物或含纤维素(例如木聚糖)材料的方法具有木聚糖酶活性的本发明的多肽可用于处理真菌或植物材料，包括植物浆和植物提取物。例如它们可能用于处理谷物、蔬菜、水果或他们的提取物。本发明的多肽可方便地与适当的(固体或液体)载体或稀释液(包括缓冲液)相混合，以生产组合物或酶制剂。多肽可能与载体混合或附着其上，例如固定在固相载体上。因而，在更深一步方面，本发明提供含有本发明的多肽的组合物。这可能是以适合于包装、运输和/或储存的形式，优选地在保留木聚糖酶活性的形式。组合物可能是糊状、液体、乳液、粉末、片状、颗粒状、丸状或其他挤出物形式。
组合物可能进一步包含其它成分，比如一种或多种酶，例如果胶酶，包括内切阿拉伯聚糖酶(endo-arabinanase)、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶(rhamnogalaturonase)、纤维素酶、(其他)木聚糖酶、聚半乳糖醛酸酶(galacturonase)、甘露聚糖酶(mannanase)和/或木糖葡聚糖酶(xyloglucanase)。多肽一般稳定地配制成液体或干燥形式。典型地，产品被制成组合物，其中任选地包括例如稳定缓冲液和/或防腐剂。组合物可能也包括能够消化植物材料或纤维素的其他酶，例如其他纤维素酶，例如(β-D)葡聚糖酶。对于某些特定用途，优选把酶固定于固体基质或掺入到固体载体颗粒上或之中。组合物可能也包括多种其他植物材料降解酶，例如纤维素酶和其他果胶酶。
因此本发明的多肽和组合物可用于处理植物材料以降解或修饰植物或真菌材料的细胞壁的纤维素成分的方法中。因而在更深一步方面，本发明提供了降解或修饰植物细胞的方法，该方法包含把植物或真菌细胞与本发明的多肽或组合物相接触。
本发明也提供处理植物材料的方法，该方法包含把植物材料与本发明的多肽或组合物相接触，以降解或修饰(植物)材料中的纤维素。优选植物材料是植物浆或植物提取物，比如汁液。
尤其，降解优选包含植物细胞壁中纤维素组分的木聚糖亚单元的切割。植物材料优选谷类、蔬菜、水果或者蔬菜的或水果的浆或提取物。本发明进一步提供通过把植物材料与本发明的多肽或组合物相接触可得到的经加工的植物材料。
本发明也提供减少植物提取物粘性的方法，该方法包含在有效降解植物提取物所含的纤维素(或木聚糖)的量下，使植物提取物与本发明的多肽或组合物相接触。
植物和含有纤维素的材料包括植物浆，植物的部分和植物提取物。在本发明的范围内，植物材料的提取物是可通过提取(机械和/或化学法)、加工或其它分离技术而自植物材料中衍生的任何物质。提取物可能是汁液、花蜜、碱或其浓缩物。植物材料可能包含或源自蔬菜，例如胡萝卜、芹菜、洋葱、豆类或豆科植物(大豆、黄豆、豌豆)或水果，例如梨果或种子水果(苹果、梨、温柏等)、葡萄、番茄、柑橘(橙子、柠檬、酸橙、橘子)、瓜、李子、樱桃、红醋栗、红浆果、红莓、草莓、越桔、菠萝和其他热带水果，树木和其部分(例如松树的花粉)，或谷类(燕麦、大麦、小麦、玉米、水稻)。(要水解的)材料可能是农业残渣，比如制糖甜菜浆、玉米碎块、小麦麦杆、(地上的)坚果壳或可重复利用的材料，例如(废)纸。
本发明的多肽因此可能用于处理植物材料，包括植物浆和植物提取物。他们可能也用于处理液体或固体食品或可食用的食物配料，或用于提取咖啡、植物油、淀粉或用作食物增稠剂。
典型地，本发明的多肽作为如上面所述的组合物/酶制剂使用。组合物一般加入通过例如机械处理比如压榨或研磨植物材料而获得的植物浆中。组合物与植物的孵育一般进行10分钟到5小时，比如30分钟到2小时，优选大约1小时。处理温度优选10-55℃，例如从15到25℃，任选大约20℃，每吨待处理材料可能用10到300克，优选30-70克，任选大约50克酶。所有使用的酶或他们的组合物可能按顺序加入或同时加入到植物浆中。依赖于酶制剂的组分，植物材料可能首先需浸软(例如作成泥)或液化。使用本发明的多肽可以提高工艺参数比如提取产量，提取物粘度和/或提取物质量。
另外，或除了上面的之外，本发明的多肽可能加入通过压榨或液化植物浆获得的粗制汁液中。处理粗制汁液可采用处理植物浆相同的剂量、温度和维持时间进行。同样，可能包括前面讨论过的其他酶。典型孵育条件在前面一段中有描述。一旦粗制汁液用本发明的多肽孵育之后，接着离心汁液或(超滤)过滤生产最终产物。
用本发明的多肽处理之后，(终)产物可进行热处理，例如在可以部分或全部灭活本发明的多肽的条件下在100℃维持1分钟到1小时。
含有本发明多肽的组合物也可用于水果或蔬菜浓汤的制备中。
本发明的多肽也可用于酿造、制酒、蒸馏或烘烤中。因此，它可能用于制备含酒精饮料比如酒和啤酒。例如，它可能提高(啤酒、麦芽汁或酒的)过滤性或澄清度。蛋白质可能有助于从肉汤或培养基中去除溶解的有机物，例如在其中有机来源的蒸馏残渣生物转化成微生物的生物质时即如此。木聚糖酶能够改善例如通过液化(如用α-淀粉酶)而由谷物生产的葡萄糖糖浆的过滤性和/或减少粘性。
在烘烤中，多肽能改善面团结构，改变它的粘性或柔软性，提高面包体积和/或面包屑结构或给予更好的结构性质比如裂口、碎片或碎屑质量。可能以剂量从100到3000，比如从150到2000，任选从200到1600 EXU/千克面粉加入多肽。
由于他们的木聚糖酶活性，本发明多肽可用在大量工业领域中。这些可能包括不仅有乙醇的生产，而且有生物甲烷化中、加工面包中和烘烤中、牙齿卫生中(例如牙科用或口服组合物)、处理或制造皮革中、造纸中、药物中、茶中、纺织品制备或处理中和废物处理中。因此，本发明的一个方面是包含多肽的食物或粮食，比如酒精饮料、面包、面团或茶。多肽可能配制成用于任何这些用途的适当组合物。多肽可能存在于水性组合物(例如热水)中，优选其中具有一种或多种杀真菌剂，以处理植物材料(例如球茎)，尤其是控制寄生昆虫、螨虫和线虫。因为本发明的多肽能够降解木聚糖，故可将他们加入食物或粮食(例如被人消费)中。本发明也包括药物组合物和兽用组合物，其中包含本发明的多肽和制药或兽医可接受的载体。
本发明的多肽可能也显示有抗真菌活性。他们可能能够降解真菌细胞壁，因而可能用于降解真菌细胞壁，以打开细胞壁。这可能释放细胞内蛋白质。用这样的方法，多肽可能用于制备酵母和/或真菌提取物。E，动物饲料本发明另外涉及粮食或底物饲料组合物或添加剂，其中包含一种或多种本发明的多肽。多肽以与天然浓度不同的浓度存在于饲料中。优选量为每千克饲料0.6到35mg，比如1.5到15mg，优选3到15mg。适当的，本发明的多肽存在于饲料中的量为从1000到50000 EXU/千克饲料，比如从2500到25000 EXU/千克，任选从5000到20000 EXU/千克。
本发明也涉及制备动物饲料组合物的方法，该方法包含将本发明的多肽加入至一种或多种可食用饲料物质或配料(其中适当地包含木聚糖)。多肽可能与饲料物质或配料分别加入动物饲料组合物中，并单独地或联合其他饲料添加物。多肽可能是饲料物质或配料之一的内在部分。
本发明的多肽也可能加入到富含纤维素的动物饲料中，以提高植物细胞壁的分解，从而提高动物对植物营养物的利用。如果优选预先浸泡的或湿的食物，本发明的多肽可能加入饲料或青贮饲料中。在有利的方面，本发明的多肽可能在体内继续降解饲料中的纤维素。本发明基于真菌的多肽尤其一般具有低最佳pH，能够在诸如动物胃部的酸性环境内释放重要营养物。然而，本发明也涵盖包含一种或多种本发明多肽的(例如动物)饲料或粮食。
本发明的多肽可能也用于由大豆生产牛奶代用品(替代品)的过程中。人和动物都可以消费这些牛奶代用品。制备这些牛奶代用品中的典型问题是大豆浆的高粘度，结果需要不太理想地将浆体稀释到干物质占10到15％的浓度。含有本发明的多肽的酶制剂可能加入浆液中，或在处理过程中加入，以便能够在干物质高浓度下(通常40到50％)操作。在从例如大豆中制备口味好的产品时也可使用所述酶。
组合物可能另外包含(尤其当配制用于动物饲料中时)一种或多种离子载体、氧化剂、表面活性剂、瘤胃保护性氨基酸、酶增强剂或可以在饲养动物胃肠道中天然产生的酶。
当加入反刍动物或单胃动物(例如家禽或猪)的饲料(包括青贮饲料)中时，饲料可能包含谷类比如大麦、小麦、玉米、黑麦或燕麦或谷类副产品比如小麦麸皮糠或玉米麸皮糠，或其他植物材料比如黄豆和其他豆类。酶可能显著性提高植物细胞壁的破坏，使动物更好利用植物营养物。其结果可能提高生长速率和/或饲料转化。本发明的多肽可能加入饲料中(直接或作为添加物或配料)或加入处理过的饲料配料(例如纤维素/木聚糖)来替代。
该蛋白质可能减少(含有木聚糖)饲料的粘度该蛋白质可能在体内继续水解木聚糖。本发明的蛋白质尤其适用于动物饲料中，因为他们在强酸性条件下比如在动物胃中仍然有活性。
尤其优选(外源)添加修饰过的木聚糖酶的方法，是以转基因植物材料和/或(例如转基因)种子形式加入本发明的多肽。因而，多肽可能通过异源基因表达来合成，例如可将编码期望的酶的基因克隆到植物表达载体中，在适当植物表达信号，例如组织特异性启动子，比如种子特异性启动子的控制下表达。包含编码多肽的基因的表达载体，随后被转化进入植物细胞，筛选转化的细胞用于再生成完整植物。因而培养和收获得到的转基因植物，这些植物的包含异源(相对该植物)多肽的部分可本身或在进一步处理之后包括在一种组合物中。(转基因)植物中酶(异源)表达的一般方法，包括酶在种子中特异性表达酶的方法，都是众所周知的30。异源多肽可包含在转基因植物种子中，或包含在植物其他部分中，比如根、茎、叶、木质部、花、树皮和/或果实中。植物可能是单子叶植物或双子叶植物。适当的植物包括谷类，比如燕麦、大麦、小麦、玉米和水稻。优选本发明的多核苷酸稳定性掺入植物基因组中。
以转基因植物材料例如转基因种子的形式加入多肽可能需要处理植物材料，以致该酶可供利用，或至少提高其可用性。这些处理技术可能包括多种机械(例如粉碎和/或研磨)技术或热机械处理比如挤压或膨胀。
本发明也涉及促进单胃和/或非反刍动物生长和/或饲料转换的方法，该方法包含用本发明的多肽饲养动物。适当的动物包括农场、单胃和/或非反刍动物比如猪(或小猪)、家禽(比如小鸡、火鸡)、牛犊或小牛或水生(例如海洋)动物(例如鱼)。纤维素降解酶测试方法在本发明中也包括使用根据本发明的多肽筛选能够作为可调节木聚糖酶的激动剂或拮抗剂起作用的化合物。在通常情况下，这些筛选方法可能涉及使本发明的多肽接触测试化合物，接着测量活性，或把本发明的多肽与测试物进行孵育，接着探测对木聚糖酶活性的任何调节。与本发明的多肽结合的试剂也可以用结合测试方法鉴定。
调控物活性可通过使表达本发明多肽的细胞接触测试物质并监测多肽调节的效果而进行测定。细胞可能在体外表达多肽，优选地，测试使用表达重组多肽的细胞在体外执行。
测试和此处描述的底物容许鉴定和证实木聚糖酶活性。这些测试可用来探测其他纤维素降解酶，例如具有木聚糖酶活性的那些。这个测试中所用的底物可包含木聚糖。
本发明的另一个方面涉及鉴定或探测能够降解纤维素的多肽的测试法。其活性可能是木聚糖酶，或可能是果胶酶、多聚半乳糖醛酸酶、酯酶、纤维素酶、木糖葡聚糖酶、聚半乳糖醛酸酶、阿拉伯聚糖酶或鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶。这个测试可能包含(a)提供适当的底物(如上述)作为候选化合物(通常是多肽)的底物；和(b)使底物与候选化合物接触，并探测是否有任何木聚糖酶活性产物的生成。
上面的测试可用来鉴定木聚糖酶活性的调控物。这些化合物可能减少水果的软化，从而可使水果有更好的香味和颜色，并且有更长的储存和/或运输期限。因而这些测试可用来鉴定可能用于抑制水果软化的本发明多肽的抑制物。
本发明的一个方面优选的特征和性质，加以必要的变更后适用于另一个方面。
本发明将参考下面的实施例来进行描述，它们仅仅对本发明进行了阐述，而没有进行限制。
DNA标记和杂交依据ECLTM直接核酸标记和检测系统(AmershamLIFE SCIENCE公司，Little Chalfont，英国)或依据标准的放射性标记技术1进行操作。实施例1从T.emersonii中分离RNA和cDNA的合成在木聚糖诱导条件下，发酵T.emersonii菌株CBS 393.64。在多个时间点，用Miracloth过滤袋过滤获得菌丝体(mycelium)和培养物上清液。菌丝体用去矿物质水充分洗涤，用纸条挤压去除过多的水。来自选定时间点(基于培养上清液中纤维素酶的测定)的菌丝体在液氮中立即冷冻，用研钵和钵杵研成细小的粉末。将得到的粉末转移至无菌的50毫升管中，称重每1-1.2克研碎的菌丝体，加入10毫升TRIzol试剂(Gibco/BRL)(每管最大加25毫升)。菌丝体粉末经剧烈混合(涡漩振荡1分钟)、随后室温孵育5分钟(不时进行混合)而立即溶解。加入0.2(原始TRIzol)倍体积的异丙醇(即对于开始使用的每10毫升TRIzol，用2毫升)，涡漩振荡，室温保持10分钟。之后，混合物在4℃6000g离心30分钟。转移上部的水相到一个新管中，加入(原始TRIzol)0.5倍体积的异丙醇(即对于开始使用的每10毫升TRIzol，用5毫升)沉淀总RNA。室温沉淀10分钟之后，6000g离心30分钟获得RNA。去除上清液后，用1倍体积70％乙醇漂洗RNA沉淀。去除乙醇之后，风干RNA沉淀。干燥的RNA沉淀溶解于3毫升GTS(100mMTris-Cl，pH7.5，4M硫代氰酸胍，0.5％月桂基肌氨酸钠)缓冲液中。用10微升的RNA溶液确定核酸的质量和浓度1，3。
进行Northern分析3并进一步纯化分离到的RNA。mRNA的分离采用PHARMACIA纯化试剂盒(目录号27-9258-02)的改动后方法(使用引力流代替离心)3。cDNA的合成使用了STRATAGENE cDNA合成试剂盒，基本按照说明进行，只是使用上面描述过的针对pGBFIN载体的主要改动优化3。
合成的cDNA量用TCA沉淀法进行估计，随后通过碱性琼脂糖凝胶电泳分析3。实施例2来自T.emersonii mRNA的cDNA文库的制备实施例1中获得的cDNA文库进行钝化，连接衔接头，用限制性酶消化3。
cDNA克隆进入表达载体pGBFIN-113需要在cDNA的5’端有EcoRI位点，3’端有XhoI位点。因此，第一条链引发寡核苷酸和所用的衔接头序列(Pharmacia)选择成适合表达载体的先决条件。
获得的cDNA用SEPHAROSE CL-2B基质进行大小分级分离，在其中单个获得的库的大小可以通过不变性凝胶电泳进行分析3。cDNA的两个库，分别通过切下0.5kb和1.0kb获得，选择用于在pGBFIN-11中构建cDNA文库。对于pGBFIN-11，制备得到完全双酶切(EcoRI-XhoI)的pGBFIN-11载体库(背景连接＜1％)。将选择的cDNA库连接进入pGBFIN-11载体，转化进入大肠杆菌XLI0-Gold细菌细胞，产生两个基本cDNA文库。两个库的转化频率都＞1.0×106。
从两个大肠杆菌cDNA文库的一部分中，随机选择克隆，分离质粒DNA。对此质粒DNA的分析显示，cDNA文库具有插入片段的百分比在90和95％之间。
此外，从文库的一部分中进行克隆转印，产生的滤膜随后与T.emersonii gpdA基因杂交，此基因编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因。下一步，分离质粒DNA，限制性分析显示所有质粒含有正确方向的单个插入片段。对含有T.emersonii gpdA基因的质粒内的cDNA的5’端测序显示＞85％是全长。实施例3表达文库转化进入黑曲霉自大肠杆菌cDNA文库如前面所述分离DNA。全部质粒DNA在37℃用NotI消化4小时，去除大肠杆菌来源的质粒序列。纯化之后，将DNA溶解于无菌的去矿物质水中。
多个黑曲霉DS2978转化中，每次转化使用1.5×107到3.0×107个原生质体，10微克质粒DNA进行3。通过在含有乙酰胺作为唯一氮源的培养基上生长，选择转化体中amdS选择标记的存在。由于整合片段中同时存在amdS选择标记和cDNA表达盒二者，因此在乙酰胺上生长表明存在cDNA表达盒。
30℃孵育大约7-10天后，纯化10000个转化体将黑曲霉转化体采用机械手(FlexysTM菌落自动取样器)电转化板转移至96孔MTP主培养板(Master Plate，MPs)上，其中每孔含有150微升固体选择性培养基(SM)(每1000毫升0.52克KCl，1.52克K2HPO4，0.52克MgSO4，20克葡萄糖，1克乙酰胺，0.1M MES缓冲液，15克琼脂，1毫升痕量元素溶液(每升含有2.2克ZnSO4/7H2O，1.1克H3BO3，0.5克FeSO4/7H2O，0.17克CoCl2/6H2O，0.16克CuSO4/5H2O，0.15克NaMoO4/2H2O，5.0克EDTA，pH6.5)，pH5.5)。转化体在选择性培养基上34℃生长5天。因此产生的MPs用于接种MTPs，进行生长和随后酶检测，备份cDNA文库的培养板(BPs)-80℃保存。实施例4T.emersonii表达文库的分析已经生长5天的MPs用作复制模板，复制到新鲜选择性培养基(SM)板上，该板上含有0.075％的AZCL-木聚糖(每升含有0.52克KCl，1.52克K2HPO4，0.52克MgSO4，20克葡萄糖，1克乙酰胺，0.1MMES缓冲液，15克琼脂，1毫升痕量元素溶液(每升含有2.2克ZnSO4/7H2O，1.1克H3BO3，0.5克FeSO4/7H2O，0.17克CoCl2/6H2O，0.16克CuSO4/5H2O，0.15克NaMoO4/2H2O，5.0克EDTA，pH6.5)，pH5.5，0.75克AZCL-木聚糖(Megazyme，澳大利亚))。
一旦接种，即将培养板在34℃孵育48小时，接着65℃孵育6小时。培养板在高温孵育之前和之后进行计数。显示木聚糖酶活性的阳性克隆呈现蓝色扩散晕。
将此第一次筛选得到的阳性木聚糖酶克隆重新接种于新鲜选择性培养基上，34℃生长5天。将由此获得的模板复制到选择性培养基和含有0.075％(w/v)AZCL-木聚糖(Megazyme)的选择性培养基上。AZCL-木聚糖培养板如上面所述进行处理。
选择性培养板在34℃孵育48小时，随后用含燕麦木聚糖(5克琼脂糖，0.5克燕麦木聚糖(Sigma refX0627)预先溶于1升50mM磷酸缓冲液(pH7))的上层琼脂装满。一旦上层琼脂凝固后，将培养板在65℃孵育4小时。为了使活性容易观测，用Congo红溶液(10克Congo红溶于1升pH7.0的磷酸缓冲液)染色培养板15分钟。弃染色液，用1M NaCl漂洗培养板。这个漂洗步骤需要重复两次。阳性克隆在(Congo)红背景上显现出白色清亮晕。最后，鉴定得到9个阳性木聚糖酶克隆。
将产生木聚糖酶的曲霉转化体(用木聚糖酶培养板测试鉴定)进行摇瓶发酵3。发酵5天后取培养基样品，如下分析其木聚糖酶活性。
上清液(如果需要，预先稀释)用0.25M pH4.5乙酸钠缓冲液稀释5倍。将20微升稀释的上清液转入微量滴定盘，加入50微升底物(4％(w/v)Remazol Brilliant Blue RBB-木聚糖(70℃溶解于去矿物质水中))，用加样器上下吹吸而彻底混和。反应混合物室温孵育30分钟。加入200微升96％乙醇，室温孵育10分钟，以终止反应。反应终止后，微量滴定板用Beckman GPK离心机2500rpm室温离心10分钟。将100微升上清转入新的微量滴定盘，用分光光度计Anthosreader(Proton and Wilton)测定620nm蓝光的吸收。比活性用标准曲线来计算，其使用溶于0.25M pH4.5乙酸钠缓冲液中的木聚糖酶标准品制得。实施例5阳性转化体的遗传分析将实施例4鉴定的阳性(再次证实)转化体在液体培养基中生长，收获菌丝体，从丝状真菌中采用Puregene分离系统(Biozym B.V.)分离总(染色体)DNA。DNA分离和纯化依据说明书进行操作，但是有细微改动蛋白质沉淀步骤3和4重复一次。
染色体DNA用于PCR反应中作模板，引物使用12207(SEQ ID No.4)和11937(SEQ ID No.3)，以扩增整合入染色体DNA内的表达盒中的插入序列。
对转化体直接进行的PCR按照已知方法4修正后进行，只是获得的菌丝体随后用浓度为5毫克/毫升的GlucanexTM(Novo Nordisk)处理而不是用NOVOzyme处理。
PCR反应中含有eLONGaseTMB缓冲液(Life Technologies，Breda，荷兰)，dNTP(各200μM)，1微升eLONGaseTM酶混合物EnzymeMix，1-5微升模板，各种寡核苷酸10-30pmol，总体积50微升。寡核苷酸的最优用量针对所购买的每一批次经实验测定。一般使用10-30pmol。反应按下面的循环条件执行94℃1×(2分钟)，35×(94℃1分钟，55℃1分钟，72℃6分钟)，1×(72℃7分钟)。将样品加载在琼脂糖凝胶上分析PCR产物。
将因而获得的PCR产物亚克隆进入大肠杆菌pcr2.1克隆载体(Invitrogen，根据说明书操作)，结果得到质粒pGBXEA-1。含有质粒pGBXEA-1的大肠杆菌菌株存放于真菌菌种保藏中心(Centraal Bureauvoor Schimmelcultures)，Baarn，荷兰，其保藏号为CBS 102183。
对亚克隆的PCR产物进行测序。所得的编码区域的核苷酸序列在SEQ ID No.1中描述，依据其推断出的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。此蛋白质命名为XEA。实施例6Talaroymyces emersonii木聚糖酶的性质确定本发明中的内切木聚糖酶活性单元(Endo Xylanase Unit，EXU)的定义木聚糖酶活性单元定义为在测试条件下每分钟可以释放4.53微摩尔还原糖(测量为木糖等价物)的酶(来自黑曲霉的endoI，内切-1，4-β-木聚糖酶31)的用量。测试条件包含5毫克/毫升来自小麦粉的阿拉伯糖木聚糖(Megazyme，澳大利亚，2/11 Ponderosa Parade，Warriewood NSW 2102)溶于100mM柠檬酸钠缓冲液(pH3.5)，温度40℃，反应时间为60分钟。加入1M NaOH终止反应。使样品与Fe-III-六氰化物在沸水中孵育15分钟后进行420nm比色测定。把1.17克KFe(CN)和19.5克无水碳酸钠溶于1升水中，制成六氰合铁(hexacyanoferrate)试剂。粘度测试除了上面的木聚糖酶绝对活性确定方法之外，也使用相对活性方法其中测定加入一定量的酶之后小麦阿拉伯糖木聚糖(Megazyme，澳大利亚，2/11 Ponderosa Parade，Warriewood NSW 2102)溶液的粘度。小麦阿拉伯糖木聚糖溶于0.425M柠檬酸钠缓冲液(pH3.5)中，至浓度达到8.3毫克/毫升。底物于55℃孵育10分钟。随后加入少量酶(范围为0.01-0.05单元/毫升)，开始反应。反应60分钟之后，参考与已知EXU活性的黑曲霉内切木聚糖酶标准31孵育时的数值确定样品的粘度。标准品的EXU绝对活性用上面所述的使用Fe-III-六氰化物的还原糖方法来确定。使用Haake下降小球粘度计手动确定粘度。还原糖活性分析根据XPU定义的酶活性的确定通过用4-羟基苯甲酸酰肼(PAHBAH)检测还原糖而进行。一个XPU活性定义为，pH5.0，60℃15分钟内，从小麦阿拉伯糖木聚糖上每分钟释放1微摩尔还原糖所需要的酶量，其中使用D(+)木糖的校正曲线。这是已知的试验32，并改进了PAHBAH试剂如下0.05M柠檬酸三钠，0.1M Na2SO3，0.02M CaCl2，0.5M NaOH和0.1M对羟基苯甲酸酰肼(PAHBAH)。最终的pH是12。在碱性溶液中含有PAHBAH、室温储存的该试剂当天之内使用。420nm处测定吸收。加入100微升0.1M柠檬酸钠缓冲液替代酶溶液来制备空白。用溶于0.1M乙酸钠缓冲液(pH5.0)的400微升0.35％小麦阿拉伯糖木聚糖(Megazyme)混和100微升(稀释的)酶溶液，由此测试木聚糖酶活性。具有底物的Eppendorf杯预先60℃孵育5分钟。加入酶溶液开始反应。15分钟后加入1.0毫升PAHBAH-试剂终止反应。Eppendorf杯100℃加热5分钟，之后在冰内冷却。样品在适宜速度下离心，以离下任何固体材料，例如Beckman Microfuge E全速离心1分钟。在420nm测量吸收。通过加入100微升替代酶溶液来制备空白。测量范围是0.01-0.1XPU/毫升。木聚糖酶的纯化向43毫升无细胞的肉汤中加入10.45克硫酸铵，用Aktaexplorer 100(Pharmacia Biotech)Column走Ethyl SepharoseTM柱介质为15 ETH Source(code 17-0146-01，Pharmacia Biotech)(柱子参数为，直径D＝1.6cm，长度1＝4.8cm，体积V＝9.6ml)。柱子用100mM醋酸钠和40％饱和硫酸铵pH5.0平衡。洗脱使用线性梯度，在20个柱体积内达到100mM醋酸钠(pH5.0)。级分大小5毫升。流速10毫升/分钟。监测波长280，254，214nm。测定各级分的木聚糖酶，用HPLC-大小排阻层析(Size Exclusion Chromatography，SEC)进行分析。
将最纯的木聚糖酶级分按照后面的条件加入Sephacryl S200柱。仪器为Akta explorer 100(Pharmacia Biotech)。柱子HiPrep16/60 Sephacryl S200 HR(Pharmacia Biotech)。平衡和洗脱使用100mM醋酸钠缓冲液(pH5.0)。流速1毫升/分钟。级分大小4毫升。监测波长280，254，214nm。洗脱级分的纯度用HPLC-SEC、SDS-PAGE和自然PAGE进行分析。蛋白质浓度蛋白质浓度通过测量OD280测定。来自T.emersonii的(成熟)木聚糖酶含有11个色氨酸残基(位置72，108，115，121，148，300，302，308，322，377和385)和23个酪氨酸残基(位置36，51，109，141，146，161，167，169，174，192，193，196，200，218，281，306，316，326，332，348，395，403和404)。计算出的摩尔消光系数为89530M-1·cm-1。分子量为41637克/摩尔。1毫克/毫升XEA的OD280为2.15。来自T.emersonii的木聚糖酶(XEA)的比活性使用还原糖PAHBAH方法在40℃和60℃确定比活性。XEA在这两个温度的比活性分别是150XPU和500XPU。蛋白质浓度用OD280分析来确定。
N-末端序列发现纯化的成熟XEA的N-末端氨基酸序列是Ala-Gly-Leu-Asn-Thr-Ala(成熟序列中的第一个Ala残基是SEQ.ID.No.2中的Ala23)。等电点(Iso-Electric Point，IEP)仪器Phast系统(Pharmacia Biotech)，IEF 3-9 Phastgel(Pharmacia Biotech)。凝胶电泳，(考马斯，Coomassie)染色根据制造商提供的标准Phast系统操作程序。用Phastgel IEF 3-9等电聚焦确定出的IEP为大约3.3。分子量使用Phast系统(Pharmacia Biotech)，Phastgel(PharmaciaBiotech)，SDS-缓冲液条/天然-缓冲液条(Pharmacia Biotech)，进行SDS-PAGE电泳。
样品处理将1倍体积缓冲液(500mM Tris-HCl pH6.8，10％SDS，0.1％溴酚蓝)与4倍体积样品混合，煮沸3分钟。凝胶电泳和染色(考马斯染色或银染)根据标准Phast系统方法进行。用分子量标准(Pharmacia)测定出SDS-PAGE上的分子量为大约63千道尔顿(kD)。基于氨基酸组成计算出的分子量是41637道尔顿。
此外，使用凝胶过滤分子量标准(BIORAD，目录号151-1901)经凝胶渗透色谱法测定分子量。经高效-SEC测定的分子量为42kD。(HP-SEC使用TSK G3000SW(目录号05103，Toso Haas)柱进行。样品室温下用0.1M磷酸钠(pH7.0)以1毫升/分钟洗脱。在280nm进行检测。)SDS-PAGE中观察到的高分子量可能是估计过度。它可能是木聚糖酶糖基化引起的。去糖基化将5微升纯化酶(约5毫克/毫升)与20微升0.5％SDS和25微升1％巯基乙醇混合。混合物煮沸4分钟。冷却后，加入20微升N-糖苷酶F(500单元/毫升)和20微升溶于磷酸钠缓冲液(pH7.0)中的3％Triton X-100。接着37℃孵育过夜，用SDS-PAGE分析去糖基化。氨基酸序列暗示存在2个糖基化位点(Asn56和Asn123，见SEQ ID No.2)SDS-PAGE显示经N-糖苷酶F处理的木聚糖酶迁移得更远，分子量低于未处理或预先处理(用SDS和β-巯基乙醇煮沸)的木聚糖酶。因此，SDS-PAGE中观察到的令人惊讶的高分子量可能是糖基化引起的。pH和温度曲线在不同pH和温度分析无细胞肉汤的木聚糖酶活性。用PAHBAH还原糖方法，在pH4下的不同温度(见表1A)或者在60℃下的不同pH(见表1B)，分析木聚糖酶活性。表1A显示，XEA的最优温度是80℃左右。表1B显示，XEA的最优pH是pH4和pH5之间(这儿有两栏数字，因为实验进行了两次)。表1A木聚糖酶温度依赖性
表1BpH依赖性
热稳定性差示扫描量热法(Differential Scanning Calorimetic，DSC)分析解折叠温度XEA的解折叠温度(unfolding temperature)用DSC确定。所用的测量方法采用醋酸钠缓冲液(pH 5)，2-4毫克/毫升，加热速率2.5℃/分钟。发现XEA的解折叠温度(Td)是80.1℃。T50的测量T50是孵育20分钟后残留50％活性时的温度，因而是热稳定性的一个度量参数。T50孵育按下面进行。稀释木聚糖酶样品，以致最终木聚糖酶浓度在PAHBAH测试(XPU单元)的测量范围之内。接着用0.1M醋酸钠缓冲液(pH5)(其中含有1毫克/毫升牛血清白蛋白(BSA)以防止特异性吸附和在管子表面变性)进行稀释。缓冲液在60，70，80，85和90℃用热混合仪(thermomixer)预热5分钟，之后加入木聚糖酶。样品加热20分钟，冰内冷却。用PAHBAH测试测量活性。
表2中显示了在给定温度下，20分钟孵育后残留活性占未孵育对照的百分比。从此表可以得出T50它是82℃。表2XEA木聚糖酶的热稳定性
另外，在EDTA存在的情况下，在不同pH测定T50值。结果如表3所示。
表3确定pH和金属离子对XEA稳定性的影响。(1pH7和8低温度区数据点太少)XEA在pH4到pH5之间最稳定。低于pH3.5和高于pH5.5，其热稳定性开始下降，但是仍然好于大多数现在已知的真菌木聚糖酶。EDTA的存在不影响T50。这意味着XEA的稳定性不依赖于可以和EDTA络合的阳性金属离子。实施例7动物饲料中使用篮霉菌木聚糖酶(XEA)
用雄性肉仔鸡(Cobb)进行一个试验。它们1到5天龄时养在鸡圈中，喂以市售肉仔鸡开始饲料(broiler-starter feed)。5天龄时，基于它们各自的体重，把动物随机分成54笼。从5到19天龄开始，每笼有15只肉仔鸡。19天龄时，每笼动物数目减少为12只。分配6笼用做一组。因为试验单元是笼，这意味着每组有6次重复。
这些笼中使用三列笼系统(cage sytem)，配置了人工加热、照明和通风。每笼底板面积为0.98平方米，是金属丝制成的底板。房间照明为24小时/每天，但是光密度在试验过程中逐渐降低。温度也逐渐降低从第一周的28℃到最后一周的23℃。试验中的湿度保持在大约60％。按照正常接种疫苗程序给动物接种以抗传染性支气管炎和新城疫疾病。
这个试验中包括9组。对基于小麦的食谱(见表4)，没有加入任何酶(对照)，或加入大约相当于2500，5000，10000或25000 EXU/千克饲料的篮霉菌内切木聚糖酶(XEA)或黑曲霉内切木聚糖酶(EndoI，一种内切-1，4-β-内切木聚糖酶31，购买自DSM N.V.，AgriIngredients，Delft，荷兰)作为对照。将酶加入预先混合成预混物的颗粒状产品形式的饲料中。动物可以随意食用饲料颗粒。在颗粒化过程中，颗粒的温度不超过大约70℃。水也是自由供给的。
确定5-19天龄和5-33天龄时期的体重增量(Body Weight gain，BWG)和饲料转化率(feed conversion rate，FCR)。表4饲料组成和主要营养物含量
*食谱所含的维生素和痕量金属水平是荷兰的正常水平。食谱中没有加入抗生素生长促进剂和球虫抑制剂(coccidiostat)。
表5所示的本试验的结果显示了两个时期肉仔鸡的平均体重增量和饲料转化率。酶加入量以活性单元(EXU)显示。由于体重增量增加，饲料转化率(FCR)降低，因为饲料转化率是生长所需饲料的量(g)。表5
使用含有所述酶的食谱，生长和饲料转化率都显著性(P＜0.05)提高，14天实验期之后和全部实验期之后都如此。不同剂量观察到少许不同，但是XEA酶和市售酶一样好，甚至更好。实施例8Talaroymyces emersonii内切木聚糖酶(XEA)在烘烤中的性能用标准烘烤方法制备模制面包，方法如下混合3500克小麦面粉(80％Kolibri和20％Ibis小麦面粉(Menaba，荷兰)的混合物，大约21℃)、77克压缩(Konings)酵母、70克盐、25ppm抗坏血酸、10ppm 真菌α-淀粉酶 FermizymeTMP200(DSM N.V，BakeryIngredients，Delft，荷兰)和不同量的内切木聚糖酶XEA酶和2030毫升水(8-15℃)，用螺旋混合器(Hobart)混合2分钟(速度1)和6分钟(速度2)，使用125Wh(Watt-hours，瓦-小时)能量。面团温度是28℃。面团的切削性由合格的面包师手工分析。
混合面团后立即切成6块，每个875克，揉圆之后，在发酵室中34℃和85％RH(相对湿度)醒面35分钟。此阶段末期将面团定形和模制(panned)，随后在发酵室中38℃和87％RH(相对湿度)醒面75分钟。之后，完全醒面的面团在电炉中210℃烘烤30分钟。冷却至室温之后，面包块体积用油菜籽替换法确定。在密闭聚乙烯袋中室温储存16-24小时之后，由合格的面包师估计面包屑质量。结果如表6所示。表6
面团的质量非常好。仅仅在XEA内切木聚糖酶最高剂量时，操作面团时有点粘。然而这点粘性并不影响面团的切削性。所有含内切木聚糖酶XEA的面团都非常柔软，容易操作。
从这些烘烤结果可以推断，内切木聚糖酶XEA对于提高面包质量非常有效，在面包体积和面包屑质量两个方面均如此。尽管面包体积大，但是面包屑结构仍然非常规则和细密。实施例9和相比较的实施例10比较Talaroymyces emersonii酶(XEA)和来自黑曲霉的内切木聚糖酶在烘烤中的性能在荷兰模制面包生产中将XEA的烘烤表现与目前使用的来自黑曲霉的真菌内切木聚糖酶进行比较。这个黑曲霉内切木聚糖酶以其纯的市售形式提供，即FermizymeTMHSP6000。FermizymeTMHSP是制作面包的好酶，但是它会增加面包粘度，而且不能总是充分增加面包的体积。
精确重复了实施例7的步骤，只是内切木聚糖酶酶XEA和FermizymeTMHSP6000使用不同的用量。
结果如表7所示。表7
#面包体积太大，因而形成了蘑菇形状面包。
从结果可以明显看出，内切木聚糖酶XEA不增加面包的粘性，而提高面包体积的程度比FermizymeTMHSP的要大。此外，当用XEA替换FermizymeTMHSP时，达到相同面包体积时，每千克面粉所需要的内切木聚糖酶单元更少。相同体积时断裂和撕碎质量也相似。加入EXA所获得的面包屑结构至少和FermizymeTMHSP所获得的一样好。
总体上，内切木聚糖酶XEA解决了一些使用FermizymeTMHSP时遇到的面团和面包制作的问题。面团没有变粘，获得的面包体积更大，而且即使体积比较大，面包屑结构仍然非常规则和细密。实施例11颗粒化稳定性试验将玉米淀粉(4543克)置入ErwekaTMZ-揉面团机中。接着在混合的同时将1069克含有本发明木聚糖酶的发酵液超滤物(批号XEA 502-8m，其具有43553 EXU/克和6.7％干物质)加入淀粉中，得到含有大约15000EXU/克的湿混合物(干燥至94％干物质时)。加入液体之后，再持续混合10分钟。
混合物在真空干燥室(40℃)中干燥12小时至94.5％干物质。接着用ErwekaTM Freewitt磨粉机把它磨细通过1毫米筛子。这就是实施例11A。
使用LyxasanTMBatch OP0036(含有了可以从DSM N.V，AgriIngredients，Delft，荷兰购买的内切-1，4-β-内切木聚糖酶31)重复相同操作。向5885克淀粉中，加入具有42550EXU/克和3.7％干物质的1984克超滤物(ultrafiltrate，UF)。此混合物干燥至94％干物质，与实施例11A同样磨细。(这构成了比较实施例11B)第三个例子是商业包装产品叫做Biofeed Wheat CT，它可以从丹麦的Novo Nordisk购买。它含有一种来自Thermomyces lanuginosis的G-型木聚糖酶，有脂肪包覆层。(比较实施例11C)所有三个样品都在颗粒化试验中三个不同温度进行测试。对于一种动物饲料(组成如下面表8所示)，酶混合物以两个不同浓度0.24％(11A)和0.1％(11B，11C)加入。混合后，饲料在容器中用蒸气加热至65℃、75℃或85℃，随后通过65毫米厚的上面有5毫米直径孔的印模进行颗粒化。立即冷却。接着测量颗粒中的残留活性，稳定性测试结果如表9所示。表8动物饲料组分
表9酶的颗粒化(pelleting)稳定性
正如可以看到的，本发明的XEA蛋白质在高温度(85℃)下的稳定性比目前市场上产品的稳定性好得多。实施例12对芳基-β-D-木糖苷的活性使用两种底物5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-β-D-吡喃木糖苷(CAS注册号207606-55-1，也称作X-b-D-xyl)和4-伞形基(umbelliferyl)-β-D-吡喃木糖苷(CAS注册号6734-33-4，也称作4-MU-b-D-xyl)，以筛选木糖苷酶活性。将它们直接加入培养基中。含有文库的菌株在96孔板上培养。这样主板(master plate)可以在检测培养基上容易的复制。文库生长于选择性培养基上(0.52克/升KCl，1.52克/升K2HPO4，0.52克/升MgSO4，2％葡萄糖，10mM乙酰胺，1/1000痕量元素(2.2克ZnSO4/7H2O，1.1克H3BO3，0.5克FeSO4/7H2O，0.17克CoCl2/6H2O，0.16克CuSO4/5H2O，0.15克NaMoO4/2H2O，5.0克EDTA，pH用KOH调整为6.5，用0.45微米滤膜过滤除菌)，用KOH调pH(10N调到pH6))，另含有X-b-D-xyl或4-MU-b-D-xyl(浓度分别为200毫克/升和150毫克/升)。X-b-D-xyl事先溶解在小体积二甲基甲酰胺(dimethylformamid，DMF)中。培养板在33℃孵育48小时，接着65℃孵育6小时。培养板在65℃孵育6小时之前和之后进行评分。X-xyl培养板的分析直接基于存在(或不存在)青绿色蓝色晕(turquoise blue halo)而进行。4-MU-xyl板上的木糖苷酶活性的检测采用把培养板置于310nm波长紫外光之下进行。阳性克隆显示为被蓝色荧光晕(bluefluorescent halo)环绕。
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1.一种木聚糖酶多肽，其包含(i)来自SEQ ID No.2的氨基酸23到408的氨基酸序列；或(ii)能够切割木聚糖的(i)的变体；或(iii)能够切割木聚糖的(i)或(ii)的片段。
2.权利要求1的一种多肽，其中变体(ii)与SEQ ID No.2的氨基酸23到408的氨基酸序列有至少70％或80％相同，和/或(iii)的片段有至少150个氨基酸的长度。
3.权利要求1或2的多肽，其可切割β-D-木聚糖中的(1→4)连接键或相邻吡喃木糖基单元。
4.具有阿拉伯木聚糖酶和木糖苷酶活性的多肽。
5.任何一个上述权利要求的多肽，其可获得自(a)真菌；或(b)篮霉菌属(Talaromyces)的生物体，任选Talaromycesemersonii的生物体。
6.一种多核苷酸，其包含(a)SEQ ID No.1的核酸序列或编码任何上述权利要求的多肽的序列；(b)与(a)中所定义序列互补的或可杂交的序列；(c)(a)或(b)中序列的至少100个核苷酸长的片段；(d)与(a)、(b)或(c)中定义的序列至少70％相同的序列；或(e)(a)到(d)定义的任一序列的遗传密码简并性序列。
7.权利要求6的序列，其中(b)中的杂交在严格性条件进行，(c)中的片段是至少200个碱基长和/或(d)中的相同性是至少80％。
8.权利要求7的多核苷酸，其包含(a)编码具有木聚糖酶活性的多肽的序列，它是(1)SEQ ID No.1的核苷酸69到1224的编码序列；(2)可与(1)定义的序列的互补序列选择性杂交的序列；或(3)(1)或(2)定义的序列的遗传密码简并性序列；或(b)与(a)中定义的多核苷酸互补的序列。
9.权利要求6到8中任何一项的多核苷酸，它是DNA序列。
10.包含权利要求6到9中任何一项的多核苷酸序列的载体。
11.权利要求10的载体，它是表达载体，比如其中权利要求9的DNA序列可操作性连接了调控序列。
12.一种宿主细胞，其包含权利要求6到9中任何一项的多核苷酸作为异源序列。
13.一种宿主细胞，其表达权利要求1到5中任何一项的多肽作为异源蛋白质。
14.一种宿主细胞，其被转化了权利要求8的DNA序列或权利要求10的载体。
15.生产权利要求1到5中任何一项的多肽的方法，该方法包含在提供多肽表达的条件下培养权利要求12到14中任何一项定义的宿主细胞。
16.含有权利要求1到5中任何一项的多肽的组合物。
17.权利要求16的组合物，其中进一步包含具有纤维素酶、内切阿拉伯聚糖酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶或多聚半乳糖醛酸酶活性的多肽。
18.处理植物或含木聚糖材料的方法，该方法包含使所述材料接触权利要求1到5中任何一项的蛋白质或者权利要求16或17的组合物。
19.权利要求18的方法，其中的处理包含降解、水解或修饰材料中的木聚糖或者降解或修饰植物细胞壁。
20.权利要求18或19的方法，其中的处理包含切割吡喃木糖基或β-D-木聚糖亚单元和/或所述材料包含植物、植物浆、植物提取物或可食用粮食或成分。
21.一种加工过的材料，其可通过将植物或含木聚糖材料接触权利要求1到5中任何一项的多肽或者权利要求16或17的组合物而获得，或由权利要求18到20中任何一项的方法产生。
22.权利要求18到22中任何一项的方法，其能够减少材料的粘度，降解或水解材料中含有的木聚糖，或者改善材料的澄清度或过滤性。
23.权利要求1到5中任何一项的多肽或者权利要求16或17的组合物的应用，其用于处理植物材料的方法中，提高含木聚糖液体的过滤性和/或减少其粘度，提高含酒精液体(例如啤酒，酒)或水果或蔬菜汁的过滤性或使其澄清，水解农业残留物，用于再循环材料(例如包含纸)在造纸中用于增稠粮食和/或提取期望的材料(例如咖啡、植物油、淀粉)，加工植物浆、汁液或提取物，增加面包体积、面包质量或减少面团粘性。
24.一种(动物)饲料、食物或粮食，其包含权利要求1到5中任何一项的多肽。
25.权利要求1到5中任何一项的多肽应用于酿造、啤酒或酒制造、蒸馏、再循环、生物甲烷化、口腔卫生、皮革处理、造纸、水果或蔬菜汁或提取物处理、纺织品处理或制造、烘烤或制作面包、处理花苞、制备食物或食品或动物饲料中。
26.权利要求24的食物或粮食，它是含酒精啤酒、面包、面团或茶。
27.转基因生物体，比如植物或其部分，其中包含权利要求12到14中任何一项的细胞。
全文摘要
本发明公开了具有木聚糖(内切)酶活性的新型多肽，可以降解掺杂纤维素的提取物和植物材料。此多肽能够切割β－D－木聚糖内部相邻吡喃木糖基单元之间的(1－4)键。本发明提供了此多肽的氨基酸序列和编码DNA序列，所述多肽可用于处理可食用食品和动物饲料中的纤维素。该多肽兼具有阿拉伯木聚糖酶和木糖苷酶活性。
文档编号C12N15/09GK1454259SQ00819966
公开日2003年11月5日 申请日期2000年9月21日 优先权日2000年9月21日
发明者J·P·T·W·范德哈姆比尔格斯, J-M·范德兰, J-M·G·达兰 申请人:Dsm公司