专利名称：恶臭假单胞菌及其在拆分扁桃酸外消旋体中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株恶臭假单胞菌及其用途。
背景技术：
扁桃酸(α-羟基苯乙酸)是一种重要的制药中间体。较之扁桃酸的消旋体，其单一对映体(右旋或左旋的扁桃酸)的使用价值更高。因此，如何能简便高效地获得扁桃酸的单一对映体成为研究热点。
美国专利4,322,548提到了一种利用光学活性苯甘氨酸酯和苯甘氨酸酯盐酸盐作为拆分剂，通过与扁桃酸形成非对映异构体来达到拆分扁桃酸的目的，此方法的缺点是必须使用昂贵的手性拆分剂和大量的有机溶剂，而且拆分步骤比较繁琐；文献J.Chem.Soc.Perkin TransI.1992，2253-2255报道了脂肪酶在有机相中催化转酯化拆分扁桃酸及其衍生物，获得光学纯度≥97％ee的(S)-(+)-扁桃酸和≥99％ee的(R)-(-)-扁桃酸，但此方法的缺点是反应时间较长，转化率不高；文献Appl.Environ.Microbiol.1991，57(10)，3028-3032报道了利用粪产碱杆菌细胞催化消旋体扁桃腈选择性水解生成光学纯(R)-(-)-扁桃酸，其缺点是存在安全隐患。因此，如何能简便、安全和高效地获得扁桃酸的单一对映体成为本发明需要解决的技术问题。
发明内容
本发明目的之一在于，提供能选择性降解(R)-(-)-扁桃酸的菌株；本发明目的之二在于，提供一种应用上述菌株拆分扁桃酸外消旋体的方法。
本发明的发明人从土壤中，经初筛、复筛及分离纯化，获得一株能选择性降解外消旋扁桃酸中(S)-(+)对映体的芽胞杆菌(Bacillus sp.)ECU1008，该菌株在2005年6月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.1387；同样，发明人通过筛选从土壤中获得另一株能选择性降解外消旋扁桃酸中(R)-(-)对映体的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)ECU1009，该菌株在2005年6月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.1388。
CGMCC No.1387菌株具有如下特征1、大小形态杆状，大小2～3μm，在产芽孢培养基中培养数天后产梭状芽孢，革兰氏染色阳性；2、适合生长环境可在温度10～40℃，pH5～9、NaCl浓度0～7％(w/v)环境中生存；3、平板培养菌落特性同心圆状；突脐状；黄色。
CGMCC No.1388菌株具有如下特征1、大小形态杆状，大小2～3μm，不产芽孢，革兰氏染色阴性；2、适合生长环境可在温度10～40℃，pH5～9、NaCl浓度0～7％(w/v)环境中生存；3、平板培养菌落特性圆形，边缘整齐；低凸面；乳白色。
CGMCC No.1387菌株或CGMCC No.1388菌株在拆分扁桃酸外消旋体中的应用，其主要步骤如下将CGMCC No.1387菌株或CGMCC No.1388菌株按1～10v/v％接种量接种至生物转化培养基，于20～40℃(优选25～35℃)状态下保持1～5天(优选2～3天)后经离心除去菌体后得水相，调节所得水相pH值小于3后，经萃取后得(R)-(-)-或(S)-(+)-扁桃酸；其中所说的生物转化培养基为外消旋扁桃酸0.1～5wt％，玉米浆0.1～2wt％，NH4NO30.1～0.5wt％，K2HPO40.1～0.5wt％，KH2PO40.1～0.5wt％，NaCl 0.1～0.5wt％，MgSO40.1～0.5wt％，余量为水。
在本发明中，CGMCC No.1387菌株或CGMCC No.1388菌株在用于拆分扁桃酸外消旋体前最好在由葡萄糖0.1～3wt％，蛋白胨0.1～3wt％，酵母膏0.1～3wt％，外消旋扁桃酸0.1～3wt％，K2HPO40.1～0.5wt％，KH2PO40.1～0.5wt％，NaCl 0.1～0.5wt％，MgSO40.1～0.5wt％，琼脂0～2wt％和余量为水组成的预培养基中进行预培养，预培养的温度20～40℃，预培养的时间为1～6天。
利用本发明公开的两株细菌及类似的工艺，还可以拆分扁桃酸衍生物的消旋体，如对羟基扁桃酸、对氯扁桃酸、间氯扁桃酸和邻氯扁桃酸等消旋体。
采用本发明所用的生物转化工艺，不仅能简单方便地获得高纯度的(R)-或(S)-扁桃酸，而且生产成本比现有技术的低，是一种具有广泛应用前景的生产方法，可以满足迅速发展的医药工业的需要。
具体实施例方式
以下通过实施例对本发明的技术内容作进一步的描述。其目的仅在于更好理解本发明内容，而非限制本发明的保护范围实施例1菌株的筛选取少量土壤稀释液上清涂平板(含富集培养基，其组成为苯甲酰甲酸2.0g，(NH4)2SO42.0g，K2HPO41.0g，NaCl 1.0g，MgSO40.5g，琼脂20g，自来水1000ml，pH 7.0)，在25～40℃下倒置培养2～4天，挑单菌于丰富培养基平板上培养1～2天，再将单菌落接种至液体发酵培养基(甘油15.0g，蛋白胨5.0g，酵母膏5.0g，K2HPO41.0g，KH2PO41.0g，NaCl 1.0g，MgSO40.5g，自来水1000ml，pH 7.0)中培养24小时，离心收集菌株Bacillus sp.ECU1008或Pseudomonas putida ECU 1009。
实施例2将Bacillus sp.ECU1008(CGMCC No.1387)菌株接种至40ml生长培养基(葡萄糖1.5wt％，蛋白胨0.5wt％，酵母膏0.5wt％，K2HPO40.1wt％，KH2PO40.1wt％，NaCl 0.1wt％，MgSO40.05wt％，其余为水，pH7.0)中，30℃、160rpm摇床上预培养12h后，加入0.5％外消旋扁桃酸做为诱导物，继续培养12h；以该培养液为种子，按10v/v％的接种量接种至40ml转化培养基(消旋扁桃酸20.0g，玉米浆1.0g，NH4NO3，K2HPO41.0g，KH2PO41.0g，NaCl1g，MgSO40.5g，水1000ml，pH 7.0)中，30℃下160rpm摇床上发酵转化2天。反应结束后以10000×g离心10min，收集上清液，旋转蒸发除去大部分水，用50％硫酸酸化浓缩液至pH 1～2，再以食盐饱和，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发掉有机溶剂得结晶粗品，通过硅胶柱层析(苯∶乙酸乙酯∶甲酸，体积比10∶2∶1)纯化后，得纯品(R)-扁桃酸380mg，产率46.5％。
实施例3将Pseudomonas putida ECU1009(CGMCC No.1388)菌株接种至40ml营养培养基(葡萄糖1.5wt％，蛋白胨0.5wt％，酵母膏0.5wt％，K2HPO40.1wt％，KH2PO40.1wt％，NaCl0.1wt％，MgSO40.05wt％，其余为水，pH7.0)中，30℃、160rpm摇床上预培养12h，加入0.5％扁桃酸做为诱导物，继续培养12h，以该培养液为种子，按10％的接种量接种至40ml转化培养基(消旋扁桃酸10.0g，玉米浆1.0g，NH4NO3，K2HPO41.0g，KH2PO41.0g，NaCl1g，MgSO40.5g，自来水1000ml，pH 7.0)中，28℃下160rpm摇床上培养2天。反应结束后10000×g离心10min，去除菌体，保留上清液，加入1g活性碳加热脱色，过滤除去活性碳，滤液在减压条件下旋转蒸发除去大部分水，浓硫酸酸化浓缩液至pH 1～2，以食盐饱和，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发掉有机溶剂得结晶粗品，经硅胶柱层析(苯∶乙酸乙酯∶甲酸，体积比10∶2∶1)纯化后得纯品(S)-扁桃酸350mg，产率42.0％。
实施例4将Bacillus sp.ECU1008(CGMCC No.1387)菌株接种至40ml营养培养基(葡萄糖1.5wt％，蛋白胨0.5wt％，酵母膏0.5wt％，K2HPO40.1wt％，KH2PO40.1wt％，NaCl 0.1wt％，MgSO40.05wt％，其余为水，pH7.0)中，30℃、160rpm摇床上预培养12h，加入0.5％扁桃酸做为诱导物，继续培养12h，以该培养液为种子液，按10％的接种量接种至200ml转化培养基(消旋扁桃酸10.0g，玉米浆1.0g，NH4NO3，K2HPO41.0g，KH2PO41.0g，NaCl 1.0g，MgSO40.5g，自来水1000ml，pH 7.0)中，30℃下160rpm摇床上培养，在21h、34h和58h时补加2g消旋扁桃酸，并以浓氨水调pH，使其保持在6.5～7.0之间，94小时后结束转化。
整个过程中，监测菌体生长情况，用分光光度计测定发酵液在600nm下的光密度(OD值)。扁桃酸浓度的测定方法取反应样品1ml，离心取0.1ml上清，加入0.1ml 1M HCl溶液、0.2ml 10mM苯乙酸甲醇溶液与0.4ml甲醇混合均匀，然后用反相HPLC柱分析产物扁桃酸的浓度；0.4ml用0.1ml 1.0M HCl溶液酸化，乙醚萃取，蒸发干乙醚后，以三甲基氯硅烷进行甲酯化，然后用手性色谱柱(Chiracel OD)分析扁桃酸甲酯的对映体过量值(ee)。反相色谱柱用Shim-Pack VP-ODS(Shimadzu，150×4.6mm)；流动相为甲醇/KH2PO4水溶液(13/87，v/v；0.8ml/min)；225nm紫外检测。扁桃酸、苯甲酰甲酸、苯甲酸和内标的出峰时间分别为6.5、9.2、24.8和29.9min。采用手性色谱柱(Chiracel OD，Daicel Co.，Japan)分析扁桃酸甲酯对映体过量值，流动相为正己烷/异丙醇＝(90∶10，v/v，0.7ml/min)，出峰顺序依次为苯甲酰甲酸甲酯(8.5min)、(S)-扁桃酸甲酯(12.0min)、(R)-扁桃酸甲酯(20.0min)；228nm紫外检测。
发酵结束后在10000×g条件下离心10min分离除去细胞，得420ml上清调pH至5.0，加入1g活性碳加热脱色，过滤除去活性碳，滤液减压旋转蒸发大部分水，得到94ml浓缩液，加4ml浓硫酸酸化，用40ml乙酸乙酯萃取四遍，合并萃取液，减压蒸发掉溶剂，得粗结晶，以15ml甲苯重结晶两遍。干燥后得(R)-扁桃酸6.5g，产率40％，[α]D20＝-152.0°。
实施例5将Pseudomonas putida ECU1009(CGMCC No.1388)菌株接种至40ml营养培养基(葡萄糖1.5wt％，蛋白胨0.5wt％，酵母膏0.5wt％，K2HPO40.1wt％，KH2PO40.1wt％，NaCl0.1wt％，MgSO40.05wt％，其余为水，pH7.0)中，30℃、160rpm摇床上预培养12h，加入0.5％扁桃酸做为诱导物，继续培养12h；以该培养液为种子液，按10％的接种量接种至200ml转化培养基(消旋扁桃酸10.0g，玉米浆1.0g，NH4NO3，K2HPO41.0g，KH2PO41.0g，NaCl1g，MgSO40.5g，自来水1000ml，pH 7.0)中，30℃下160rpm摇床上培养，分别于21h、34h、45h和58h补加1g消旋扁桃酸，并以浓氨水调节pH，使其保持在6.5～7.0之间。94小时后结束培养。发酵过程扁桃酸浓度测定同实施例4。
发酵转化结束后在10000×g条件下离心10min，分离除去细胞，得440ml上清，调pH至5.0，加入1g活性碳加热脱色，过滤除去活性碳，滤液减压旋转蒸发大部分水，得到94ml浓缩液，加4ml浓硫酸酸化，用40ml乙酸乙酯萃取4次，合并萃取液，减压蒸发掉溶剂，得粗结晶，在15ml甲苯中重结晶两遍。干燥后得(S)-扁桃酸4.95g，产率41％，[α]D20＝+152.2°。
权利要求
1.一株恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)ECU1009，其保藏号为CGMCC No.1388。
2.如权利要求1所述的菌株在拆分扁桃酸外消旋体中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的拆分扁桃酸外消旋体的主要步骤是将CGMCC No.1388菌株按1～10v/v％接种量接种至生物转化培养基，于20～40℃状态下保持1～5天后经离心除去菌体后得水相，调节所得水相pH值小于3后，经萃取后得(S)-(+)-扁桃酸；其中所说的生物转化培养基为外消旋扁桃酸0.1～5wt％，玉米浆0.1～2wt％，NH4NO30.1～0.5wt％，K2HPO40.1～0.5wt％，KH2PO40.1～0.5wt％，NaCl0.1～0.5wt％，MgSO40.1～0.5wt％，余量为水。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，其中CGMCC No.1388菌株在用于拆分扁桃酸外消旋体前，在由葡萄糖0.1～3wt％，蛋白胨0.1～3wt％，酵母膏0.1～3wt％，外消旋扁桃酸0.1～3wt％，K2HPO40.1～0.5wt％，KH2PO40.1～0.5wt％，NaCl0.1～0.5wt％，MgSO40.1～0.5wt％，琼脂0～2wt％和余量为水组成的预培养基中进行预培养，预培养的温度20～40℃，预培养的时间为1～6天。
全文摘要
本发明公开了一株专一性降解(R)－扁桃酸的假单胞菌(Pseudomonas putida)ECU1009(CGMCC No.1388)及其用途。利用本发明提供的菌株来拆分扁桃酸外消旋体，具有操作简单安全、成本低廉、目标产物容易纯化及对环境友好等优点。
文档编号C12P41/00GK1924003SQ20061008237
公开日2007年3月7日 申请日期2005年6月23日 优先权日2005年6月23日
发明者许建和, 黄汉荣, 徐毅, 潘江 申请人:华东理工大学