专利名称：与肝癌相关的esr1基因多态性及其检测方法
技术领域：
本发明涉及肝癌的人群预防中的个体易感性及其遗传学检测方法。具体地，本发明涉及与肝癌患病风险相关的易感基因ESR1多态性的基因型检测方法。本发明进一步涉及上述易感基因ESR1多态性基因型的检测试剂盒，以及该试剂盒的应用。另外，本发明还涉及上述检测方法和易感基因在肝癌的预防和控制以及遗传咨询中的应用。
背景技术：
原发性肝细胞癌(简称肝癌；Hepatocellular Carcinoma，HCC)是严重威胁人类生命健康的常见恶性肿瘤。流行病学资料显示，在全世界每年新发生的恶性肿瘤患者中肝癌约占5％，估计有30万例左右；在全球范围的肿瘤患者死亡率中，肝癌高居第五位。肝癌的发病具有明显的地域和种族差异肝癌在美国和欧洲发病率相对较小，而在发展中国家却较为普遍，非洲、中国、南亚和日本的发病率最高，其中又以中国最为严重全世界每年新发肝癌病例中42％出现在我国大陆，我国每年死于肝癌约11万人，占全世界肝癌死亡人数的45％，已占我国肿瘤死因的第2位。大量的流行病学和实验研究表明，如其它常见肿瘤一样，肝癌也属于多基因疾病，是环境因素和机体的遗传因素交互作用，经过多个阶段的发展而产生的。已知的环境风险因素包括乙型(Hepatitis B Virus，HBV)或丙型(Hepatitis C Virus，HCV)肝炎病毒感染、黄曲霉毒素暴露、嗜酒和致癌物暴露等。其中，HBV的慢性感染已是公认的肝癌的风险因素，至少80％的肝癌病例与HBV的慢性化感染相关。然而，仅有五分之一的HBV携带者在其有生之年能发展成为肝癌，这提示其它风险因素在肝癌的发生发展过程中的重要性。确实，机体的性别、年龄和遗传易感基因等遗传风险因素也在肝癌的发生中起着极为重要的作用。
通过定位遗传学等研究手段能够鉴定与增加或降低多基因病发病风险相关的遗传变异。因此，搜寻在肝癌发病机制中起重要作用的候选基因的多态性并研究其与疾病表型的遗传关联可能是解决肝癌遗传病因和阐明种族和地区间易感性差异的机制的希望所在。近来的遗传关联研究也揭示，周期素D1(CCND1)、微粒体环氧化物水解酶(EPHX)、乙酰基转移酶(NAT)、细胞色素氧化酶(CYP)、雄激素受体和白介素1B(IL1B)基因等的多态性与肝癌的发生具有遗传学关联，提示这些基因有可能是肝癌的遗传易感基因。然而，上述基于人群的关联研究皆存在样本量太小、统计能力弱、关联结果未在其它独立人群/亚人群中得到重复、潜在的群体遗传分层和未排除连锁不平衡因素等缺陷，使得上述鉴定的候选易感基因还需将来进一步研究确证。此外，已知多基因疾病是由多个微效基因的累加作用以及和某些环境因子共同作用所致，估计参与多基因疾病发病原理的基因可达3-20个。因此，选择相对隔离人群，对疾病相关调节通路的候选基因或通过基因组定位所限定的候选基因进行多态性的关联研究，发现和鉴定新的肝癌易感基因是很有可能的。
众所周知，在雌激素反应性组织(如乳腺和子宫)中，雌激素被认为是致癌物。在肝脏的动物实验模型中显示，雌激素也可作为肿瘤促进剂诱导仓鼠和小鼠肝脏肿瘤的发生。流行病学资料显示，长期使用雌激素与肝脏肿瘤危险性的增高显著相关。上述结果提示，肝脏是一个激素反应性器官，肝癌也可能是雌激素依赖性肿瘤。雌激素通过与其受体(ESRs)结合而发挥生物学作用，启动下游基因表达，参与调节肝细胞的增殖。抗雌激素药物可以减少胞浆和胞核内ESR的水平，抑制肝脏部分切除后的细胞增殖。ESRs属核受体超家族成员，位于胞浆和胞核内，具有转录因子的作用，包括α(ESR1)和β(ESR2)两种亚型，二者与雌激素的亲和力相近且可与共同的ESR反应元件结合，但它们的组织分布不尽相同，对下游基因的调控也有一定的组织特异性。ESRs的过表达与雌激素诱导的肿瘤形成之间的关系已经在MT-mESR转基因小鼠中得到证实，这种转基因小鼠能过表达ESRs并且对人工合成雌激素的致癌作用高度敏感。与正常组织相比，在酒精性慢性肝病、良性肝脏肿瘤和肝癌中，肝细胞胞浆中表达的ESRs均显著增多。
基于以上肝癌发病机理中雌激素/雌激素受体轴的功能，我们推测ESRs可能是肝癌的生物学候选易感基因，其遗传学变异可能会影响雌激素的功能，并能进一步导致个体间、甚而种族间基因型依赖的肝癌易感性的差异。
雌激素主要通过结合ESR1而发挥作用。已经在ESR1基因的5’端发现了4个多态性位点第一个是位于外显子1上游约1kb处的(TA)n可变重复数目多态性位点(Variable-Number-of-Tandem-Repeat，VNTR)；第二个是位于外显子1中密码子10处的同义多态性位点T29C；第三和第四个位点是位于内含子1中的、在外显子2上游约400bp处的两个限制性片段长度多态性位点(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)Pvu II和Xba I。最近，本研究组鉴定了覆盖ESR1基因的两个连锁不平衡模块(Linkage Disequilibriumblocks，LD blocks)A和B，以上提到的4个多态性位点全部包含在LD模块A中，这一模块从ESR1基因的启动子区域起直至内含子3，跨度约140kb。同时，我们也确定了在LD模块B中包含有2个单倍型标签单核苷酸多态性位点(Haplotype-tagged Single NucleotidePolymorphisms，htSNPs)位于外显子4中第325密码子处的C136474G和位于内含子5处的A252966G。
已有许多研究显示ESR1基因的多态性位点与骨质疏松性骨折、心血管疾病、HBV感染的慢性化具有遗传学关联。此外，也发现这些多态性位点与多种肿瘤(包括乳腺癌、直肠癌、肾癌、子宫内膜癌与前列腺癌)的遗传易感性相关。例如，10号密码子处的T29C多态性位点是前列腺、肾癌的危险因素，内含子1处的Pvu II和Xba I多态性位点降低了患直肠癌的风险，325密码子处的C136474G位点增加了患乳腺癌的风险，等等。然而，目前尚缺乏ESR1多态性位点与肝癌遗传易感性关系的研究。
在本项研究中，我们拟通过基于中国人群的病例-对照研究调查ESR1的多态性位点与肝癌易感性的相关性。希望通过此项群体研究，获得具有开发价值的与易感性相关的多态性位点，为有肝癌倾向人群的筛选和预防提供新的标记。
发明内容
发明人系统考察了ESR1基因的多态性位点(TA)n重复多态性位点(rs3138774)、T29C(rs2077647)、Pvu II(rs2234693)、Xba I(rs9340799)、C136474G(rs1801132)和A252966G(rs9322354)与肝癌易感性的相关性。通过基于医院的病例对照研究，进行了大量的临床和实验室实验和大样本的统计分析，发现ESR1基因5’端的3个位点，即(TA)n、T29C及Pvu II位点与HCC的易感性显著相关，并判明携带ESR1的(TA)n多态性位点的H等位型、29C/C基因型以及Pvu II位点的C/C基因型或携带由(TA)n重复、T29C、Pvu II和Xba I位点组成的单倍型HCCG和LCCA的个体对肝癌有更高的易感性。因此本发明鉴定了肝癌的一种新的易感基因、易感基因型和易感单倍型。
本发明还提供了一种检测与肝癌易感性关联的易感位点(TA)n的方法，该方法为片断分析法；提供了一种检测与肝癌易感性关联的易感位点T29C的方法，为PCR-RFLP方法；提供了一种检测与肝癌易感性关联的易感位点Pvu II的方法，为PCR产物直接测序的方法。
本发明还提供了一种检测与肝癌易感性关联的易感单倍型的方法，为以PHASE程序构建单倍型的方法。
本发明还提供了通过检测ESR1基因的(TA)n、T29C及Pvu II位点或由(TA)n、T29C、PvuII和Xba I位点组成的单倍型来判定个体对肝癌是否易感的方法。
本发明还提供了分别用于检测多态性位点(TA)n、T29C及Pvu II位点的引物对。
本发明进一步提供了分别用于检测与肝癌关联的ESR1基因的(TA)n、T29C及Pvu II位点的试剂盒，以及上述试剂盒在人群中预防与控制肝癌的应用。
一、如上所述，本发明提供了三种检测与肝癌易感性关联的ESR7基因的(TA)n、T29C及Pvu II位点的方法，分别为片段分析法、PCR-RFLP和PCR产物直接测序的方法。具体方法如下
1、采用片段分析方法对(TA)n多态性位点(rs3138774)进行分型。在ESR1基因(TA)n多态性位点所在区域设计基因序列特异性引物，其中正向引物用FAM荧光标记，对样本基因组DNA进行热启动和梯度的特异性PCR扩增。PCR产物在ABI 3730型测序仪上进行测序，并使用Genescan软件(ABI，USA)进行分析。由内标确定等位型的长度，由等位型的长度大小的组合确定基因型。
2、采用PCR-RFLP方法对ESR1基因T29C位点(rs2077647)进行分型。在ESR1基因T29C(rs2077647)位点所在区域设计基因序列特异性引物，通过单碱基误配在正向引物引入一个BamH I识别位点，并对样本基因组DNA进行热启动和梯度的特异性PCR扩增；对扩增的含有T29C位点的PCR产物以限制性内切酶BamH I进行切割，并以琼脂糖凝胶电泳分析内切酶消化产物的带型，以此判明该位点的基因型。
3、采用PCR产物直接测序的方法对Pvu II(rs2234693)位点进行分型。在ESR1基因Pvu II(rs2234693)和Xba I(rs9340799)位点所在区域设计基因序列特异性引物，并对样本基因组DNA进行热启动和梯度的特异性PCR扩增；对扩增的含有Pvu II和Xba I位点的PCR产物进行纯化，用ABI PRISM Big-Dye测序试剂盒，以PCR反应两侧引物为测序引物分别进行正、反向测序反应。测序反应产物经乙醇纯化后于ABI 3730自动测序仪进行毛细管电泳和序列测定。同一片断以正反向引物测序后，得到序列的色谱图ABI文件。将文件传送到SGI工作站，用Phred-Phrap-PolyPhred-Consed软件包进行测序峰图的多重比对和对多态性位点的检读，以此判明该位点的基因型。
二、另一方面，本发明还提供了与肝癌易感性关联的易感基因型，即ESR1基因的(TA)n多态性位点的H等位型、29C/C基因型及Pvu II位点的C/C基因型或由(TA)n、T29C、Pvu II和Xba I位点组成的HCCG和LCCA单倍型为肝癌的易感单倍型。并提供了一种通过检测ESR1基因的(TA)n多态性位点、T29C位点或Pvu II位点的基因型或由(TA)n、T29C、Pvu II和Xba I位点组成的单倍型来判定人群或个体对肝癌易感性的方法。该方法包括1、分别对ESR1基因(TA)n多态性位点、T29C及Pvu II所在区域设计基因序列特异性引物，并对样本基因组DNA进行热启动和梯度的特异性PCR扩增；2、对PCR产物以限制性内切酶BamH I进行切割(T29C位点)，并以琼脂糖凝胶电泳分析内切酶消化产物的带型，或进行测序((TA)n和Pvu II位点)，以此判明ESR1基因三个位点的基因型；3、当某一个体的ESR1基因的(TA)n位点表现为H等位型或T29C位点为29C/C基因型，或者Pvu II位点表现为C/C基因型，或者由PHASE程序计算出的(TA)n、T29C、Pvu II和XbaI位点构成的单倍型表现为HCCG和LCCA单倍型时，则表明该个体患肝癌的风险更高。
三、引物对的序列为1、检测ESR1基因(TA)n多态性位点(rs3138774)基因型的特异性引物对的序列为正向引物5′-GGCTGCAGCAAAGGAAGTTTA-3′(5′端用FAM荧光标记)；反向引物5′-CGATCTTCTCGGTTCACTTGG-3′。
2、检测ESR1基因T29C位点基因型的特异性引物对的序列为正向引物5’-GACCATGACCCTCCACACCAAAGGATC-3’(标有下划线的碱基为人为引入的单碱基误配)；反向引物5’-ACCGTAGACCTGCGCGTTG-3’。
3、检测ESR1基因Pvu II(rs2234693)和Xba I(rs9340799)位点基因型的特异性引物对的序列为正向引物5′-CATGAACCACCATGCTCAGTC-3′；反向引物5′-GCAGCAAAAGGTGTTGCCTAT-3′。
四、本发明进一步提供了检测与肝癌关联的ESR1基因的(TA)n、T29C及Pvu II位点的试剂盒，其内装有一个或多个容器，容器内装有用以检测(TA)n、T29C及Pvu II位点基因型的一种或多种组分。与之同时提供的可以是经政府食品与药品监督管理部门审核的、有关药品或生物制品制造、使用及销售方面的信息。例如，在DNA的PCR扩增方法实施中，直接检测样品的(TA)n、T29C及Pvu II位点的基因型的试剂盒，含有PCR的引物对(分别是(TA)n位点5′-GGCTGCAGCAAAGGAAGTTTA-3′[5′端用FAM荧光标记]和5’-ACCGTAGACCTGCGCGTTG-3’；T29C位点5’-GACCATGACCCTCCACACCAAAGGATC-3’和5’-ACCGTAGACCTGCGCGTTG-3’[标有下划线的碱基为人为引入的单碱基误配]；Pvu II位点5′-CATGAACCACCATGCTCAGTC-3′和5′-GCAGCAAAAGGTGTTGCCTAT-3′)，dNTPs，用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液等。本领域技术人员已知，以上的组分仅是示意性的，所述用于PCR反应的DNA聚合酶可以是TaqDNA聚合酶，例如，HotStar Taq酶Klenow片段，Tth DNA聚合酶，VENT DNA聚合酶等能够用于PCR扩增的酶。但为保证特异性扩增，除了引物和反应条件的优化外，应优选HotStarTaq酶。在PCR产物的RFLP分析中，该试剂盒可含有BamH I内切酶及其缓冲液，显示T29C位点(rs2077647)基因型的酶切图谱等。
详细的使用方法说明如下1、检测(TA)n位点(1)(TA)n多态性位点(rs3138774)所在区域的PCR扩增对样品基因组DNA(其具体制备方法参见实施例)，用本发明提供的引物，按照如下反应体系和条件进行PCR扩增在10μl体系混合物中进行反应，包括10ng的基因组DNA、0.2mM dNTPs、4.5mM MgCl2、50pM的上下游引物及0.5U Taq酶。PCR条件如下首先95℃变性15分钟；之后进行38个循环的反应，95℃变性、58℃退火、72℃延伸，每步均为30秒；第一步变性及最后一步延伸的时间分别为15分钟和5分钟。特异性的PCR产物(245-271bp)以1％的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
(2)(TA)n多态性位点(rs3138774)的测序反应PCR产物在ABI 3730型测序仪上进行测序，并使用Genescan软件(ABI，USA)进行分析。由内标确定等位型的长度，由等位型的长度大小的组合确定基因型。
2、检测T29C位点(1)T29C位点(rs2077647)所在区域的的PCR扩增对样品基因组DNA(其具体制备方法参见实施例)，用本发明提供的引物(通过单碱基误配——标有下划线的碱基——在正向引物引入一个BamH I识别位点)，按照如下反应体系和条件进行PCR扩增25 1反应体系为10ng基因组DNA，2 M引物，2.5mM dNTPs，0.6U Taq DNA聚合酶以及10×Taq Buffer(含Mg2+)。95℃15min预变性后进行2个阶段的扩增，其变性和延伸条件一致，均为94℃30s和72℃50s，在第一阶段的13个循环中，退火温度从61℃开始每个循环降0.5℃，第二阶段扩增的退火温度则固定在55℃，最后的72℃延伸时间为7min。特异性的PCR产物(220bp)以1％的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
(2)T29C位点(rs2077647)的RFLP分析3 1的220bp PCR产物以4U的BamH I充分酶切，并以3％的琼脂糖凝胶进行酶切片断分析，29C/C基因型者具BamH I酶切位点(G↓GATCC)，因而显示97bp和23bp两条带，29T/T基因型者因没有酶切位点则不能被切开，只有220bp一条带，而29T/C杂合子显示上述3条带。
3、检测Pvu II(rs2234693)位点(1)Pvu II(rs2234693)位点所在区域的的PCR扩增对样品基因组DNA(其具体制备方法参见实施例)，用本发明提供的引物，按照如下反应体系和条件进行PCR扩增25 1反应体系为10ng基因组DNA，2 M引物，2.5mMdNTPs，0.6U Taq DNA聚合酶以及10×Taq Buffer(含Mg2+)。95℃15min预变性后进行2个阶段的扩增，其变性和延伸条件一致，均为94℃30s和72℃50s，在第一阶段的13个循环中，退火温度从63.5℃开始每个循环降0.5℃，第二阶段扩增的退火温度则固定在57.5℃，最后的72℃延伸时间为7min。特异性的PCR产物(580bp)以1％的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
(2)Pvu II(rs2234693)位点的测序反应采用96孔Millipore MultiScreen纯化板对PCR产物进行纯化。取纯化的PCR产物2μl为模板，用ABI PRISM Big-Dye测序试剂盒，以PCR反应两侧引物为测序引物分别进行正反向测序反应。测序反应产物经乙醇纯化后于ABI 3730自动测序仪进行毛细管电泳和序列测定。同一片断以正反向引物测序后，得到序列的色谱图ABI文件。将文件传送到SGI工作站，用Phred-Phrap-PolyPhred-Consed软件包进行测序峰图的多重比对和对多态性位点的检读。
五、本发明还提供了与肝癌易感性关联的ESR1基因(TA)n、T29C及Pvu II位点以及(TA)n、T29C、Pvu II和Xba I位点组成的单倍型的检测方法及其在肝癌人群预防和控制中的应用。例如，由于本发明证实了ESR1基因的(TA)n多态性位点的H等位型、29C/C基因型及Pvu II位点的C/C基因型或以上四位点组成的HCCG和LCCA单倍型与肝癌易感性存在关联，因此，在肝癌人群的预防和控制中，就需要对所咨询的对象进行ESR1基因(TA)n、T29C、Pvu II位点的基因型进行分析，以判断该对象是否携带有肝癌易感基因型(即(TA)n多态性位点的H等位型、29C/C等位基因型及Pvu II位点的C/C基因型)或单倍型(即HCCG和LCCA单倍型)(表现为对肝癌具有更高的易感性)。对具有(TA)n多态性位点的H等位型、29C/C等位基因型及Pvu II位点的C/C基因型或HCCG和LCCA单倍型的个体，则可对之进行科学的干预、例如建议及早进行治疗性预防等，这样可以针对性地降低这些易感人群罹患肝癌的风险。
具体实施例方式实施例1该实施例设计并合成了三套引物对，并且在该引物对的基础上，设计了三种检测与肝癌易感性关联的ESR1基因的(TA)n、T29C及Pvu II位点的基因型及由(TA)n、T29C、Pvu II和Xba I位点组成的单倍型的方法。
1、基因组DNA的提取采取本领域常规的Miller改良盐析法提取外周血白细胞基因组DNA。
1)取柠檬酸钠或EDTA-Na2抗凝全血5ml(尽量不用肝素抗凝)，置于50ml有盖离心管；2)加入3-5倍体积冷蒸馏水，反复颠倒混匀，冰中放置5分钟，4℃2000rpm离心20分钟；3)缓慢倾倒上清，沉淀加入预冷的0.1％Triton-X100(体积同上)，轻柔混匀沉淀，如上离心，弃上清；4)沉淀加入4ml裂解液(50Mm Tris-Cl-10mM EDTA，pH8.0)，彻底打碎沉淀，然后加入10％SDS至终浓度为0.5％，混匀；5)加入蛋白酶K(10mg/ml)至终浓度为200μg/ml，混匀，55℃3小时或37℃过夜消化(以过夜消化为佳)；6)加入6M NaCl 1.2ml，剧烈振荡20秒，2，200rpm离心10分钟，将上清转移至另一个有盖离心管；7)加入2倍体积预冷无水乙醇，反复颠倒混匀至出现絮状DNA沉淀，挑出DNA至另一Eppendorf管；8)以75％预冷乙醇洗涤DNA沉淀2次；9)以0.5ml TE(10mM Tris-Cl-EDTA，pH8.0)或蒸馏水溶解DNA沉淀，电泳检测DNA片段大小，或测260/280nm OD比值。
2、PCR扩增用本发明提供的分别扩增(TA)n、T29C及Pvu II位点所在区域的引物对进行PCR扩增(1)(TA)n多态性位点(rs3138774)在10μl体系混合物中进行反应，包括10ng的基因组DNA、0.2mM dNTPs、4.5mM MgCl2、50pM的上下游引物及0.5U Taq酶。PCR条件如下首先95℃变性15分钟；之后进行38个循环的反应，95℃变性、58℃退火、72℃延伸，每步均为30秒；第一步变性及最后一步延伸的时间分别为15分钟和5分钟。(2)T29C位点(rs2077647)25 1反应体系为10ng基因组DNA，2 M引物，2.5mM dNTPs，0.6U Taq DNA聚合酶以及10×Taq Buffer(含Mg2+)。95℃15min预变性后进行2个阶段的扩增，其变性和延伸条件一致，均为94℃30s和72℃50s，在第一阶段的13个循环中，退火温度从61℃开始每个循环降0.5℃，第二阶段扩增的退火温度则固定在55℃，最后的72℃延伸时间为7min。(3)Pvu II(rs2234693)位点25 1反应体系为10ng基因组DNA，2 M引物，2.5mM dNTPs，0.6U Taq DNA聚合酶以及10×Taq Buffer(含Mg2+)。95℃15min预变性后进行2个阶段的扩增，其变性和延伸条件一致，均为94℃30s和72℃50s，在第一阶段的13个循环中，退火温度从63.5℃开始每个循环降0.5℃，第二阶段扩增的退火温度则固定在57.5℃，最后的72℃延伸时间为7min。特异性的245-271bp、220bp和580bp的PCR产物以1％的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
3、RFLP分析(针对T29C位点)3 1的220bp PCR产物以4U的BamH I充分酶切，并以3％的琼脂糖凝胶进行酶切片断分析，29C/C基因型者具BamH I酶切位点(G↓GATCC)显示197bp和23bp两条带，29T/T基因型者因没有酶切位点则不能被切开，只有220bp一条带，而29T/C杂合子显示上述3条带。
4、测序反应(分别针对(TA)n位点和Pvu II位点)(TA)n重复多态性位点(rs3138774)的测序反应PCR产物在ABI 3730型测序仪上进行测序，并使用Genescan软件(ABI，USA)进行分析。由内标确定等位型的长度，由等位型的长度大小组合确定基因型。
Pvu II(rs2234693)位点的测序反应采用96孔Millipore MultiScreen纯化板对PCR产物进行纯化。取纯化的PCR产物2μl为模板，用ABI PRISM Big-Dye测序试剂盒，以PCR反应两侧引物为测序引物分别进行正反向测序反应。测序反应产物经乙醇纯化后于ABI 3730自动测序仪进行毛细管电泳和序列测定。同一片断以正反向引物测序后，得到序列的色谱图ABI文件。将文件传送到SGI工作站，用Phred-Phrap-PolyPhred-Consed软件包进行测序峰图的多重比对和对多态性位点的检读。
5、单倍型构建将经过PCR-RFLP方法和测序方法得到的(TA)n、T29C、Pvu II和Xba I位点基因型数据输入PHASE程序，可以计算得到各个体的单倍型组合。
实施例2该实施例用实施例1建立起来的方法，对248个肝癌病人和239个匹配的无肝癌的HBV携带者对照人群的ESR1基因的(TA)n、T29C和Pvu II位点基因型及由(TA)n、T29C、Pvu II和Xba I位点组成的单倍型进行了分析。
1、试验对象研究群体由487名个体组成。肝癌患者248例，其中男218例、女30例，年龄21-77岁(平均46.9岁)，全部为广西籍，来源于广西壮族自治区肿瘤医院(中国，南宁)，经临床及病理切片确诊为HCC，且未经治疗；健康对照239例，其中男199例、女40例，年龄18-80岁(平均47.2岁)，全部为广西籍，来源于与HCC病例在相同地区、相同时间段内进行癌症早期筛查时随机筛选出来的，无肝癌家族史，与病例组个体无血缘关系。所有受试者均签署了知情同意书，本研究计划得到国家人类基因组北方研究中心医学伦理委员会的批准。
2、ESR1基因的(TA)n、T29C和Pvu II位点的基因型及由(TA)n、T29C、Pvu II和Xba I位点组成的单倍型的确定248例肝癌患者和239例对照个体中ESR1基因(TA)n、T29C、Pvu II位点的基因型的频率分布如表1所示。对于(TA)n多态性位点，H等位型与增加HCC的发生风险相关与携带L/L基因型的个体相比，携带一个H等位型的个体(OR＝1.63，95％CI＝1.10-2.42，P＝0.016)和携带两个H等位型的个体(OR＝2.66，95％CI＝1.44-4.94，P＝0.0018)发生HCC的易感性均显著增加。对于T29C位点，与T/T基因型相比，杂合子T/C基因型(OR＝1.63，95％CI＝1.10-2.42，P＝0.017)和纯合子C/C基因型(OR＝2.31，95％CI＝1.25-4.26，P＝0.0076)可显著增加HCC的发生风险。同样，对于Pvu II位点，携带纯合子C/C基因型的个体患HCC的风险比T/T基因型高出2倍之多(OR＝2.19，95％CI＝1.27-3.78，P＝0.0048)。这些关联在进行针对多重检验的校正后仍然存在。
由(TA)n、T29C、Pvu II和Xba I位点组成的单倍型在248例鼻咽癌患者和239例健康对照个体中的分布频率如表2所示。与单倍型LTTA相比，单倍型HCCG和LCCA与增加HCC的发生风险关联，OR值分别为1.70(95％CI＝1.19-2.44，P＝0.0034)和2.34(95％CI＝1.23-4.43，P＝0.0079)。经多重比较校正后上述关联依然存在。
因此，用本发明的方法解析了ESR1的(TA)n、T29C和Pvu II位点基因型及由(TA)n、T29C、Pvu II和Xba I位点组成的单倍型与肝癌的易感性之间的相关性。
表1 ESR1基因4个多态性位点在病例-对照组中的等位型和基因型频率分布
括号中显示了以百分比表示的基因型频率。分型样本数目的不同是由于某些个体的分型失败。
*所有ORs值和P值均经年龄、性别、吸烟与饮酒等参数的校正。
L＝“低重复数目型”(n＜18)；H＝“高重复数目型”(n≥18)。
表2在HCC患者和对照组个体中单倍型的频率分布
括号中显示的是以百分比表示的单倍型频率。基于(TA)n、T29C、Pvu II和Xba I这4个多态性位点构建了单倍型。由于某些个体的分型失败，病例和对照组的单倍型总数并不分别是496和478。
*所有ORs值和P值均经年龄、性别、吸烟及饮酒等参数校正。
未进行多重校正。
病例-对照组中等位频率小于5％单倍型。
应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，但所作改动或修改的等价形式同样落在本申请权利书所限定的范围之内。
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序列表<110>中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所<120>与肝癌相关的ESR1基因多态性及其检测方法<160>6<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>1GGCTGCAGCA AAGGA AGTTT A21<210>2<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>2ACCGTAGACC TGCGCGTTG19<210>3<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>3GACCATGACC CTCCACACCA AAGGATC 27<210>4<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>4ACCGTAGACC TGCGCGTTG19<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>5CATGAACCAC CATGCTCAGT C 21<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>6GCAGCAAAAG GTGTTGCCTA T 2权利要求
1.通过检测ESR1基因的(TA)n多态性位点(rs3138774)、T29C(rs2077647)位点和Pvu II(rs2234693)位点以及由(TA)n、T29C、Pvu II和XbaI位点组成的单倍型来判定个体对肝癌是否易感的方法。其特征在于当某一个体的ESR1基因的(TA)n多态性位点(rs3138774)表现为H等位型、T29C(rs2077647)位点表现为基因型C/C、Pvu II(rs2234693)位点表现为C/C基因型，或由(TA)n、T29C、Pvu II和Xba I位点组成的单倍型表现为HCCG或LCCA时，则表明该个体对肝癌具有更高的易感性。
2.三种检测ESR1基因的(TA)n多态性位点(rs3138774)、T29C(rs2077647)位点和Pvu II(rs2234693)位点的基因型的方法。分别为片段分析法、PCR-RFLP方法和PCR产物直接测序的方法，其各自的主要特征在于以下关键方面(1)对于(TA)n多态性位点1)对包含(TA)n多态性位点(rs3138774)的ESR1基因序列，设计特异性的引物，其序列为正向引物5′-GGCTGCAGCAAAGGAAGTTTA-3′(用FAM荧光标记)；反向引物5′-CGATCTTCTCGGTTCACTTGG-3′。2)对包含(TA)n多态性位点的ESR1基因区域，以所设计的引物，通过热启动和梯度的聚合酶链式反应，以基因特异性引物进行DNA扩增。3)PCR产物在ABI 3730型测序仪上进行测序，并使用Genescan软件(ABI，USA)进行分析。由内标确定等位型的长度，由等位型的长度大小的组合确定基因型。(2)对于T29C多态性位点1)对包含T29C(rs2077647)多态性位点的ESR1基因序列，设计特异性的引物，其序列为正向引物5’-GACCATGACCCTCCACACCAAAGGATC-3’(标有下划线的碱基为人为引入的单碱基误配)；反向引物5’-ACCGTAGACCTGCGCGTTG-3’。2)对包含T29C(rs2077647)多态性位点的ESR1基因区域，以所设计的引物，通过热启动和梯度的聚合酶链式反应，以基因特异性引物进行DNA扩增。3)3 1的220bp PCR产物以4U的BamHI充分酶切，并以3％的琼脂糖凝胶进行酶切片断分析，29C/C基因型者具BamHI酶切位点(G↓GATCC)显示197bp和23bp两条带，29T/T基因型者因没有酶切位点则不能被切开，只有220bp一条带，而29T/C杂合子显示上述3条带。(3)对于Pvu II多态性位点1)对包含Pvu II(rs2234693)和XbaI(rs9340799)多态性位点的ESR1基因序列，设计特异性的引物，其序列为正向引物5′-CATGAACCACCATGCTCAGTC-3′；反向引物5′-GCAGCAAAAGGTGTTGCCTAT-3′。2)对包含Pvu II(rs2234693)和XbaI(rs9340799)多态性位点的ESR1基因区域，以所设计的引物，通过热启动和梯度的聚合酶链式反应，以基因特异性引物进行DNA扩增。3)采用96孔Millipore MultiScreen纯化板对PCR产物进行纯化。取纯化的PCR产物2μl为模板，用ABI PRISM Big-Dye测序试剂盒，以PCR反应两侧引物为测序引物分别进行正反向测序反应。测序反应产物经乙醇纯化后于ABI 3730自动测序仪进行毛细管电泳和序列测定。同一片断以正反向引物测序后，得到序列的色谱图ABI文件。将文件传送到SGI工作站，用Phred-Phrap-PolyPhred-Consed软件包进行测序峰图的多重比对和对多态性位点的检读。
3.一种与肝癌易感性关联的ESR1基因(TA)n多态性位点(rs3138774)、T29C(rs2077647)位点和Pvu II(rs2234693)位点的检测试剂盒，包括扩增用基因特异性引物、dNTPs、用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液的一种或多种、用于RFLP的限制性内切酶BamH I和相应缓冲液的一种或多种及其酶切图谱等。
4.一种检测ESR1基因的由(TA)n、T29C、Pvu II和XbaI位点组成的单倍型的方法。该方法关键特征是利用2、3项或其它方法得到个体的(TA)n、T29C、Pvu II和Xba I位点的基因型数据，以PHASE程序计算出个体的单倍型。
5.如权利要求1-4任一项所述的方法或其试剂盒在肝癌的人群预防和控制以及遗传咨询中的应用。
全文摘要
本发明涉及与肝癌患病风险相关的易感基因ESR1的(TA)
文档编号C12Q1/68GK101078027SQ200610082338
公开日2007年11月28日 申请日期2006年5月24日 优先权日2006年5月24日
发明者贺福初, 周钢桥, 翟芸, 张秀梅 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所