抗HBsAg单克隆抗体的制作方法

专利名称：抗HBsAg单克隆抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及特异结合HBsAg的单克隆抗体。具体讲，涉及可与野生型HBsAg以及突变型HBsAg结合的单克隆抗体。
背景技术：
乙型肝炎病毒(HBV)是具有脂质双层膜的外鞘、作为蛋白质的核壳、DNA聚合酶和基因组DNA的嗜肝DNA病毒科的双链DNA病毒。外鞘中结合有S蛋白质、M蛋白质以及L蛋白质，位于S蛋白质的表面抗原(HBsAg)与病毒的感染有关。HBsAg是由226个氨基酸组成的多肽，HBsAg中存在adw、ayw、adr以及ayr4种类型的亚型。adw，HBsAg的122位以及160位的氨基酸都是赖氨酸。ayw，HBsAg的122位氨基酸是精氨酸、160位的氨基酸是赖氨酸。adr，122位的氨基酸为赖氨酸、160位的氨基酸是精氨酸。ayr，122位以及160位的氨基酸都是精氨酸。
如果感染HBV，HBV就会将大量不含有基因组DNA的球形或管形的颗粒(伪颗粒pseudo particle)释放到血中。在该颗粒中含有HBsAg。因此，通过使用抗HBs抗体检查通过采血得到的血液检体中是否存在HBsAg，就可以检查有没有感染HBV。
由于HBV等病毒进化速度迅速，所以基因组发生突变的概率高。由于这样的HBV基因组的突变往往导致HBsAg的氨基酸序列的突变，结构变化。如果HBsAg的结构变化，以往用于HBV诊断的抗HB s抗体就不能与HBsAg结合，有时会将HBV感染者诊断为HBV阴性(假阴性)。如果不能检测含有突变的HBsAg(突变型HBsAg)，不仅影响HBV的宿主，而且可能通过血液制剂或脏器的提供等导致感染的传播。因此，在HBV的检查中，重要的是要使用既可以与野生型的HBsAg结合，又可与突变型HBsAg结合的抗HBs抗体。
根据这样的观点，到目前为止，已经开发出了可与野生型HBsAg以及突变型HBsAg结合的各种各样的单克隆抗体。例如、US2004/0219154A1所述的单克隆抗体可以与野生型HBsAg以及6种突变型HBsAg结合。
然而，除了US2004/0219154A1所述单克隆抗体可识别的突变型HBsAg以外，还报告了各种各样的突变型HBsAg。希望开发不仅可与野生型HBsAg结合的、而且也能够与到目前为止不能检测的突变型HBsAg结合的单克隆抗体。

发明内容
本发明的目的是提供不仅可与野生型HBsAg结合的，而且也能够与到目前为止不能检测的突变型HBsAg结合的单克隆抗体。
为了达到上述目的，本发明提供可与下面1)、2)和3)所述的HBsAg结合的单克隆抗体。
1)野生型HBsAg、2)从相对于野生型HBsAg，120位的氨基酸有突变的突变型HBsAg以及相对于野生型HBsAg，141位的氨基酸有突变的突变型HBsAg中选择的至少一个突变型HBsAg、3)从相对于野生型HBsAg，118位的氨基酸置换突变为赖氨酸的突变型HBsAg以及相对于野生型HBsAg，只在144位氨基酸突变，该突变是置换突变为谷氨酸的突变型HBsAg中选择的至少一个突变型HBsAg。
另外，本发明提供被保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心的国际保藏编号FERM BP-10582的杂交瘤。
另外，本发明提供被保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心的国际保藏编号FERM BP-10583的杂交瘤。
具体实施例方式
本说明书中的「单克隆抗体」包括单克隆抗体的片段及其衍生物。作为单克隆抗体的片段及其衍生物，具体的如Fab、Fab’、F(ab)2以及sFv片段等(Blazar et al.，1997，Journal of Immunology，1595821-5833以及Bird et al.，1988，Science，242423-426)。单克隆抗体的亚类不限定于IgG，IgM等也可以。
本说明书中的「野生型HBsAg」由226个氨基酸构成，一般含有作为野生型被识别的所有的HBsAg。因此，该用语中包括所有血清型HBsAg以及所有被识别的野生型的HBsAg。
在本说明书中，将野生型HBsAg的N位氨基酸置换为X以「NX」表示。例如、野生型HBsAg的111位氨基酸突变为苏氨酸(T)以「111T」表示。另外将N位的氨基酸X置换为氨基酸Y表示为「XNY」。例如、野生型HBsAg的118位氨基酸苏氨酸(T)突变为赖氨酸(K)表示为「T118K」。
本说明书中，为了表示氨基酸种类，有时使用一般常用的氨基酸单字母缩写。
本实施方式的单克隆抗体可与野生型HBsAg和以往不能检测的突变型HBsAg结合。具体来说，可与下面(i)～(iii)的HBsAg结合。
(i)野生型HBsAg(ii)第1突变型HBsAg和/或第2突变型HBsAg(iii)第3突变型HBsAg和/或第4突变型HBsAg第1突变型HbsAg是相对于野生型HBsAg，120位有突变的突变型HBsAg。
第2突变型HbsAg是相对于野生型HBsAg，141位有突变的突变型HBsAg。
第3突变型HbsAg是具有118K的突变型HBsAg。
第4突变型HbsAg是仅在144位有突变，该突变是144E的突变型HBsAg。
该单克隆抗体优选能够识别野生型HBsAg、第1突变型HBsAg，第2突变型HBsAg，第3突变型HbsAg以及第4突变型HbsAg所有突变型。
第1突变型HbsAg的120位突变优选120Q或120T。
第2突变型HbsAg的141位突变优选141E。
另外，该单克隆抗体优选可与从下面的突变型组中选择的至少一种HBsAg结合，更优选能与这些所有的突变型HBsAg结合相对于野生型HBsAg，111位有突变的突变型HBsAg、相对于野生型HBsAg，126位有突变的突变型HBsAg、相对于野生型HBsAg，129位有突变的突变型HBsAg、相对于野生型HBsAg，133位有突变的突变型HBsAg、相对于野生型HBsAg，134位有突变的突变型HBsAg、相对于野生型HBsAg，135位有突变的突变型HBsAg、相对于野生型HBsAg，142位有突变的突变型HBsAg、相对于野生型HBsAg，143位有突变的突变型HBsAg、相对于野生型HBsAg，148位有突变的突变型HBsAg、相对于野生型HBsAg，154位有突变的突变型HBsAg以及相对于野生型HBsAg，155位有突变的突变型HBsAg。
另外，该单克隆抗体优选可与从下面的突变型组中选择的至少一种HBsAg结合，更优选能与所有的突变型HBsAg结合相对于野生型HBsAg，111位有突变的突变型HBsAg、相对于野生型HBsAg，126位有突变的突变型HBsAg、相对于野生型HBsAg，129位有突变的突变型HBsAg、
相对于野生型HBsAg，133位有突变的突变型HBsAg、相对于野生型HBsAg，134位有突变的突变型HBsAg、相对于野生型HBsAg，135位有突变的突变型HBsAg、相对于野生型HBsAg，142位有突变的突变型HBsAg、相对于野生型HBsAg，143位有突变的突变型HBsAg、相对于野生型HBsAg，145位有突变的突变型HBsAg、相对于野生型HBsAg，148位有突变的突变型HBsAg、相对于野生型HBsAg，154位有突变的突变型HBsAg以及相对于野生型HBsAg，155位有突变的突变型HBsAg。
上述突变优选是置换、缺失以及插入中的一种，更优选置换。
作为上述的各突变型HBsAg含有的突变，具体来说，优选是相对于野生型HBsAg，111位有突变的突变型HBsAg的突变是111T，相对于野生型HBsAg，126位有突变的突变型HBsAg的突变是126S，相对于野生型HBsAg，129位有突变的突变型HBsAg的突变是129H，相对于野生型HBsAg，133位有突变的突变型HBsAg的突变是133L，相对于野生型HBsAg，134位有突变的突变型HBsAg的突变是134A，相对于野生型HBsAg，135位有突变的突变型HBsAg的突变是135S，相对于野生型HBsAg，142位有突变的突变型HBsAg的突变是142S或142L，相对于野生型HBsAg，143位有突变的突变型HBsAg的突变是143L，相对于野生型HBsAg，145位有突变的突变型HBsAg的突变是145R或145K，相对于野生型HBsAg，148位有突变的突变型HBsAg的突变是148H，相对于野生型HBsAg，154位有突变的突变型HBsAg的突变是154W，相对于野生型HBsAg，155位有突变的突变型HBsAg的突变是155Y。
带有这样的突变的突变型HBsAg实际上是由HBV感染者的血清鉴定、经文献等报道的。因此，通过将能够与这些突变体结合的单克隆抗体用于HBV的诊断，与使用以往的抗HBs抗体的诊断相比，不容易发生上述那样的假阴性。
另外，这些单克隆抗体可以与使HBsAg的197位以下的氨基酸缺失的HBsAg(含有野生型HBsAg的1～196位的氨基酸序列的突变型HBsAg)结合。即，这些单克隆抗体的抗原表位存在于HBsAg的1～196位区域中。
本实施方式的单克隆抗体可在怀疑含有野生型和/或突变型HBsAg的检体中的HBsAg的检出和/或定量的免疫测定中使用。这样的免疫测定可在临床的HBV诊断和血液制剂的筛选等中使用。
单克隆抗体可以通过使用众所周知的免疫学方法，用HBsAg作为抗原，免疫被免疫动物，使用被免疫动物的细胞制作杂交瘤获得。作为本实施方式的单克隆抗体的一个例子「1053抗体」由杂交瘤「HBs-1053」产生。另外，作为本实施方式的单克隆抗体的一个例子「149抗体」是由杂交瘤「HBs-149」产生的。杂交瘤HBs-1053以保藏编号FERM BP-10582、杂交瘤HBs-149以保藏编号FERM BP-10583国际保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(原保藏日2005年4月7日、国际保藏日2006年3月27日)。
杂交瘤制备时使用的被免疫动物的种类没有特别限定。具体来说如小鼠、大鼠、仓鼠、兔、山羊、马等，优选使用小鼠。而当使用小鼠时，其系统没有特别限定，优选使用BALB/c小鼠。
作为抗原的HBsAg可以从HBV感染者的活体样品纯化得到。另外，HBsAg也可以通过将编码HBsAg的DNA整合到质粒中，将该质粒导入宿主细胞，使其表达而获得。
将抗原免疫被免疫动物时，优选给予佐剂。通过使用佐剂，可以提高被免疫动物对抗原的免疫应答性。佐剂的种类没有特别限定，例如可使用弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FIA)、Ribi(MPL)、Ribi(TDM)、Ribi(MPL+TDM)、百日咳疫苗(Bordetella pertussisvaccine)、胞壁酰二肽(MDP)、铝佐剂(ALUM)等。另外，也可将这些佐剂中的多个佐剂组合使用。优选初次免疫时使用FCA，在第二次以后的免疫时使用FIA或Ribi。
可以根据有无给予佐剂或注射部位、被免疫动物的种类等的不同适当变更免疫的日程。以下就作为被免疫动物使用小鼠时的免疫进行说明。
作为初次免疫，将佐剂混合HBsAg溶液注射到腹腔内、皮下或肌肉内。注射的佐剂混合HBsAg溶液体积优选0.05ml～1ml，含有的HBsAg的质量优选10～200μg。不使用佐剂的情况，通过增多HBsAg的含有量，进行腹腔内注射，也可以免疫。从初次免疫起每隔约4～21日进行1～4次追加免疫。从追加免疫起约1～4周后进行最终免疫。从最终免疫起约3～5日后、从小鼠中分离脾细胞，可以获得抗体产生细胞。
象上述那样制作的抗体产生细胞可以与骨髓瘤细胞融合。骨髓瘤细胞的来源没有特别限定，可以使用来源于小鼠、大鼠、人等的骨髓瘤，优选使用与被免疫动物同种的动物，更优选使用同种、且同品系的动物。使用小鼠作为骨髓瘤细胞的来源时，例如最好使用小鼠骨髓瘤P3X63-Ag8、P3X63-Ag8-U1、P3NS1-Ag4、SP2/o-Ag14、P3X63-Ag8·653等已建立细胞系的骨髓瘤细胞。骨髓瘤细胞有时产生免疫球蛋白轻链，如果将这样的骨髓瘤细胞作为融合对象使用时，有时抗体产生细胞产生的免疫球蛋白重链与该轻链结合。因此，优选使用不产生免疫球蛋白轻链的骨髓瘤细胞、例如P3X63-Ag8·653或SP2/o-Ag14等。
作为使抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合来制备杂交瘤的方法，可以使用众所周知的方法，没有特别限定。例如、使用聚乙二醇(PEG)的方法(PEG法)、使用仙台病毒的方法、使用电融合装置的方法等。使用PEG法时，可以将脾细胞与骨髓瘤细胞按照1∶1至10∶1、优选5∶1至10∶1的混合比，悬浮于含有约30～60％的PEG(平均分子量1000～6000)的适当培养基或缓冲液中，在温度约25～37℃、pH6～8的条件下，使之反应约30秒～3分钟左右即可。反应结束后，洗涤细胞，除去PEG溶液，再悬浮于次黄嘌呤-胸苷培养基(HT培养基)等中，可以接种到例如微滴板中，继续培养。
融合后的细胞用选择培养基培养，进行杂交瘤的选择。作为选择培养基，只要是亲本细胞株死亡，只有融合细胞能够增殖的培养基，并没有特别限定。通常使用次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷培养基(HAT培养基)。杂交瘤的选择通常在融合操作的1～7日后，通过将培养基的一部分、优选约一半量与选择培养基交换而开始，然后再每隔2、3日，重复进行同样的培养基交换，进行培养。
生长的杂交瘤是否产生期待的抗体可以通过获取培养上清分析抗体效价确认。作为抗体效价分析可以使用众所周知的方法，没有特别限定。例如、向固定化的抗原添加梯度稀释的上述上清，使其反应，再使用荧光物质、酶、或放射性同位素(RI)等标记的二次抗体(抗球蛋白抗体、抗IgG抗体、抗IgM抗体等)反应，可以检测上清中产生的抗体、或者可以测定抗体效价。由此对板中各孔的培养上清进行筛选，可以得到产生期待的抗体的杂交瘤。
然后分离单一克隆。作为分离法，可以使用众所周知的方法，没有特别限定。例如、使用极限稀释法、软琼脂法、荧光激发细胞分选仪方法等。例如使用极限稀释法时，可以使用培养基进行梯度稀释使杂交瘤的集落达到1个细胞/孔左右之后进行培养，分离出产生目的单克隆抗体的杂交瘤克隆。得到的杂交瘤克隆在约10w/v％的二甲基亚砜(DMSO)、甘油等冷冻保护剂共存下冷冻，保存在-196～-70℃下，可以做到半永久性保存。细胞使用时，可以在37℃左右的恒温槽中迅速融解之后使用。优选进行充分洗涤一直洗涤到冷冻保护剂的细胞毒性没有残留后使用。
为了研究杂交瘤产生的抗体的免疫球蛋白亚类，将杂交瘤在一般的条件下培养，对分泌在培养上清中的抗体用市售的抗体类·亚类鉴定用试剂盒等进行鉴定。
由杂交瘤获得单克隆抗体的方法可以根据需要量和杂交瘤的性状等适当选择使用。例如、从移植了杂交瘤的小鼠的腹水获得的方法，通过细胞培养从培养上清获得的方法等。只要是可在小鼠腹腔内增殖的杂交瘤，可以从腹水获得数mg/ml的高浓度的单克隆抗体。在体内不能增殖的杂交瘤从细胞培养的培养上清获得。通过细胞培养获得克隆抗体的方法与在体内进行的方法相比，虽然抗体产生量少，但其优点是可以获得小鼠腹腔内含有的免疫球蛋白以及其它杂质混入少的生成。
从移植了杂交瘤的小鼠腹水取得单克隆抗体时，例如，将杂交瘤移植到预先给以了降植烷(2，6，10，14-四甲基十五碳烷)等具有免疫抑制作用的物质的BALB/c小鼠腹腔内，在贮留约1～3周后，收集贮留的腹水。对于使用异种动物的细胞融合的杂交瘤(例如小鼠与大鼠)情况，最好使用裸鼠、放射线处理的小鼠等。
从细胞培养上清取得抗体时，可以使用例如用于细胞维持的静置培养法、高密度培养方法、旋转烧瓶培养方法等培养法。通过使用其中的任一个方法，都可以对杂交瘤进行培养，得到含有抗体的培养上清。
从腹水或培养上清纯化单克隆抗体可以通过使用众所周知的免疫球蛋白纯化法进行。作为免疫球蛋白纯化法没有特别限定，例如、使用硫酸铵或硫酸钠的盐析的分级法、PEG分级法、乙醇分级法、DEAE离子交换层析法、凝胶过滤法等。
当单克隆抗体是小鼠IgG时，可以通过使用蛋白A结合担体或抗小鼠免疫球蛋白结合抗体的亲和层析法进行纯化。
上述单克隆抗体可在为了对作为检体的活体样品中含有的HBsAg进行检出和/或定量的免疫分析中使用。这样的分析可在HBV的诊断或血液制剂的筛选等中使用。免疫分析可以通过将本实施方式的单克隆抗体与检体混合，确认是否存在单克隆抗体与HBsAg的复合物进行。
实验例1(1)单克隆抗体的制备1-1.小鼠的免疫向含有50μg从人血清纯化的灭活的adr型HBsAg(TRINA公司制造)的PBS100μl中添加FCA100μl，用ボルテクス涡旋器混合乳化，制作FCA混合HBsAg溶液200μl。另外，除了不使用FCA，而使用FIA以外，其它同样操作，制作FIA混合HBsAg溶液200μl。
通过将FCA混合HBsAg溶液200μl注射到8周龄雌BALB/c小鼠腹腔内，进行初次免疫。初次免疫后、每隔二周，使用FIA混合HBsAg溶液200μl进行五次追加免疫。从最后追加免疫四日后，分离脾细胞，使用PEG法使该细胞与P3X63-Ag8·653小鼠骨髓瘤细胞融合，制备杂交瘤。
1-2.杂交瘤的培养将杂交瘤悬浮于HT培养基，使最终浓度为2.5×106个细胞/ml以2.5×105个细胞/孔分别加到96孔板(コ一ニング公司制造；以下、记为培养用板)的各孔。将培养用板静置在37℃、5％CO2的恒温槽内，开始杂交瘤的培养。翌日、将HAT培养基添加到培养用板的各孔中，每孔25μl，再继续培养。培养10日后，在杂交瘤集落出现时，进行产生单克隆抗体的杂交瘤的筛选。
1-3.杂交瘤的筛选向含有0.1w/v％NaN3的0.1M PBS(pH 7.5)中添加adr型HBsAg，使最终adr型HBsAg(TRINA公司制造)浓度为0.5μg/ml，制备固定用HBsAg溶液。将固定用HBsAg溶液100μl分别加到96孔板(NUNC公司制造；以下、记为抗原固定板)的各孔中。于4℃下静置过夜后，用含有浓度为0.05％的Tween20的TBS缓冲液(以下、记为第一缓冲液)洗涤三次。洗涤后、向抗原固定板的各孔添加含有浓度为2w/v％的BSA的TBS缓冲液(以下、记为第二缓冲液)300μl，于室温下静置二小时。
将第二缓冲液添加到抗原固定板的各孔中，每孔75μl。再从培养用板的各孔取出在1-2.制作的杂交瘤培养上清，按照每孔25μl添加到抗原固定板的各孔中。第二缓冲液和培养上清添加后，于37℃下温育一小时。温育后，用300μl的第一缓冲液洗涤抗原固定板的各孔。洗后，按照每孔100μl将用第二缓冲液稀释了10000倍的辣根过氧化物酶标记抗小鼠Ig多克隆抗体(DAKO公司制造；Code No.P0447)加到抗原固定板的各孔。于室温下反应30分钟，用300μl的第一缓冲液洗涤抗原固定板的各孔，然后使用TMB过氧化物酶EIA底物试剂盒(Bio-Rad公司制造)，检测显示出阳性的孔。结果确认在2688个孔中，在约300孔中产生抗HBs单克隆抗体。
(2)突变型HBsAg的制备从感染了具有野生型HBsAg(亚型adr型)的HBV的患者血液样品制备HBV的DNA，使用PCR法对含有编码野生型HBsAg区域的DNA片段进行扩增。该DNA片段编码的野生型HBsAg的氨基酸序列如序列表中序列1所示。将该DNA片段整合到真核细胞用表达载体pcDNA3.1(+)(Invitrogen)中，制备野生型HBsAg表达质粒。然后以该表达质粒作为模板，使用QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(定点突变试剂盒)(Stratagene)，导入位点特异性突变，构建下面表1所示的20种突变型HBsAg表达质粒。使用EndoFree Plasmid Maxi Kit(QIAGEN)纯化野生型HBsAg表达质粒以及突变型HBsAg表达质粒。将纯化后的表达质粒分别使用PolyMagII(OZ Bioscience)导入到来自猴肾脏的COS7细胞中，于5％CO2培养箱中，培养24小时。另外，作为阴性对照，制作不整合编码HBsAg的DNA，而只导入pcDNA3.1(+)的COS 7细胞，进行同样的培养。
表1

(3)与HBsAg反应的抗体的选择将(2)中制备的COS7细胞用胰蛋白酶-EDTA溶液(Sigma公司制造)从平皿上剥离，用PBS洗涤细胞。将洗涤后的细胞悬浮于适量的PBS中，制备细胞悬浮液。将细胞悬浮液适量点在载玻片上，风干后，用丙酮(和光纯药工业公司制造)固定。使(1)中制作的含有抗HBs单克隆抗体的约300克隆的培养上清分别与丙酮固定后的载玻片反应。使用FITC标记抗小鼠Ig抗体通过荧光显微镜观察判定各单克隆抗体对野生型HBsAg以及20种突变型HBsAg的反应性。结果就象表2所示那样，确认杂交瘤HBs-1053产生的1053抗体以及杂交瘤HBs-149产生的149抗体具有广泛的反应性。
表2

表2中的「+」表示抗体识别抗原，并与之结合，「-」表示不能发生抗体抗原反应。
由表2可知，149抗体除了不能与表1所示具有145位氨基酸突变的突变型HBsAg结合之外，可以与其它所有的突变型HBsAg以及野生型HBsAg结合。另外，1053抗体可以与表1所示的所有突变型HBsAg以及野生型HBsAg结合。
实验例2以野生型HBsAg的DNA作为模板，使用PCR法制备编码野生型HBsAg(亚型adr)的1位至196位的氨基酸序列的DNA、插入到真核细胞用表达载体pcDNA3.1(+)中，制备野生型HBsAg表达用质粒。将该质粒导入COS7细胞，于5％CO2培养箱内培养24小时。该COS7细胞可以表达197位以下氨基酸缺失的HBsAg(以下、记为C末端缺失HBsAg)。
149抗体以及1053抗体是否和C末端缺失的HBsAg反应，与实验例1同样操作进行判定。判定结果如下面表3所示。
表3

由表3可以确认149抗体以及1053抗体能够识别C末端缺失HBsAg。由此判明149抗体以及1053抗体的抗原表位存在于HBsAg的1～196位的区域中。
序列表<110>希森美康株式会社<120>抗HBsAg单克隆抗体<130>04-094CN<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>226<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>1Met Glu Asn Thr Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln1 5 10 15Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Lys Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu20 25 30Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Cys35 40 45Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser50 55 60Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe65 70 75 80Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val85 90 95Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly
100 105 110Thr Thr Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala115 120 125Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp130 135 140Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg145 150 155 160Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu165 170 175Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu180 185 190Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Asn Ile195 200 205Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val210 215 220Tyr Ile22权利要求
1.可与下面1)、2)和3)所述的HBsAg结合的单克隆抗体；1)野生型HBsAg、2)从相对于野生型HBsAg，120位氨基酸有突变的突变型HBsAg和相对于野生型HBsAg，141位氨基酸有突变的突变型HBsAg中选择的至少一个突变型HBsAg、3)从相对于野生型HBsAg，118位氨基酸置换突变为赖氨酸的突变型HBsAg以及相对于野生型HBsAg，只在144位氨基酸突变，该突变是置换突变为谷氨酸的突变型HBsAg中选择的至少一个突变型HBsAg。
2.权利要求1所述的单克隆抗体，其中与上述的野生型HBsAg相比在120位的氨基酸有突变的突变型HBsAg是与野生型HBsAg相比在120位氨基酸置换突变为谷氨酰胺或苏氨酸的突变型HBsAg。
3.权利要求1所述的单克隆抗体，其中与上述野生型HBsAg相比在141位氨基酸有突变的突变型HBsAg是与野生型HBsAg相比在141位的氨基酸置换突变为谷氨酸的突变型HBsAg。
4.权利要求1所述的单克隆抗体，至少可以与从以下突变体中选择的一种突变型HBsAg结合相对于野生型HBsAg，111位的氨基酸有突变的突变型HBsAg、相对于野生型HBsAg，126位的氨基酸有突变的突变型HBsAg、相对于野生型HBsAg，129位的氨基酸有突变的突变型HBsAg、相对于野生型HBsAg，133位的氨基酸有突变的突变型HBsAg、相对于野生型HBsAg，134位的氨基酸有突变的突变型HBsAg、相对于野生型HBsAg，135位的氨基酸有突变的突变型HBsAg、相对于野生型HBsAg，142位的氨基酸有突变的突变型HBsAg、相对于野生型HBsAg，143位的氨基酸有突变的突变型HBsAg、相对于野生型HBsAg，148位的氨基酸有突变的突变型HBsAg、相对于野生型HBsAg，154位的氨基酸有突变的突变型HBsAg以及相对于野生型HBsAg，155位的氨基酸有突变的突变型HBsAg。
5.权利要求4所述的单克隆抗体，是如下突变体的抗体所述111位氨基酸的突变是置换突变为苏氨酸，所述126位氨基酸的突变是置换突变为丝氨酸，所述129位氨基酸的突变是置换突变为组氨酸，所述133位氨基酸的突变是置换突变为亮氨酸，所述134位氨基酸的突变是置换突变为丙氨酸，所述135位氨基酸的突变是置换突变为丝氨酸，所述142位氨基酸的突变是置换突变为亮氨酸或置换突变为丝氨酸，所述143位氨基酸的突变是置换突变为亮氨酸，所述148位氨基酸的突变是置换突变为组氨酸，所述154位氨基酸的突变是置换突变为色氨酸，所述155位氨基酸的突变是置换突变为酪氨酸。
6.权利要求1所述的单克隆抗体，是可以至少可与从下面的突变型HBsAg中选择的一个突变型HBsAg结合的抗体相对于野生型HBsAg，111位的氨基酸有突变的突变型HBsAg、相对于野生型HBsAg，126位的氨基酸有突变的突变型HBsAg、相对于野生型HBsAg，129位的氨基酸有突变的突变型HBsAg、相对于野生型HBsAg，133位的氨基酸有突变的突变型HBsAg、相对于野生型HBsAg，134位的氨基酸有突变的突变型HBsAg、相对于野生型HBsAg，135位的氨基酸有突变的突变型HBsAg、相对于野生型HBsAg，142位的氨基酸有突变的突变型HBsAg、相对于野生型HBsAg，143位的氨基酸有突变的突变型HBsAg、相对于野生型HBsAg，145位的氨基酸有突变的突变型HBsAg、相对于野生型HBsAg，148位的氨基酸有突变的突变型HBsAg、相对于野生型HBsAg，154位的氨基酸有突变的突变型HBsAg及び相对于野生型HBsAg，155位的氨基酸有突变的突变型HBsAg。
7.权利要求6所述的单克隆抗体是如下突变体的抗体上述111位氨基酸的突变是置换突变为苏氨酸上述126位氨基酸的突变是置换突变为丝氨酸，上述129位氨基酸的突变是置换突变为组氨酸，上述133位氨基酸的突变是置换突变为亮氨酸，上述134位氨基酸的突变是置换突变为丙氨酸，上述135位氨基酸的突变是置换突变为丝氨酸，上述142位氨基酸的突变是置换突变为亮氨酸或置换突变为丝氨酸，上述143位氨基酸的突变是置换突变为亮氨酸，上述145位氨基酸的突变是置换突变为精氨酸或置换为赖氨酸，上述148位氨基酸的突变是置换突变为组氨酸，上述154位氨基酸的突变是置换突变为色氨酸，上述155位氨基酸的突变是置换突变为酪氨酸。
8.权利要求1所述的单克隆抗体，其中上述野生型HBsAg以及突变型HBsAg的亚型是adr型。
9.能够产生权利要求1所述的单克隆抗体的杂交瘤。
10.被保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心的国际保藏编号为FERM BP-10582的杂交瘤。
11.被保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心的国际保藏编号为FERM BP-10583的杂交瘤。
全文摘要
提供能够与从野生型HBsAg、与野生型HBsAg相比，120位有突变的突变型HBsAg以及与野生型HBsAg相比，141位有突变的突变型HBsAg中选择的至少一个突变型HBsAg，以及从与野生型HBsAg相比，118位的氨基酸置换突变为赖氨酸的突变型HBsAg以及与野生型HBsAg相比，只在144位有突变，该突变是置换突变为谷氨酸的突变型HBsAg选择的至少一个突变型HBsAg结合的单克隆抗体。
文档编号C12N5/18GK1896102SQ20061008247
公开日2007年1月17日 申请日期2006年5月18日 优先权日2005年5月18日
发明者武田和彦, 梶田忠宏, 朝枝步 申请人:希森美康株式会社