肠出血性大肠杆菌0157:H7志贺毒素2A1亚单位活性片段Stx2a₁重组蛋白及表达方法与应用的制作方法

专利名称：：肠出血性大肠杆菌0157:H7志贺毒素2A1亚单位活性片段Stx2a₁重组蛋白及表达方法与应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于基因工程
技术领域：
，具体地说涉及一种肠出血性大肠杆菌0157:H7志贺毒素2A:亚单位活性片段Stx2a!蛋白的表达方法及应用。
背景技术：
：肠出血性大肠杆菌(EHEC)0157:H7于1975年^f皮首次分离，因其能产生致死性志贺毒素(Shigatoxin,Stx),1982年^L确认为严重人兽共患致病菌。其感染具有暴发流行趋势、强烈的致死性和抗生素治疗可加剧病情的危险性等特点，已经成为全球公共卫生问题，对人类健康构成了巨大威胁。同时，EHEC0157:H7培养容易、感染力强、传播途径多样，使其极有可能作为未来军事战争的细菌武器和生物恐怖战剂；E服C0157:H7的烈性致病因子还有可能用于基因重组新型生物武器一一基因武器的构建。美国疾病控制中心(CDC)已将EHEC0157:H7列为B类生物恐怖病原体严加防范。近年来，0157:H7EHEC感染的暴发流行在世界各地接连发生，尤其是日本、美国等。美国食品和药品监^^管理局(FDA)近期宣布，于2006年9月14日爆发的大规模大肠杆菌感染经流行病学调查已证实，病原菌即为EHEC0157:H7型。感染病例数上升迅速，发现感染病例的地区也已扩大到全美20个州。中国江苏、安徽省曾于1999年暴发流行EHEC0157:H7感染性腹泻，患者超过2万例，死亡177例，流4亍时间7个月(http:〃w丽.szed.com/n/ca505201.htm)。这可能是迄今为止世界上流行规模最大的一次。2001年上述地区又发生疫情，并且范围扩大到西部、中原地区，甚至在东北、华北及华东少数地区也发生散发的0157:H7感染。目前中国已处于高发流行期，疫情不可能短期消失，必须引起全社会的高度重视。基于这种严峻的形势，中国已将肠出血性大肠杆菌列为21世纪可能对国人卫生健康有重大影响的12种病原」微生物之一。EHEC0157:H7多为食源性或水源性感染，人与人之间或人与家畜之间通过粪口途径传^番。感染该菌可4吏人患腹渴、出血性结肠炎(^^orr力ag/cco//〃^HC),还可引发溶血性尿毒综合症(化/^//〃<7"re/z/csj^/ro/，HUS)及血栓性血小4反;咸:!y^^疯(r力ro/z^or/c/^rcwc^oc/fope^/cpo/77wra,TTP)等严重并发症，致死率达5~10%。临床研究证实使用抗生素可促使0157:H7菌体破裂，"爆发性"释放致死性志贺毒素(Stx)，从而使患者死亡的危险性增加。因此，2002年中国卫生部制定的EHEC0157:H7感染性腹泻应急处理预案第5条有关病人的隔离治疗规定"EHEC0157:H7病人和疑似病人(包括粪便标本0157:H7抗原胶体金方法检测阳性的腹泻病人)禁止使用抗生素，疫区内的其他一般腹泻病人应慎用抗生素。"。目前国内外尚无可用于治疗人EHEC0157:H7感染的特效药物。因此，寻求特异有效的0157疫苗来防治0157:H7感染已迫在眉睫。志贺毒素(Shigatoxin,Stx)是EHEC的一种最为重要的毒力因子，是导致EHEC0157:H7EHEC感染病人出现HC、HUS的主要原因，也是EHEC0157:H7重要的保护性抗原之一，包括Stxl和Stx2两个亚类，均由1个A亚单位和5个B亚单位组成，A亚基为毒力亚单位，具有细胞内毒性，能与28SrRNA作用导致蛋白质合成停止，是大肠杆菌0157:H7引起临床表现的病理基础;B亚基为结合亚单位，无毒而具有细胞结合特性，能与细胞表面糖鞘脂受体(Gb3)特异结合，从而引导A亚单位发挥作用，其均具有较强的免疫原性。同时，公布的Stx2全毒素的晶体结构解析显示，A亚单位由A,和A2两部分通过二碌j建连接组成，毒性的活性中心位于Ai片段的第77位的酪氨酸，此外，A2片段形成螺旋结构插入5个B亚基形成的小孑L中(MarieE.Fraser,Masao，FujinagaMaiaM.Cherney.StructureofShigatoxintype2(stx2)fromEscherichiacoli0157:H7.[J].BiologicalChemistry,2004，279(26):27511-27517)。因此，作为毒素主要毒力片段的Stx2A:是优选的治疗药物设计靶点。申请人实验室前期将Stx2A!全长序列分别构建在pET-22b、pET-28a、pET-32a、pET-41a、pQE-30、PMXB10等表达载体上，但均未表达(见附图l)。原因可能是Stx2A,羧基端的疏水性、其本身的空间构象或者是宿主菌中存在一种蛋白抑制其表达等等造成的，同时也与不同的￡cW/菌4朱间发生DNA转移时存在一种DNA酶抗性融合机制以及具有不同的限制-修饰系统有关。目前国内外尚无Stx2Ai全长序列构建表达的相关研究报道。
发明内容本发明的一个目的是提供一种肠出血性大肠杆菌0157:H7志贺毒素2A,亚单位活性片段Stx2a,重组蛋白，其包括1)肠出血性大肠杆菌0157:H7志贺毒素2A:亚单位活性片段Stx2a!蛋白和表达载体片段；或2)肠出血性大肠杆菌0157:H7志贺毒素2A!亚单位活性片段Stx2a:蛋白羧基端经一个或几个氨基端缺失或添加获得的与Stx2a!蛋白具有相似功能的蛋白和表达载体片段。其中，上述的肠出血性大肠杆菌0157:H7志贺毒素2A!亚单位活性片段Stx2a,蛋白的氨基酸序列如SEQIDN0:1所示，其编码核香酸序列如SEQIDNO:2所示。本发明的较佳实施例中，上述的表达载体为pET-22b。本发明的另一目的是提供上述的肠出血性大肠杆菌0157:H7志贺毒素2A:亚单位活性片段Stx2a:重组蛋白的表达方法，其是将截短去掉肠出血性大肠杆菌0157:H7志贺毒素2Ai亚单位羧基端1~20个氨基酸后对应的核香酸序列片段与表达载体连4妻，然后转化宿主菌进行表达。本发明的较佳实施例中，上述的肠出血性大肠杆菌0157:H7志贺毒素2Ai亚单位活性片段Stx2a!重组蛋白表达方法，其是将截短去掉肠出血性大肠杆菌0157:H7志贺毒素2A!亚单位羧基端15个氨基酸后对应的核普酸序列片段与表达载体连接，然后转化宿主菌进行表达。上述的肠出血性大肠杆菌0157:H7志贺毒素2Ai亚单位活性片段Stx2a!重组蛋白表达方法，具体包含以下步骤1)通过生物信息学软件分析肠出血性大肠杆菌0157:H7志贺毒素2A,亚单位，截短去掉其羧基端1~20个氨基酸后，根据截短后的氨基酸序列对应的核苷酸序列片段设计引物；2)以步骤l)设计的引物、通过PCR扩增肠出血性大肠杆菌0157:H7志贺毒素2A!亚单位活性片段Stx2a,蛋白基因；3)将所述出血性大肠杆菌0157:H7志贺毒素2A!亚单位活性片段Stx2a:蛋白基因克隆至表达载体，然后转化至宿主菌；4)诱导表达Stx2a,蛋白；5)纯化步骤4)得到的Stx2a!蛋白；6)纯化后的31乂2&1蛋白的免疫原性的检测。其中步骤l)中设计得到的引物为SEQIDN(h4-5;步骤2)中的PCR模板优选为为含志贺毒素2的菌抹99A021;步骤3)中所述的表达载体优选为pET-22b,宿主菌优选为BL21,其中步骤3)中得到的宿主菌BL21中导入了包含肠出血性大肠杆菌0157:H7志贺毒素2A,亚单位活性片段Stx2a,蛋白的编码核苷酸序列SEQIDNO:2的表达载体pET-22b;步骤5)中优选采用免疫亲和层析法纯化所述Stx2a:蛋白。本发明的另一目的是提供上述的肠出血性大肠杆菌0157:H7志贺毒素2A:亚单位活性片段Stx2a,重组蛋白的应用，其可用于制备4企测试剂盒或抗肠出血性大肠杆菌0157:H7感染的亚单位疫苗。本发明人应用生物信息学对Stx2Ai全长氨基酸序列进行综合分析，其羧基端约20个氨基酸的抗原性及亲水性较弱，在不改变其抗原性的前提下将其羧基端分别截短1-20个氨基酸后对Stx2A^舌性片段进行克隆、表达和保护性免疫的研究，将Stx2Ai羧基端截短氨基酸后的片段命名为Stx2au本发明公开的此截短的EHEC0157:H7Stx2A,亚单位活性片段Stx2a!蛋白的纯化方法，纯化出的Stx2a!蛋白含量达98%以上。本发明人对Stx2a,的免疫性进行评价，发现构建的活性片段能高效表达并且可以用于疫苗，并且动物实验中显示有良好的免疫原性。用纯化出的截短的EHEC0157:H7Stx2A!亚单位活性片段Stx2a,重组蛋白免疫5-6周龄的Balb/C小鼠，每次每只小鼠皮下多点及腹部注射蛋白100首次免疫两周后第二次免疫，以后隔一周免疫一次，共四次，末次免疫后4天取尾血ELISA4全测血清特异性抗体效价，末次免疫后10天进行免疫动物攻毒保护试验。本发明的主要优点在于用生物信息学预测及分析，Stx2aj至克隆构建获得高表达的可溶蛋白，经纯化后纯度高达98%，动物实验证明Stx2a!可刺激机体产生高效的免疫应答和免疫预防保护作用，说明此活性片段具有良好的免疫原性，特异性好。作为毒素主要毒力片段的Stx2A!是优选的治疗药物设计靶点，因此Stx2A!活性片段的构建表达对今后关于EHEC0157:H7的实验研究及疫苗和治疗制剂、诊断试剂盒等的研制均有重要的意义。为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细il明如下。图1:空载体pQE-30与Stx2Ai全长蛋白重组质粒诱导表达分析(pET-22b、pET-28a、pET-32a、pET-41a等载体与此相同)，其中1、2、3、4:空载体pQE-30经IPTG诱导0小时、1小时、3小时、5小时的表达产物6、7、8、9:重组目的蛋白经IPTG诱导0小时、1小时、3小时、5小时的表达产物M:蛋白marker;图2:DNAstar软件分析EHEC0157:H7Stx2A!亚单位的基因序列;图3:截短的EHEC0157:H7Stx2A!亚单位活性片段Stx2a!PCR产物的琼脂糖凝胶电泳l.DNAmarker2.Stx2a!的PCR扩增产物；图4:pMD18—T/stx2a!经Ndel、Xhol双酶切鉴定M:100bpmarker1:pMD18—T/stx2a!(质冲立1)2:pMD18-T/stx2a丄(质粒2);图5:原核重组质粒pET-22b/stx2aj至Ndel、Xhol双酶切鉴定M:100bpmarker1:pET_22b/stx2a!(/承'4玄纟且,^"谇二1)2:pET-22b/stx2a,(原核重组质粒2);图6:pET-22b/BL21空载体与重组质粒pET-22b/stx2a^BL21诱导表达分析1.蛋白Marker2、3、4、5.:pET-22b/BL21空载体经IPTG诱导0小时、1小时、3小时、5小时的表达产物6、7、8、9.:重组质粒pET-22b/stx2a〃BL21经IPTG诱导0小时、1小时、3小时、5小时的表达产物；图7:16。C低温诱导后可溶性表达分析M:蛋白marker1:16。C诱导的破菌后的上清2:16。C诱导的^s皮菌后的沉淀；图8:pET-22b/stx2ai/BL21原核表达的纯化产物的SDS-PAGE分析M:蛋白marker1:流穿2-7:目的蛋白洗脱；图9:表达产物纯化层析峰形图；图10:Westernblot分析截短的EHEC0157:H7Stx2A!亚单位活性片段Stx2a!表达产物的免疫活性；M:子贞染蛋白marker1:纯化的Stx2a,目的蛋白显色条带2:纯化的0157天然毒素显色条带。具体实施方式以下实施方式结合附图进一步加以描述(以截短Stx2A,羧基端15个氨基酸为例)。实施例l:肠出血性大肠杆菌0157:H7Stx2A,亚单位活性片段Stx2a,的克隆1贫扭大肠杆菌99A021由江苏省疾病控制中心提供，质粒pET-22b和大肠杆菌BL21、DH5oc为申请人实验室保存，ExTaqDNA聚合酶、限制性核酸内切酶XhoI和NdeI、丁4连4妄酶及DNAmarker均为大连TaKaRa7>司产品；质粒抽提试剂盒为OMEGA公司产品；胶回收试剂盒为BBI公司产品；细菌基因组DNA提取试剂盒为天根公司产品。2.根据EHEC0157:H7Stx2A,亚单位全长基因序列，如SEQIDNIO:3所示。应用DNAstar專欠件分析见附图2说明。3.引物的设计与合成(下划线是酶切位点)才艮据DNAstar软件分析表明其羧基端约20个氨基酸抗原性较低，且根据其活性中心位于77和167位氨基酸上及其抗原性、可塑性、亲水性、柔韧性等分析，将其羧基端去掉15个氨基酸，所得的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，其对应的基因序列如SEQIDN0:2所示。依照酶切位点检索和引物设计原则，应用软件Primer5.0根据此修改后的核酸序列设计引物为Pi(SEQIDNO:4),P2(SEQIDNO:5),上游引物5'端引入NdeI酶切位点，下游引物的3'端引入XhoI酶切位点上游5'TCCATATGCGGGAGTTTACGATAGAC3NdeI下游P25'TGCTCGAGAAAGGATATTCTCCCCAC3'XhoI4.模板的准备无菌接种环蘸取保存的99a021菌林三线法接种于lb平板，37。c培养12小时，挑取单个菌落接种于5mlLB培养液中，3rC摇床培养8小时按TIANampBacteriaDNAKit说明提取大肠杆菌99A021基因组DNA,-20。C保存备用。5.PCR扩增pcr扩增体系(50m1)。pcr条件为94。c预变性5分钟，94。c变性1分钟，6(TC退火30秒，72。C延伸l分钟，30个循环，72。C完全延伸IO分钟。PCR体系如下:模板DNA1jilPl(25pmo1/ja1)1ju1P2(25prao1/|i1)1ia1dNTPs(2.5mmol/1each)4ja110xPCR缓冲液10julMgCl2(25mmol/i)5p1^Y-ragDNA聚合酶0.25|a1ddH2032.75ja1PCR产物(取3ja1)经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定分子量大小PCR扩增效果如附图3所示。6.PCR产物的纯化回收:参照EZ-10SpincolumnDNAGelEntiactionKit说明进行7.PCR产物的克隆与鉴定采用TA克隆方法克隆PCR产物，经NdeI、XhoI双酶切鉴定见附图48.PCR产物与pET-22b载体酶切回收将pET-22b载体和已克隆的PCR产物分别用NdeI和XhoI酶切，酶切体系为50jul，于37。C酶切4小时得到酶切产物。9.酶切产物的纯化回收参照EZ-10SpincolumnDNAGelEntiactionKiti兌明进4亍。10.连接目的基因与pET-22b载体连接反应按TJ)NA连接酶的说明书进行，反应体系为IO于22'C连接过夜。11.重组质粒pET-22b/stx2a!连接鉴定目的基因与pET-22b载体经T4DNA连接酶连接过夜后转化感受态大肠杆菌BL21,转化产物涂布于含氨节青霉素的LB平板，37。C培养过夜，挑取单菌落接种于5ml的含氨节青霉素的LB液体培养基中，37。C摇床培养过夜，抽提质粒，经NdeI、XhoI双酶切鉴定和测序(见附图5)。结果此截短的目的基因stx2ai与表达载体pET-22b连接转化宿主菌后经NdeI和Xhol双酶切鉴定，证明已连接上表达载体此截短的目的基因构建成功，测序结果与理^仑的225个氨基酸序列一致。实施例2:EHEC0157:H7Stx2A!亚单位活性片段Stx2a,在大肠杆菌中的表达与纯化1.目的基因的诱导表达将经NdeI、XhoI双酶切和测序鉴定正确的活性片,殳Stx2ai重组菌种和pET-22b载体/BL21菌液接种至含氨节青霉素的LB液体培养液中，按常规方法诱导表达，(37。C摇床培养至A鋼为0.6-0.8,各取样加入SDS-PAGE上样緩冲液冻存，加入IPTG至终浓度为0.lmmol}_,37。C摇分别于1小时、3小时、5小时取样加入SDS-PAGE上样緩沖液冻存，沸水煮5分钟后按常》见方法进行SDS-PAGE凝胶电泳分析(见附图5)。结果显示与pET-22b空载体对比，重组Stx2a!蛋白在25kDa大小左右有明显条带，表明EHEC0157:H7Stx2A:亚单位活性片段Stx2a!在大肠杆菌中表达。2.表达形式的鉴定将鉴定正确的重组菌种按常规方法诱导表达，37。C摇床培养至A,为0.6-0.8，加入IPTG至终浓度为0.1鹏ol，16。C摇床培养12小时，收集菌液5000rpm离心15分钟，弃上清后加入30mlTris-HC1(pH7.5)悬浮沉淀物，将悬浮物超声破菌(功率300W,超声8秒，间隔6秒，循环99次)，制成裂解液，12000rpm离心30分钟，取破菌后上清和沉淀，按常^见方法进行SDS-PAGE凝胶电泳分析(见附图6)。结果显示在16。C用终浓度为0.1mmol的IPTG诱导目的基因在大肠杆菌中表达，Stx2a!重组蛋白为可溶性表达，且表达量达40%。3.基因表达产物的纯化用緩沖液A(20mMTris+0.5MNaCl,pH7.5)平衡10个床体积，流速为lml/分钟，将20ml超声破菌上清经0.45wm滤膜过滤，上样，流速为0.5m1/分钟，用緩冲液A再洗IO个柱床体积，流速为1ml/分钟，用分别含IOO、150、500mM咪唑的緩冲液B(緩冲液A+0.5M咪唑+0.5MNaCl,pH7.5)进行阶段洗脱，流速为lml/分钟，收集各阶段的洗脱峰，用SDS-PAGE检测蛋白的分子量大小和纯度(见附图7、8)。SDS-PAGE结果显示纯化后的蛋白分子量大小约为25kDa与理论大小相符，纯度为98%。4.Westernblot;险测表达产物的抗原性将纯化的目的蛋白进行SDS-PAGE(12%)电泳，然后以100mA电转移1小时，将目的蛋白转移到NC膜上，加入5。/。脱脂奶粉4。C封闭过夜，TTBS洗膜5分钟x4，加入由本实验室构建的抗EHEC0157:H7Stx2Ai亚单位的单克隆抗体SA(1:1000)，37。C孵育1小时，TTBS洗膜5分钟x4,加入二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG),孵育1小时，TTBS洗膜5分钟x4，加入DAB底物显色5分钟，水洗终止反应，扫描记录，同时作天然毒素Stx2与SA的Westernblot作为对照试验。见附图9。结果印记显示本实验室纯化的天然毒素与一抗SA在32kDa大小左右有明显显色条带，重组目的蛋白Stx2ai与一抗SJ)s在25kDa大小左右有明显显色条带，表明EHEC0157:H7Stx2Ai亚单位活性片段Stx2a!具有免疫反应性。实施例3:酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测EHEC0157:H7类毒素免疫小鼠的抗体的产生1.EHEC0157:H7类毒素制备采用福尔马林灭活法将本实验室纯化出的天然EHEC0157:H7毒素蛋白加入曱醛终浓度1%,37。C灭活5天。2.免疫程序免疫5-6周龄的Balb/c小鼠五只，100|ig/只，100ju1灭活的天然毒素首次免疫加等量免疫原弗氏佐剂，此后加不完全弗氏佐剂注射小鼠腹部和腹股沟皮下免疫。首次免疫后两周进行第二次免疫，以后每周一次，于免疫四次后第七天取d、鼠的血液上清检测产生的抗体。3.釆用EHEC0157:H7StxM!亚单位活性片段Stx2a!具有免疫反应性重组蛋白包被的ELISA板4全测纯化的EHEC0157:H7天然毒素蛋白免疫的Balb/c小鼠产生的抗体，步骤如下1)酶标板的预处理将新购酶标板用双蒸水浸泡过夜，晾干后备用。2)用包被液将抗原稀释为合适的浓度纯化的EHEC0157:H7天然毒素蛋白稀释浓度分别为0.25jag/ml，0.5jig/ml，0.75|ng/ml,1|ng/ml。3)包被酶标板加10Gjil/孔上述抗原液，4。C过夜，洗涤液洗涤5遍，空干。4)封闭加封闭液300/孔，4。C过夜，洗涤5遍，空干，密封4°C保存备用。5)采血及稀释小鼠眼眶取血，离心取上清用抗体稀释l:IOOO倍稀释。6)取包被好的酶标板，加入依次稀释血清100nl/孔，37。C水浴30分钟，洗涤4遍，空干。7)加辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG抗体工作液(l:20000稀释)100Ml/孔，37。C水浴30分钟，洗涤4遍，空干。8)加底物显色液IOOial/孔，室温避光反应5-10分钟。9)加终止液50lil/孔，立即在酶标4义上以492nm波长测定OD值10)结果判断OD值大于或等于阴性对照(小鼠免疫前血清1:IOO倍稀释)的2.1倍时视为抗体阳性。结果Stx2a,重组蛋白检测的0157:H7天然毒素免疫小鼠产生的抗体效价为1:64000。说明本发明构建的活性片段Stx2ai能够特异性识别并检测EHEC0157:H7免疫小鼠产生的抗体。实施例4:肠出血性大肠杆菌0157:H7Stx2^亚单位活性片段Stx2a^重组蛋白免疫小鼠的保护性效果观察1.试验材料0157感染动物模型Balb/c小鼠，雌性，5-6周龄，由本实验室程建平和易勇等建立(程建平，易勇，毛旭虎等。肠出血性大肠杆菌0157:H7感染动物模型的建立。中国人兽共患病杂志，2005，21(4):42-45。)，(人和牲畜预防用出血性大肠杆菌0157:H7疫苗及制备方法，王庆旭，200510057206.9)2.动物免疫及抗体^:测方法目的蛋白经过纯化后免疫5-6周龄的Balb/c小鼠五只，100pg/只，100p1抗原与等量弗氏佐剂混合，注射小鼠腹部和腹股沟皮下免疫。首次免疫后两周进行第二次免疫，以后每周一次，分别于免疫3、4次后的5天采血，ELISA检测血清特异性抗体效价的改变。结果目的蛋白免疫3次后的抗体阳性率在90°/。，免疫4次后的抗体阳性率达到95%。3.免疫动物的攻毒保护实验同上相同的免疫方案，免疫四次后的第IO天采用致死剂量的0157:H7菌超声上清液(含Stx2毒素及其他致病物质，蛋白浓度1mg/ml)0.05ml腹腔注射对免疫小鼠及对照小鼠进行攻毒实验，观察各组小鼠的死亡情况，在30天的观察期后计算免疫小鼠的死亡/生存率如表表:<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>结果Stx2a!免疫组在攻毒实验30天后存活数量为45只，保护率达90%,而对照组在攻毒实验5天后就全部死亡，保护率为0。通过以上实验说明本发明的活性片段Stx2a!重组蛋白具有良好的免疫原性并且能够对EHEC0157:H7感染起到保护作用，能够诱导机体产生免疫应答，表达本发明Stx2aj舌性片段在亚单位疫苗的应用上是成功的。虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属
技术领域：
的技术人员，在不脱离本发明之精神和范围内，当可作些许之更动与改进，因此本发明之保护范围当视权利要求所界定者为准。序列表<110>中国人民解放军第三军医大学<120>肠出血性大肠杆菌0157:H7志贺毒素2A1亚单位活性片段Stx2a!重组蛋白及表达方法与应用<130><160>3<210>1<211〉225<212〉PRT<213>肠出血性大肠杆菌(Enterohe匿rhagic^sr力e".c/w'3co7力<220><223>活性片段Stx2ai的氨基酸序列<400>1ArgGluPheThrlieAspPheSerThrGinGinSerTyrValSer15151015SerLeuAsnSerlieArgThrGlulieSerThrProLeuGluHis302025lieSerGinGlyThrThrSerValSerVallieAsnHisThrPro453540Pro'GlySerTyrPheAlaValAsplieArgGlyLeuAspValTyr605055GinAlaArgPheAspHisLeuArgLeulielieGluGinAsnAsn756570LeuTyrValAlaGlyPheValAsnThrAlaThrAsnThrPheTyr908085ArgPheSerAspPheThrHislieSer10595100ValSerMetThrThrAspSerSerTyr120110115AlaAlaLeuGluArgSerGlyMetGin135125130ValSerSerTyrLeuAlaLeuMetGlu150140145ThrArgAspAlaSerArgAlaValLeu165155160AlaGluAlaLeuArgPheArgGinlie180170175AlaLeuSerGluThrAlaProValTyr195185190ValAspLeuThrLeuAsnTrpGlyArglieSerAsnValLeuPro210200205225ValProGlyValThrThrThrThrLeuGinArgVallieSerArgHisSerLeuPheSerGlyAsnThrMetArgPheValThrValThrGinArgGluPheArgGinThrMetThrProGlyAspGluTyrArgGlyGluAspGlyValArgValGlyArglieSerPhe215220<210>2<211>675〈212>腿<213〉肠出血性大肠杆菌(Enterohe匿rhagic￡sc/ei-/c^.sco7j')<220><223〉活性片段Stx2a!的核苷酸序列<400>2Cggg3gttt3cgategacttttcgacccaacaaagttatgtctcttcgtt60cggacagagatatcgacccctcttgaacaatatctcaggggaccacatcggtgtctgtt120attaaccacaccccaccgggcagttattttgctgtggatatacgsgggcttgatgtctat180caggcgcgttttgaccatcttcgtctgattattgagcaaaataatttatatgtggccggg240ttcgttaatacggcaac犯atactttctaccgtttttcagattttacacatatatcagtg300cccggtgtgacaacggtttccatgacaacgg3C3gC8gttataccactctgcaacgtgtc360gcagcgctggaacgttccggagtcgtcactcactggtttcatcata/tctg420gcgttaatgg3gttC3gtggaccagagatgC3tcca_g3gcagttctgcgt480tttgtcactgtcac3gcagaagccttacgcttcaggcagatacagag兆satttcgtcag540gcactgtctgaaactgctcctgtgta_tscgatgacgccggg卿Cgtgg3cctcactctg600aactgggggcgaatcagc犯tgtgcttccgg8gt3tCgggg卿ggatggtgtc卿gtg660ggg卿3tatccttt675<210>3<211〉720<212〉腿<213>肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic￡s"cAarj'c/_z'aco/i)<220>〈223>EHEC0157:H7Stx2M亚单位的核苷酸序列<400〉3cgggagtttacgatagacttttcgacccaacaaagtteitgtctcttcgtt60cggac卿gatatcgacccctcttgaacaatatctcaggggaccacatcggtgtctgtt120attaaccacaccccaccgggcagttattttgctgtgg咖tacg鄉gcttgatgtctat180caggcgcgttttgaccatcttcgtctgattattgagc犯atgtggccggg240ttcgtt犯tatactttctacCgtttttC3gattttacaca城3tC3gtg300cccggtgtgacaacggtttccatgacaacggacagcagttataccactctgcaacgtgtc360gcagcgctgg犯cgttccgg肌tgca犯tcagtcgtcactcactggtttc420gcgt恤tggagttcagtggaccag3g3tgcatccagagcagttctgcgt480tttgtcactgtcacagcagaagccttacgcttcaggcagaatttcgtcag540gcactgtctgaaactgctcctgtgtatacgatgacgccggg卿cgtggacctcactctg600aactgggggcg肪tcagca^tgtgcttccgg3g城Cgggg卿ggatggtgtc卿gtg660ggg卿自tcctttaataatatatcagcgatactggggactgtggccgtt720权利要求1.一种肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素2A1亚单位活性片段Stx2a1重组蛋白，其特征在于包括1)肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素2A1亚单位活性片段Stx2a1蛋白和表达载体片段；或2)肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素2A1亚单位活性片段Stx2a1蛋白羧基端经一个或几个氨基端缺失或添加获得的与Stx2a1蛋白具有相似功能的蛋白和表达载体片段。2.才艮据权利要求1所述的肠出血性大肠杆菌0157:H7志贺毒素2A1亚单位活性片段Stx2a1重组蛋白，其特征在于所述的肠出血性大肠杆菌0157:H7志贺毒素2Ai亚单位活性片段Stx2a!蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。3.根据权利要求1所述的肠出血性大肠杆菌0157:H7志贺毒素2A,亚单位活性片段Stx2a1重组蛋白，其特征在于所述的肠出血性大肠杆菌0157:H7志贺毒素2Ai亚单位活性片段Stx2a,蛋白的编码核脊酸序列如SEQIDN0:2所示。4.权利要求1所述的肠出血性大肠杆菌0157:H7志贺毒素2、亚单位活性片段Stx2ai重组蛋白的表达方法，其特征在于将截短去掉肠出血性大肠杆菌0157:H7志贺毒素2&亚单位羧基端1~20个氨基酸后对应的核苷酸序列片段与表达载体连接，然后转化宿主菌进行表达。5.根据权利要求4所述的肠出血性大肠杆菌0157:H7志贺毒素2A:亚单位活性片段Stx2a,重组蛋白表达方法，其特征在于在于将截短去掉肠出血性大肠杆菌0157:H7志贺毒素2A!亚单位羧基端15个氨基酸后对应的核苷酸序列列片段与表达载体连接，然后转化宿主菌进行表达。6.根据权利要求4所述的肠出血性大肠杆菌0157:H7志贺毒素2A!亚单位活性片段Stx2ai重组蛋白表达方法，其特征在于包含以下步骤1)通过生物信息学软件分析肠出血性大肠杆菌0157:H7志贺毒素2A!亚单位，截短去掉其羧基端1~20个氨基酸后，根据截短后的氨基酸序列对应的核苦酸序列片段设计引物；2)以步骤l)设计的引物、通过PCR扩增肠出血性大肠杆菌0157:H7志贺毒素2A!亚单位活性片段Stx2a!蛋白基因；3)将所述出血性大肠杆菌0157:H7志贺毒素2A,亚单位活性片段Stx2a:蛋白基因克隆至表达载体，然后转化至宿主菌；4)诱导表达Stx2ai蛋白；5)纯化步骤4)得到的Stx2a!蛋白；6)纯化后的Stx2a!蛋白的免疫原性的检测。7.根据权利要求4所述的肠出血性大肠杆菌0157:H7志贺毒素2A!亚单位活性片段Stx2a,重组蛋白表达方法，其特征在于步骤1)中设计得到的引物为SEQIDNO:4-5。8.根据权利要求4所述的肠出血性大肠杆菌0157:H7志贺毒素2A:亚单位活性片段Stx2a!重组蛋白表达方法，其特征在于步骤2)中的PCR模板为专产志贺毒素2的菌林99A021。9.根据权利要求4所述的肠出血性大肠杆菌0157:H7志贺毒素2A!亚单位活性片段Stx2a!重组蛋白表达方法，其特征在于步骤3)中所述的表达载体为pET-22b，宿主菌为BL21。10.根据权利要求4所述的肠出血性大肠杆菌0157:H7志贺毒素2A!亚单位活性片段Stx2ai重组蛋白表达方法，其特征在于步骤3)中得到的宿主菌BL21中导入了包含肠出血性大肠杆菌0157:H7志贺毒素2A,亚单位活性片段Stx2a,蛋白的编码核苷酸序列SEQIDNO:2的表达载体pET-22b。11.根据权利要求4所述的肠出血性大肠杆菌0157:H7志贺毒素2A:亚单位活性片段Stx2a!重组蛋白表达方法，其特征在于步骤5)中采用免疫亲和层析法纯化所述Stx2a!蛋白。12.权利要求1所述的肠出血性大肠杆菌0157:H7志贺毒素2A!亚单位活性片段Stx2a:重组蛋白在制备检测试剂盒中的应用。13.权利要求1所述的肠出血性大肠杆菌0157:H7志贺毒素"i亚单位活性片段Stx2ai重组蛋白在制备抗肠出血性大肠杆菌0157:H7感染的亚单位疫苗中的应用。全文摘要本发明公开了一种肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素2A₁亚单位活性片段Stx2a₁重组蛋白，其包括1)肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素2A₁亚单位活性片段Stx2a₁蛋白和表达载体片段；或2)肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素2A₁亚单位活性片段Stx2a₁蛋白羧基端经一个或几个氨基端缺失或添加获得的与Stx2a₁蛋白具有相似功能的蛋白和表达载体片段；本发明还公开了上述肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素2A₁亚单位活性片段Stx2a₁重组蛋白的制备方法及其在制备检测试剂盒和制备防治EHECO157:H7感染的亚单位疫苗中的应用。文档编号A61K39/108GK101240019SQ20081006939公开日2008年8月13日申请日期2008年2月27日优先权日2008年2月27日发明者璐刘,张卫军,浩曾,萍罗,邹全明申请人:中国人民解放军第三军医大学