专利名称：抗ehec o157志贺样毒素ⅱa亚单位单克隆抗体5f3轻、重链可变区基因及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物制药领域，涉及抗肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157志贺样毒素II毒素亚单位Stx2A单克隆抗体5F3重链和轻链可变区基因和多肽，以及所述基因和多肽在制备用于诊断和治疗EHEC O157感染及其并发症方面药物中的应用。
背景技术：
自EHEC O157于1982年被确认为致病菌以来，其引发的食物中毒在世界各地包括中国均发生了暴发流行。该菌的感染已经成为一个全球性的公共卫生问题，无论在发达国家还是发展中国家，都受到广泛关注。我国已将肠出血性大肠杆菌列为21世纪可能对国人卫生健康有重大影响的12种病原微生物之一。O157:H7感染可以引发严重并发症如溶血性尿毒综合征(Hemolyticuremicsyndrom，HUS)、血栓形成性血小板减少性紫癜(Thromboricthromobocytopenicporpura，TTP)，严重者可导致死亡，致死率可达5-10％。O157菌培养容易、繁殖迅速、感染力强、感染途径广泛，使之极有可能作为未来军事斗争中的细菌战剂和生物恐怖战剂。美国疾病控制中心(CDC)已将EHEC O157菌列为B类生物恐怖病原体严加防范。然而目前对其感染尚缺乏有效的治疗方法，临床上针对O157菌的感染主要采用抗生素治疗及相应的对症治疗。新近的研究发现，抗生素使菌体破裂，导致O157菌志贺毒素(Shiga toxin，ST)的释放水平大大提高，使得抗生素对病程无明显影响甚至导致病程的延长，从而可能增加发生并发症的危险并引起死亡。2002年国家卫生部制定的“肠出血性大肠杆菌O157:H7感染性腹泻应急处理预案(试行)”第5条病人的隔离治疗规定对肠出血性大肠杆菌O157:H7病人和疑似病人进行隔离治疗。病人的治疗以对症支持疗法为主，可以使用微生态制剂，原则上不用止泻药和抑制肠蠕动的药物。肠出血性大肠杆菌O157病人和疑似病人(包括粪便标本O157抗原胶体金方法检测阳性的腹泻病人)禁止使用抗生素，疫区内的其他一般腹泻病人应慎用抗生素。因此，无论从公共卫生还是生物反恐的需要出发，加强EHEC O157:H7的治疗研究已显得非常紧迫。
EHEC O157可以产生两种毒素，分别称为志贺毒素I(Stx1)和志贺毒素II(Stx2)。在细菌体内，Stx2为分泌型表达，Stx1为胞内表达。两种毒素均由1个A亚单位和5个B亚单位组成，A亚单位具有细胞内毒性，能与28SrRNA作用导致蛋白质合成停止，是大肠杆菌O157:H7引起临床表现的病理基础；B亚单位具有细胞结合特性，能与具有特定受体(Gb3)的细胞结合，从而引导A亚单位发挥作用。多数O157:H7细菌产生Stx2，Stx2比Stx1与临床上重症并发症的关系更加密切，Stx2比Stx1的毒性大1000倍。Stx2可以进入血液循环，引起目标组织器官，如肾小球和胃肠道内皮细胞的损伤。因此Stx2是该菌致病性的重要物质基础。
在HUS发生前，一般有3～5d的出血性结肠炎(HC)的前驱症状，发生HC后，在Stx结合到肾内皮细胞之前，有一段阻止Stx/Gb3结合的时间。研究证明使用能中和Stx2的特异性抗体可以预防HUS和血栓形成的血小板减少性紫癜等并发症的出现。因此实践中要求在未发生并发症之前对EHEC感染作出迅速诊断，及时使用抗体治疗。自1975年Kohler和Milstein创建B淋巴细胞杂交瘤技术以来，各种单克隆抗体相继出现，这些单克隆抗体不仅在疾病的基础研究方面发挥了积极的作用，同时也为多种疾病的诊治带来了新的希望。到目前为止，国内外尚无可用于治疗O157感染的抗体类药物，我们经过长期的大量的克隆筛选，获得了一株针对St×2A的高亲和性和高特异性的杂交瘤细胞株，其具有较高的应用价值和开发前景。
发明内容
本发明旨在提供抗志贺样毒素II(Shiga like toxin 2)毒素亚单位Stx2A单克隆抗体5F3的重链和轻链可变区基因极其编码的多肽，其重组后可表达出特异性识别和结合Stx2A的抗体活性片段。
本发明的另一目的在于所述抗体5F3的基因或多肽在制备用于诊断和治疗EHEC O157感染及其并发症方面药物中的应用。
根据本发明的一个方面，本发明涉及一种抗志贺样毒素II毒素亚单位Stx2A单克隆抗体5F3的重链和轻链可变区基因。本发明所述抗Stx2A单克隆抗体5F3的重链和轻链可变区基因是从能够稳定分泌高亲和性和高特异性的鼠源性抗Stx2A的单克隆抗体的杂交瘤细胞株5F3中克隆获得的。获得方式是从抗Stx2A的杂交瘤细胞株5F3中提取总RNA，以oligo(dT)15为随机引物，逆转录生成cDNA，然后采用通用的兼并性引物特异性分别扩增抗体轻、重链可变区基因，经过序列测定和在NCBI中BLAST比较分析后，确认5F3重链可变区核苷酸序列是序列表<400>1所示的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列是序列表<400>3所示的氨基酸序列。轻链可变区基因基因序列是序列表<400>2所示的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列是序列表<400>4所示的氨基酸序列。上述两个基因经重组后可表达出特异性识别和结合抗志贺样毒素II毒素亚单位Stx2A蛋白的抗体ScFv活性片段。
对于本发明人成功克隆的抗Stx2A特异性单克隆抗体5F3轻、重链可变区基因，分别应用专业性的已知抗体基因序列数据库(IMGT)和(NCBI)对所得序列进行同源性比较和其胚系基因来源分析表明，所获得的基因序列的确来自小鼠胚系基因，和现有报道的各种抗体基因序列均不完全一致。所得VH与VL基因可编码正确的小鼠抗体可变区。
根据本发明的另一个方面，本发明还涉及所述单克隆抗体5F3的基因及其编码的多肽在制备用于诊断和治疗EHEC O157感染及其并发症方面药物中的应用。
本发明人采用通用的兼并性引物成功地从培养的一株抗Stx2A特异性单克隆抗体5F3的杂交瘤细胞株中克隆了其对应抗体轻、重链可变区基因。基于上述的单克隆抗体5F3的轻、重链可变区基因，可以采用基因工程方法，构建和表达多种形式的小分子基因工程抗体，如ScFv抗体、嵌合抗体、抗体融合蛋白等，制备用于诊断和治疗EHEC O157感染及其并发症方面药物，将对诊断和治疗EHEC O157感染及其并发症提供新的途径。
图1为从抗Stx2A的杂交瘤细胞株5F3中提取总RNA的琼脂糖凝胶电泳图。
图2为5F3中提取总RNA逆转录生成cDNA的琼脂糖凝胶电泳图。
图3为PCR扩增的抗Stx2A单克隆抗体5F3轻、重链可变区基因的琼脂糖凝胶电泳图。
图4为PCR扩增的抗Stx2A单克隆抗体5F3轻、重链可变区基因藉LinkerDNA连接后琼脂糖凝胶电泳图。
图5为利用获得的5F3轻、重链可变区基因所构建的ScFv抗体表达载体的测序图谱。
图6为Western blot检测ScFv抗体与抗原结合。
具体实施方案1.鼠抗Stx2A单克隆抗体的制备2.抗Stx2A单克隆抗体5F3轻、重链可变区基因的克隆从抗Stx2A杂交瘤细胞株5F3中提取总RNA，以oligo(dT)15为随机引，RT-PCR逆转录生成cDNA，然后采用通用的兼并性引物特异性分别扩增抗体轻、重链可变区基因。
3.抗Stx2A单克隆抗体5F3的ScFv形式抗体的构建、表达和纯化将抗体轻、重链可变区基因用一编码(G4S)3短肽的DNA片段连接成5’VH-Linker-VL3’片段，PCR扩增该片段。纯化后的ScFv片段与已改造的载体pCANTAB6His相连，转化大肠杆菌HB2151。IPTG诱导表达，采用固相镍离子亲和层析对ScFv进行初步纯化。
4.抗Stx2A单克隆抗体5F3轻、重链可变区基因及其编码的多肽在制备用于诊断和治疗EHEC O157感染及其并发症方面药物中的应用实施例1抗肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157志贺样毒素II毒素亚单位Stx2A单克隆抗体的制备1.免疫Balb/c小鼠目的蛋白Stx2A经过纯化后免疫Balb/c小鼠(鼠龄6～8周)，100ug/只，首次免疫，100μL抗原与等量完全福氏佐剂混合，注射小鼠腹部和腹股沟皮下免疫。14d后再次免疫，免疫剂量和途径同首次免疫，采用不完全福氏佐剂。于第28d追加免疫，150ug/只，腹腔注射。
2.杂交瘤细胞的制备1)收集B淋巴细胞追加免疫后3天，摘除小鼠眼球放血，血清留作阳性对照。无菌操作取出脾脏，并将脾脏放在10ml预温不完全培养基中，剥去周围结缔组织，置100目不锈钢网中，用注射器的内芯研磨，边研磨边滴加不完全培养基冲洗。收集过滤后的细胞悬液于离心管中，计数，取1×108个细胞，离心，弃上清，置室温待用。
2)小鼠骨髓瘤细胞的准备融合前10天，将骨髓瘤细胞从液氮中取出，迅速放入37℃水浴中，不断摇晃，直至冷冻液完全溶解。离心，弃上清，悬浮于8-AG培养基中置37℃，5％CO2培养箱中培养。根据细胞生长状况，换液，丢弃一部分细胞。融合前2～3天，将一瓶细胞传至4瓶，并改用完全培养基继续培养。
3)滋养细胞的准备；取一只6～8周龄的健康BALB/c小鼠，脱臼处死。按无菌操作规程，剪开皮肤(注意不要剪破腹膜)，用一次性的5ml注射器吸取5ml不完全培养基，注入小鼠腹腔，用无菌棉球轻揉腹部，慢慢抽回，如此反复两次。吸出的细胞悬液置于离心管中，离心，弃上清。加入20ml HAT培养基，混匀，接种至两块96孔细胞培养板，100μl/孔。置37℃，5％CO2培养箱培养过夜，若滋养细胞贴壁良好且无污染，即可用于接种融合细胞。
4)细胞融合融合前一天将PEG/DMSO放于CO2培养箱中调整pH值和温度。将准备好的骨髓瘤细胞和脾脏B淋巴细胞移至一个50ml离心管中，加30ml不完全培养基，离心，吸去上清。将离心管放在掌心摇动，使细胞团成松散的糊状。将离心管置于37℃水浴中，吸取0.7ml预温的PEG/DMSO溶液，在离管底约2cm处沿管壁慢慢加入细胞中，边加边转动离心管，1min加完。静置1min，再吸取25ml不完全培养基，缓慢加入。边加边缓慢搅拌，先慢后快，前2min加入2ml，后2min加入剩余的培养基。离心，吸去上清。将细胞团摇散，加入10ml HAT培养基，轻轻吹打，混匀。将融合细胞接种至已铺有饲养细胞的96孔细胞培养板，100μl/孔，置37℃，5％CO2培养箱中培养。
5)杂交瘤细胞的选择性培养接种后第一天，加入HAT培养基100μl/孔，在第2，3，5，8和11天，各孔吸出半量培养上清，然后再加入新鲜HAT培养基100μl/孔。同时镜下观察细胞克隆生长情况。
6)杂交瘤细胞的筛选融合后2周，ELISA法检测各细胞培养孔上清液，方法同血清抗体检测。筛选分泌目的抗体的阳性细胞克隆，以进行克隆化。
7)阳性杂交瘤细胞的克隆化筛选出阳性克隆后，收集细胞并计数，用不完全培养基按105、104、103、102对细胞作系列稀释，然后取后者用HT培养基稀释至10个/ml。取一块96孔细胞培养板，预先按每孔105～106个/100μl HT培养基加好滋养细胞，然后加入10个/ml的细胞悬液，100μl/孔。置37℃，5％CO2培养箱培养7～10天。在第2天和第5天分别加入HT培养基2滴/孔，并在倒置显微镜下观察细胞生长情况，对确为只有一个细胞克隆生长的孔作好标记。对抗体阳性的单克隆细胞，经3～4次单细胞分离培养，直至抗体阳性的单克隆细胞培养孔达到100％，即可初步定株并命名。
实施例2抗Stx2A单克隆抗体5F3轻、重链可变区基因的克隆1.所用细胞株为本发明人采用上述方法获得的一株高亲和力、高特异性的抗Stx2A单克隆抗体5F3杂交瘤细胞株，其分泌的抗体不与CT、LT等多种大肠杆菌肠毒素抗原结合，其分泌的抗体分子亚型为IgG1k。
2.取对数生长期的5F3杂交瘤细胞(2×106)，采用异硫氰酸胍一步法(TaKaRa公司)提取总RNA，取少量进行紫外分光光度计定量及1％琼脂糖凝胶电泳检测。随后以oligo(dT)15(TaKaRa公司)为随机引物，逆转录生成cDNA。然后采用通用的兼并性引物(Amersham公司)特异性分别扩增单抗5F3的轻、重链可变区基因。将含有可变区基因(VH，VL)的扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，切胶分离目的片段。通过胶回收试剂盒(Promega公司)纯化目的片段后，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，参见附图1-3。之后，将抗体轻、重链可变区基因克隆至pMD-18T载体，测序分析。
有关操作具体步骤如下1.总RNA提取(使用TaKaRa公司RNA提取试剂盒)1)取2×106杂交瘤细胞，加入1ml的Catrimox-14TM溶液，充分混匀。离心，3000rpm，5min。
2)除去溶液，加入1ml的DEPC处理H2O，上下颠倒混合数次后，离心，12,000rpm，2min。
3)除去溶液，激烈振荡使沉淀松动，加入1ml的2M LiCl溶液，激烈振荡后，离心，12,000rpm，5min。
4)除去溶液，沉淀用70％的冷乙醇洗一次，溶于1ml的DEPC处理H2O中。
2.RT-PCR扩增VH和VL1)以提取的总RNA为模板，oligo(dT)15(TaKaRa公司)为随机引物，反转录合成cDNA第一链的方案如下总RNA 2μl10×RT-PCR缓冲液 1μldNTPs(10mmol/L) 1μlMgCl2(0.025mmol/L) 4μloligo(dT)15 Primer(2.5pmol/μl) 0.5μlAMV Reverse Transcriptase(5U/μl) 0.5μlRNase Inhibitor(40U/μl) 25μlRNase Free dH2O至终体积11μl，混合后加入石蜡油3滴。
反应条件30℃，1min；42℃，0.5min；99℃，5min；5℃，5min；1个循环周期。
2)以第一链为模板采用如下PCR体系和程序扩增VH和VL模板cDNA 11μl5×PCR缓冲液(含氯化镁) 10μl轻、重链引物(0.025mmol/L)各 1μlEx Taq HS(5u/μl) 0.25μl加去离子水至终体积50μl，混合后加入矿物油3滴。
反应条件94℃预变性2min后，94℃，0.5min；55℃，0.5min；72℃，1min；30个循环周期。
3.PCR产物的克隆采用TA克隆方法克隆PCR产物，方法见文献(于永利，麻彤辉，杨贵贞TA克隆及双链DNA测序，介绍一种快速克隆及分析PCR产物的方法，中国免疫学杂志，1994，10(1)5)。
4.PCR产物的序列分析将TA克隆转化菌株送至公司，按常规方法(J.Sambrook，Polyacrylamide gel electrophoresis1.21-1.32，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Molecular cloning，1989)提取质粒，采用双脱氧末端终止法，对插入片段进行序列测定。测序结果参见附图5。
进一步对所克隆的抗Stx2A单克隆抗体5F3轻、重链可变区基因进行序列分析如下
分别应用下列二个数据库http://imgt.cines.fr:8104/cgi-bin/IMGTnap.jvhttp://www.ncbi.nim.nih.gov/blast/Blast.cgi对所得序列与现有已报道的其它各种抗体基因进行同源性比较，并分析其胚系基因来源，结果如下1)5F3重链的胚系基因来源V-GENEAF304558 IGHVlS137*01；D-GENEIGHD-SP2.8*01；J-GENEIGHJ4*01；通过FR-IGMT and CDR-IGMT分析显示CDR1GGT TGC TAC ATG CACCDR2TAT ATT AGT TGT TAC AAT GGT GCT ACT AGC TAC AAC CAG AAG TTCAAG GGC AAGCDR3AAG GGC TAC GGT AGT AGT CAT TAC TAT GCT ATG GAC TACNCBI中同源性比较结果显示Request ID 1132707495-31830-19491971776.BLASTQ1Sequence producing significant alinmentsgi|11611970|gb|AF303832.1|AF303832 540 1e-150gi|38348519|ref|NM_198640.1| 433 3e-118gi|430841|gb|S66092.1| 408 1e-1102)5F3轻链的胚系基因来源V-GENEAJ235950 IGKV12-89*01；J-GENEV00777 IGKJ2*01；通过FR-IGMT and CDR-IGMT分析显示CDR1AGG GCC AGC CAA AGT ATT AGC AAC AAC CTACDR2TAT GCT TCC CAG TCC ATC TCTCDR3CAA CAG AGT AAC AGC TGG CCT CTC ACGNCBI中同源性比较结果显示Request ID Request ID 1132709610-9086-134297927386.BLASTQ4DatabaseALL GenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences(but no EST，STS，GSS，or phase0，1or2 HTGS sequences)
gi|7529622|emb|AJ277215.1|MMU2772154e-164 585gi|63543416|ref|XM_620323.1| 9e-143 514gi|809057|emb|X86544.1|MMVL1B101e-112 414上述分析结果表明所获得的抗Stx2A单克隆抗体5F3基因序列的确来自小鼠胚系基因，和现有报道的各种其它己知抗体基因序列均不完全一致，是属于一种新的有功能的针对Stx2A的抗体基因。
实施例3抗Stx2A单克隆抗体的ScFv形式抗体的构建和表达(使用Pharmacia公司ScFv表达试剂盒)将VH、VL和Linker(G4S)3引物等摩尔混合后，进行聚合和填充反应，使VH和VL藉LinkerDNA连接到一起，形成ScFvDNA。然后加入限制酶切位点引物，扩增聚合的ScFv并在5′端引入Sfi I限制酶切位点，3′端引入Not I限制酶切位点。克隆至改造的分泌性表达载体pCANTAB6His之中，转化到大肠杆菌HB2151中进行诱导表达。经限制性酶切鉴定及DNA测序分析，证实基因构建正确。亲和层析纯化表达蛋白后以SDS-PAGE电泳、Westem-blot等方法分析检测表达产物，参见附图6。SDS-PAGE电泳和Western-blot分析表明ScFv基因在大肠杆菌中成功表达。表达产物的相对分子质量(Mr)为27KD，与理论预期值相符，并且可与相应的抗原特异结合，成功实现了抗Stx2单链抗体的原核分泌表达，为其在诊断和治疗EHEC O157感染及其并发症中的进一步应用奠定了基础。
有关操作具体步骤如下1.质粒DNA抽提(使用Omega公司质粒抽提试剂盒)1)挑取平板上分隔良好的菌落转种于带相应抗生素的LB培养液中，37℃摇床培养过夜。
2)取菌液分装于1.5mL离心管中，12000g离心3min，留取沉淀。
3)每管加100μL Solution I悬浮，充分振荡混匀。
4)加入100μL Solution II，轻柔混匀，冰水浴5min。
5)加入250μL Solution III，轻振混匀，室温放置10min。
6)4℃、12000g离心10min，将上清移至分离管中。
7)12000g离心1min，倾倒收集管中的废液。
8)加入500μL washing buffer于分离管中，同上离心并弃去收集管中的废液。重复洗涤一次。
9)12000g离心1min，使乙醇完全挥发。
10)将分离管置于另一干净EP管中并加入一定量的TE buffer，65℃水浴5min，12000g离心1min。
11)取一定量洗脱液进行电泳，其余置于-20℃保存备用。
2.琼脂糖凝胶电泳1.0％琼脂糖凝胶，1×TAE缓冲液，120-150mA，电泳20-40分钟。
50×TAE储存液配方2.0mol/L Tris base，1.0mol/L NaAc，0.1mol/L Na2EDTA；用冰醋酸调节pH8.3。
3.质粒DNA的酶切反应1)1μg质粒DNA1μL 10×M缓冲液(见Takara公司产品说明书)1μL 限制性内切酶Sfi I(10u/μL)用双蒸水补齐至10μL反应条件50℃反应4h。
1)在上述反应体系内依次加入2μL 10×H缓冲液(见Takara公司产品说明书)1μL 限制性内切酶NotI(10u/μL)用双蒸水补齐至20μL反应条件37℃反应4h。
4.琼脂糖电泳胶的目的DNA回收纯化(Promega公司)在紫外灯下观察并切下琼脂糖凝胶上的目的DNA电泳带，移入1.5mL EP管。加入Omega公司胶回收试剂盒的DNA binding buffer，65℃水浴使凝胶完全溶化并保持溶液pH在5.0～6.0之间。将溶胶液移入分离管，12000g离心1min，弃去收集管中的液体。加入配套的Washing buffer，12000g离心1min，弃去收集管中的液体。重复洗涤1次。12000g离心1min，分离管移置另一干净1.5mL EP管，加入一定体积的TE buffer，65℃孵育10min，12000g离心1min，取一定量电泳，UVP紫外扫描仪检测回收纯化效果。
5.连接反应(使用Takara公司连接试剂盒)通过紫外分光光度计检测目的DNA片段和载体片段的浓度，根据外源片段与载体摩尔数比一般为1∶2～10的原则，设计连接反应体系如下目的DNA 1μL质粒载体 1～2μLligation solution 5μLddH2O 2～3μLTotal volume 10μL
16℃连接12-16h。
6.感受态菌的制备(CaCl2法)1)无菌接种环蘸取-70℃冻存的细菌保种液，三线法划线接种于LB平板，37℃培养12～16小时。
2)挑取单个菌落接种于2mL LB培养液中，37℃摇床培养12～16h。
3)将过夜培养的DH5a按1％比例转种至LB培养液中，37℃摇床培养至OD600为0.2～0.4时，8000g离心5min收集细菌。
4)加入1mL预冷的0.1M CaCl2重悬沉淀，冰水浴3h。4℃8000g离心5min，弃上清。加入100μL预冷的0.1M CaCl2悬浮沉淀，冰水浴1h，备用。
7.连接产物转化1)取感受态菌液100μL，加入连接反应产物；冰水浴60min，42℃水浴热休克100s，迅速放置冰水浴1～2min。
20加100μL LB培养液，37℃摇床培养1h。
3)以8000g离心10min，吸弃100μL上清后混匀沉淀，各取50μL涂布平板，37℃孵箱培养过夜。
2.高效表达融合蛋白工程菌的构建及筛选将含ScFv基因的重组质粒pCANTAB6His转化大肠杆菌HB2151并提取质粒酶切鉴定。基因工程大肠杆菌HB2151的感受态菌制备、转化及重组菌的质粒抽提酶切鉴定同前。
取鉴定无误的重组菌接种于3mL含Amp的LB培养液中，30℃摇床培养过夜。次日将过夜培养的重组工程菌按1％的比例转种于20mL含Amp的LB培养液中，30℃摇床培养2.5小时，以IPTG诱导24h，SDS-PAGE检测融合蛋白的表达形式和表达量，筛选高效表达菌株。
实施例4抗Stx2A单克隆抗体5F3轻、重链可变区基因及其编码的多肽在制备用于诊断和治疗EHEC O157感染及其并发症方面药物中的应用。
1.以本发明所述的轻、重链可变基因出发，可以重构并表达多种形式的抗体药物，可以直接用于诊断和治疗EHEC O157感染及其并发症。例如1)嵌合抗体是用鼠单抗的V区与人IgG的C区连接而成为人-鼠嵌合抗体。由于其完整地保留了鼠单抗的特异性和亲和力，同时降低了HAMA等不良反应。
2)人源化抗体是针对可变区基因结构的人源化改造，包括CDR移植、表面氨基酸残基修饰、骨架区交换、定位保留和表位导向选择等从而降低了可变区的鼠源性同时又保持了鼠单抗的特异性和亲和力。
3)小分子抗体主要有VH-CH1和VL-C1组成Fab抗体、用一多肽(Gly4Ser)3接头连接VH基因和VL基因而成的单链抗体、由VH基因和VL基因以非共价键结合而成Fv片段抗体、由VH或VL一个功能结构域组成的单域抗体、由单个CDR构成的最小识别单位等。
多价微型抗体主要有双链抗体、(ScFv)2、(ScFv)4等。由于有多价抗原结合位点，亲和力高，分子大小适中等特点而具有较高的临床应用价值。
5)双特异性抗体是一类具有双重特异性和双重功能的抗体，又称双功能抗体。
6)重组抗体融合蛋白把ScFv基因片段，与非抗体的毒素或酶等其它蛋白基因连接形成的具有特定的生物活性导向靶部位的一种重组蛋白。
7)噬菌体抗体把Ig的V区基因与丝状噬菌体DNA上基因III或基因VIII连接转染宿主菌后，使其在膜表面外壳蛋白表达ScFv的融合蛋白产物。通过对此产物多轮相关抗原的亲和吸附，从中淘选出所需的更高亲和力及更特异性的新抗体。
2.以本发明所述的抗Stx2A单克隆抗体5F3，可以用于1)O157菌超声上清攻毒-抗Stx2A单克隆抗体5F3中和保护实验以致死剂量(LD100)的O157菌超声上清液(总蛋白0.05mg)注入小鼠腹腔，同时每组动物经腹腔注射给予如下所示不同剂量的抗体中和液，对照组每只小鼠给予10mmol/L PBS，最后每只小鼠注射的总液体量为0.5ml，动物分组如表1。观察各组小鼠的死亡情况，在10天的观察期后计算小鼠的死亡/生存率如表2。
表1
表2 O157菌超声上清攻毒-抗Stx2A单克隆抗体5F3中和保护效果
结果显示0.15mg纯化后的抗Stx2A单克隆抗体5F3对攻毒小鼠的中和保护率达到80％。
结论抗Stx2A单克隆抗体5F3可针对O157菌超声上清毒素攻毒小鼠产生有效中和保护作用。
2)肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157志贺样毒素相关抗原的基础研究，或用于发现新的志贺样毒素相关抗原或已知志贺样毒素抗原的新表位。这些抗原均可进一步用于临床血清学检查，具有一定的临床诊断意义。
3)由于单克隆抗体有同抗原特异结合的特性，可以对相应抗原进行分离纯化。现有的方法从EHEC O157野生菌株中提纯天然志贺样毒素，存在方法烦琐、得率低等缺陷。可将抗Stx2A单克隆抗体5F3直接连于固相载体上，以亲和层析方法对志贺样毒素Stx2A进行有效的分离和纯化。
序列表<110>中国人民解放军第三军医大学<120>抗EHEC O157志贺样毒素II毒素亚单位单克隆抗体5F3轻、重链可变区基因及应用<160>4<210>1<211>378<212>DNA<213>鼠<220>
<221>V-region<222>(1)...(378)
<400>1CCAGCCATGG CCCAGGTCCA ACTGCAGCAG TCAGGACCTG AGCTAGTGAA GACTGGGGCT 60TCAGTGAAGG TATCCTGCAA GGCTTCTGGT TACTCATTCA CTGGTTGCTA CATGCACTGG120GTCAAGCAGA GCCATGGAAA GAGCCTTGAG TGGATTGGAT ATATTAGTTG TTACAATGGT180GCTACTAGCT ACAACCAGAA GTTCAAGGGC AAGGCCACAT TTACTGTAGA CACATCCTCC240AGCACAGCCT ACATGCAGTT CAACAGCCTG ACATCTGAAG ACTCTGCGGT CTATTACTGT300GCAAGAAAGG GCTACGGTAG TAGTCATTAC TATGCTATGG ACTACTGGGG CCAAGGGACC360ACGGTCACCG TCTCCTCA 378<210>2<211>376<212>PRT<213>鼠<220>
<221>V-region<222>(1)...(126)<400>2Pro Ala Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu1 5 10 15Val Lys Thr Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly20 25 30Thr Ser Phe Thr Gly Cys Thr Met His Trp Val Lys Gln Ser His35 40 45Gly Lys Ser Leu Glu Trp Iie Gly Tyr Iie Ser Cys Tyr Asn Gly50 55 60Ala Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thy65 70 75Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Phe Asn Ser Leu80 85 90Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Lys Gly Tyr95 100 105Gly Ser Ser His Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
110 115 120Thr Val Thr Val Ser Ser125<210>3<211>327<212>DNA<213>鼠<220>
<221>V-region<222>(1)...(327)<400>3GACATCGAGC TCACTCAGTC TCCAGCCACC CTGTCTGTGA CTCCAGGAGA TAGCGTCAGT 60CTTTCCTGCA GGGCCAGCCA AAGTATTAGC AACAACCTAC ACTGGTATCA ACAAAAATCA120CATGAGTCTC CAAGGCTTCT CATCAAGTAT GCTTCCCAGT CCATCTCTGG GATCCCCTCC180AGGTTCAGTG GCAGTGGATC AGGGACAGAT TTCACTCTCA GTATCAACAG TGTGGAGACT240GAAGATTTTG GAATGTATTT CTGTCAACAG AGTAACAGCT GGCCTCTCAC GTTCGGTGCT300GGGACCAAGC TGGAGCTGAA ACGGGCG327<210>4<211>109<212>PRT<213>鼠<220>
<221>V-region<222>(1)...(109)
<400>4Asp Iie Glu Leu Tyr Gln Ser Pro Ala Tyr Leu Ser Val Tyr Pro1 5 10 15Gly Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Iie Ser20 25 30Asn Asn Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg35 40 45Leu Leu Iie Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Iie Ser Gly Iie Pro Ser50 55 60Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Iie65 70 75Asn Ser Val Glu Thr Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln80 85 90Ser Asn Ser Trp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu95 100 105Leu Lys Arg Ala
权利要求
1.抗EHEC O157志贺样毒素II毒素亚单位Stx2A单克隆抗体5F3的重链可变区基因和轻链可变区基因，其基因序列是序列表1和序列表3所示的核苷酸序列。
2.权利要求1所述的基因编码的多肽，其具有序列表2和序列4所示的氨基酸序列。
3.权利要求1所述的基因在制备用于诊断或治疗EHEC O157感染及其并发症方面药物中的应用。
4.权利要求2所述的多肽在制备用于诊断或治疗EHEC O157感染及其并发症方面药物中的应用。
全文摘要
本发明属生物制药领域，涉及抗肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157志贺样毒素II毒素亚单位Stx2A单克隆抗体5F3重链和轻链可变区基因及其所述基因编码的多肽，以及所述基因和多肽在制备用于诊断和治疗EHEC O157感染及其并发症方面药物中的应用。本发明人采用通用的兼并性引物成功地从培养的一株抗Stx2A特异性单克隆抗体5F3的杂交瘤细胞株中克隆了其对应抗体轻、重链可变区基因。基于上述的单克隆抗体5F3的轻、重链可变区基因，可以采用基因工程方法，构建和表达多种形式的小分子基因工程抗体，如ScFv抗体、嵌合抗体、抗体融合蛋白等，制备用于诊断和治疗EHEC O157感染及其并发症方面药物，将对诊断和治疗EHEC O157感染及其并发症提供新的途径。
文档编号A61K39/395GK1847397SQ200610054048
公开日2006年10月18日 申请日期2006年1月20日 优先权日2006年1月20日
发明者邹全明, 马颖, 毛旭虎, 杨珺 申请人:中国人民解放军第三军医大学