热易变肠毒素和霍乱毒素b亚基之间的杂合分子的制作方法

专利名称：：热易变肠毒素和霍乱毒素b亚基之间的杂合分子的制作方法
技术领域：
：本发明涉及热易变肠毒素B亚基(LTB)和霍乱毒素B亚基(CTB)之间的杂合分子。包含该杂合分子的免疫原性蛋白，任选与细胞或病毒的免疫反应性氨基酸序列融合，可用作疫苗中的免疫原性成份，例如抗肠毒素引起的腹泻的广谱疫苗。背景霍乱在许多发展中国家仍是一种重要的病因，且估计每年导致超过200,000人死亡。被肠毒性大肠杆菌(ETEC)感染是发展中国家和旅游者中最常见的腹泻病因，每年它引起超过1亿的腹泻病例且一百万人死亡。被ETEC感染也是动物中的重要病因。对于霍乱和ETEC感染都迫切需要有效的疫苗。在霍乱和ETEC感染中，腹泻的首要原因是肠道中感染的生物释放的肠毒素的作用，在霍乱中是霍乱毒素(CT)，在ETEC中是热易变肠毒素(LT)。两个毒素在结构上和功能上均密切相关，均由毒性A亚基(分别是CTA或LTA)被5个相同的B亚基(分别是CTB或LTB)(Spangler，1992)包围组成。B亚基5聚体负责将毒素结合到存在于肠上皮细胞表面的GM1神经节苷脂受体上(Holmgren，1981)；LT也能结合到结构上相关的半乳糖蛋白受体上(Holmgren和Fredman等1982)。尽管2种蛋白质在一些氨基酸残基上表现出内部变异，例如在人类与动物ETEC分离物中及在典型性与ElT或生物型霍乱菌株中，LTB和CTB显示出高度同源性，在成熟蛋白质中具有85％的氨基酸保守(图1)，晶体学研究的证据表明LTB和CTB五聚体也在结构上相似(Sixma和Pronk等，1991，Sixma和Kalk等，993，Merritt和Sarfaty等，1994)。尽管大多数抗体针对组装的五聚体的结构特征，但在2个分子间也具有高度的免疫学交叉反应性(Svennerhdm和Wickstrm等，1986)，这进一步表明了两个分子间的结构相似性。已发现CT是一种有效的口服免疫原，它产生主要针对B亚基的肠IgA反应。而且，口服施用单独的CTB也发现有效地刺激相似的反应，特别是在人类，已发现CTB在缺乏佐剂或全毒素毒性效应的条件下是一种强免疫原。这些反应与高水平相关，尽管对霍乱弧菌的攻击或自然感染具有相当短期(约6-9个月)的保护和持续更长时间的免疫学记忆(Svennerholm和Sack等，1982，Svennerholm和Gothefors，等，1984，Svennerholm和Jerrborn等，1984，Clemens和Sack等，1990，Quiding和Nordstrom等，1991)。抗毒素抗体在其保护性作用中似乎与针对细菌的细胞相联性抗原如霍乱弧菌Ol(Svennerholm和Holmgren，1976)或新血清型O139(JHolmgren等，未公开)的脂多糖(LPS)的肠IgA抗体协同作用。根据这些发现，已形成抗霍乱的口服疫苗，由CTB和杀死的霍乱弧菌O1的细胞组成(Holmgren和Svennerholm，等，1992)，它产生持续几年的保护(Clernens和Sack等，1990)并且目前被改良成也包括O139血清型的细胞B亚基-O1全细胞疫苗在Bangladesh的大量野外试验证实，除了对霍乱观察到的长期保护外，还观察到由于CTB成分而对ETEC感染的明显的短期交叉保护(Clemens和Sack，等，1988(a))。由霍乱疫苗引起的对ETEC的保护随后在对到摩洛哥的芬兰旅游者的研究中得以证实(Peltola和Siitonen，等。1991)。根据这些结果，已形成了一种更广谱的抗ETEC的疫苗，其中CTB与表达涉及附着于肠上皮的主要定居因子抗原的杀死的大肠杆菌结合使用(Svennerholm和Arhen，等，1991)。为了提供对单独或与LT一起释放热稳定性肠毒素(STa)的ETEC菌株的免疫性而包括大肠杆菌菌株。在霍乱和ETEC均是地方性流行病的地区，需要一种单一的疫苗对两种感染都提供有效的保护。这可通过增强由已许可的霍乱疫苗CTB成分提供的对ETEC的保护来部分实现。尽管LTB和CTB显示出明显的免疫学交叉反应，以CTB免疫的个体的血清中的LT不如以相同血清中和CT一样有效(Ahren和Wenneras等，1993)。相反，已知抗LT或LTB的抗血清与LT比与CT以更高的滴度反应(Svennerholm和Holmgren等，1983)。因此可能LTB中的一些中和抗原决定簇在CTB中缺乏且反之亦然。经过签定LTB特异性中和抗体进一步证实了这点(Svennerholm和Wickstrrn等，1986)。在霍乱和ETEC疫苗中均包含CTB导致形成能以大量且完全缺乏毒性CTA亚基的方式生产的重组蛋白质的过度生产的表达系统(Sanchez和Holmgren，1989，Lebens和Johansson，等，1993)。这也为生产携带外源肽抗原的蛋白质融合物前遗传修饰CTB的相当简单的方法开辟了一条道路。本发明基于经定点诱变编码CTB的结构基因进行的修饰、导致产生杂合蛋白质，其中LTB特异性的抗原决定簇导入基本上保留CTB的蛋白质中，从而产生的该杂合分子除了交叉反应的和CTB特异性的抗原决定簇外还携带LTB特异性的抗原决定簇，以便增强免疫交叉反应性。为了提供预防或治疗肠毒性疾病的广谱疫苗而形成了这种杂合的CTB/LTB分子。本发明的描述一方面，本发明涉及热易变性肠毒素B亚基(LTB)和霍乱毒素B亚基(CTB)之间的杂合分子，该分子包含由成熟CTB的氨基酸序列组成的氨基酸序列，其中该氨基酸残基被成熟LTB的相应氨基酸残基取代，它将LTB特异性的抗原决定基特征传递给所说的免疫原性成熟CTB，或反之亦然。因此，所说的杂合分子可选择包含由成熟LTB氨基酸序列组成的氨基酸序列，其中该氨基酸残基被成熟CTB的相应氨基酸残基取代，它将CTB特异性的表位特征传递给所说的免疫原性成熟LTB。在优选的实施方案中，本发明所说的杂交分子具有由成熟CTB的氨基酸序列组成的氨基酸序列，其中第1、94和95位的氨基酸残基被LB的相应氨基酸残基取代。在另一优选的实施方案中，本发明所说的杂交分子具有由成熟CTB的氨基酸序列组成的氨基酸序列，其中在第1-25位的氨基酸残基被LTB的相应氨基酸残基取代。在图1中描述了成熟CTB和成熟LTB的氨基酸序列，且以氨基酸+1开始。相应的结构基因在同一附图中描述。本发明的另一方面涉及编码根据本发明的杂合分子的结构基因。另外，本发明涉及含有该结构基因的质粒。本发明还有一个方面涉及包含根据本发明的杂合分子的免疫原性蛋白质。在本发明该方面的一个实施方案中，所说的免疫原性蛋白质是本发明所说的杂合分子的融合蛋白和原核或真核细胞或病毒的或来自它们的免疫反应性氨基酸序列。本发明还有一个方面涉及包含根据本发明的免疫学有效量的免疫原性蛋白质作为免疫成分的疫苗。优选所说的疫苗抗肠毒素诱导的疾病，如腹泻。本发明的B亚基杂合体试图用于预防或治疗个体中(动物或人类)肠毒素引起的疾病的方法中，包含给所说的个体施用免疫学上有效量的根据本发明的免疫原性蛋白质。附图描述图1人ETEC分离物(Leong等，1985)的LTB和CTB(M.Lebens，未公开)的序列的比较。对于导致氨基酸改变的差异，LTB相应位置的残基在上面DNA序列中给出。CTB氨基酸序列下的数字表示成熟CTB和LTB蛋白质中氨基酸残基的位置。图2编码CTB/LTB杂合体的质粒。在两个质粒中，来自ctxB的基因从tac启动子中表达。a)由基因插入产生的pML-LCTBtacA，其中来自pML-LCTBtacl(21)的Sacl/Accl片段被编码LTB前25个氨基酸的合成寡核苷酸取代。ctxB基因的剩余部分未改变。该质粒携带LTB信号肽和核糖体结合序列。b)以PCR定向诱变从pML-CTBtac产生pML-LCTBtacB，其中，导入单个EcoRl位点，且位置94和95的氨基酸改变成相应于LTB的相同位置。该质粒携带CTB信号肽和λcll核糖体结合序列。改变的序列在盒中显示。仅描述了杂合基因相关区域的序列图3与用rCTB、rLTB或CTB/LTB杂合蛋白质LCTBA(A)或LCTBB(B)之一腹膜内免疫应答的3次免疫中每一次之后(1、2和3组)分别产生的抗体。滴度是两只小鼠的平均值，且以材料和方法所述的GMl-ELISA测定。图4.用CTB对以rCTB、rLTB或CTB/LTB杂合蛋白LCTBA或LCTBB之一三次免疫后获得的小鼠血清中CTB-和LTB反应性抗体滴度的吸附影响。本发明的杂合CTB/LTB分子的制备本发明的杂合CTB/LTB分子可根据本领域生产肽和蛋白质的任何已知方法制备，如遗传工程和/或肽合成方法，例如，根据Merrifield的方法。为了说明该分子的制备，本发明的两个杂合CTB/LTB分子按如下制备。杂合CTB/LTB分子的生产用于本发明的两个杂合毒素基因从两个不同的CTB表达载体生产。首先，经过将合成寡核苷酸插入ctxB基因内的合适限制性位点之间完成修饰，其次，经过使用特异性引物按前面所述对完整的质粒进行PCR扩增产生突变(Schdel和Milich等，1991)。两个所得的质粒是pML-LCTBtacA和pML-LCTBtacB，它们携带修饰的ctxB基因，经DNA测序证实了其序列且在图2中表示。pML-LCTBtacA表达的杂合蛋白LCTBA在其前25个氨基酸与LTB相同，其后与CTB相同。由pMLLCTBtacB表达的杂合蛋白命名为LCTBB且在相应于LTB的位置1、94和95改变，其它与典型的O1霍乱弧菌菌株395的天然CTB相同。杂合蛋白质在霍乱弧菌菌株JS1569中表达导致该产物在生长培养基中积累，以六偏磷酸沉淀接着经HPLC可从培养基中纯化该蛋白质。根据SDSPAGE该蛋白质如果是LCTBA似乎与对照CTB蛋白质相同，如果是LCTBB，其泳动更象LTB、特别是以单体的形式。CTB/LTB杂合分子的抗原性分析两种杂合蛋白质以携带各自表达载体的霍乱弧菌的生长培养基中部分纯化并进行各种不同的分析以测定与天然CTB和LTB相比较的其抗原特性。用不同CTB或LTB特异性的抗体以GM1-ELISA滴定开始浓度固定的不同蛋白质。该方法可测量GM1受体和不同检测抗体之一或两者的亲合力差异，以前我们已显示不同蛋白质同样地结合GM1，因此这些差异是抗体特异性的(结果未显示)。这些结果在表1中显示。可见对一定范围的两种单克隆抗体和吸附的多克隆抗血清获得的滴度图形可区分杂合分子和天然蛋白质。结果表明杂合蛋白的LCTBA获得了能被根据与单克隆抗体的反应识别的LTB特异性表位，被LTB特异性单克隆抗体LT338和LT807识别的显著的抗原决定簇。然而，它还与CTB特异性的抗体CTWi反应。在western印迹中也证实了这一点。对于LCTBB，使用的单克隆抗体没有证实在杂合分子的抗原性中有区别。对此有2个可能的解释，一个是用更大范围的抗体筛选需要在分子中有相当小的数量的变化以便发现对特定抗决定基表现出亲和力的抗体。另外，基于MG1-ELISA的试验不能检测隐藏在GM1结合位点内的分子区域的改变。用杂合蛋白免疫产生交叉反应的抗血清用LTB，CTB或不同的杂合分子之一免疫后，分析所得的抗血清抗LTB和CTB的总抗体水平，随后分析LTB特异性的抗体水平。图3显示了3次免疫的每次免疫之后的抗CTB和LTB的抗体水平。首次免疫前在任何试验的小鼠中没有可检测到的抗任一B亚基的滴度。如果是CTB和两种杂交蛋白质，抗CTB的滴度一致比抗LTB的更高。在用LTB免疫的小鼠中，情况相反。在用CTB或LCTBB杂合分子免疫的小鼠中，第一次和第二次免疫后获得的抗CTB和LTB的相对滴度间没有明显的区别。在两种情况下CTB的滴度明显比抗LTB的滴度更高。然而在用LCTBA免疫的小鼠中，抗LTB和CTB的滴度水平互相之间更相似。这是由于与CTB-和LCTBB免疫的小鼠相比抗LTB抗体的水平升高而抗CTB抗体的水平下降所致。第三次免疫后，可见在用杂合分子免疫的两组小鼠中抗CT3的滴度与用CTB免疫的小鼠相似，但抗LTB的水平更高。当试验全血清的抗LTB或CTB的抗体滴度时，由于存在交叉反应的抗体使结果不清楚。为了确定在不同血清中观察到的区别是否是由于LTB-特异性的抗体水平的改变而引起的，用CTB-Sepharose吸附第三次免疫后取的血清以去掉交叉反应和CTB特异性的抗体。然后试验它们的抗CTB和抗-LTB的滴度。结果在图4中显示。可见该处理有效地从血清中除去了所有的抗CTB抗体。在用CTB免疫的小鼠中，全部观察到的抗-LTB滴度是由于交叉反应的抗体所产生的且吸附后没有LTB反应性抗体残留。对于LCTBA和LCTBB，保留明显的抗LTB滴度，尽管不如用LTB免疫的小鼠一样高。这是导入CTB分子的突变确实具有产生LTB特异性抗体的免疫学效力的证据。还清楚了在CTB分子中具有7个取代的LCTBA的效力比仅具有3个取代的LCTBB更大。用不同的B亚基抗血清中和CT和LT在体外试验中试验了不同抗血清中和LT或CT的能力。结果在表2中表示。在用于试验的条件下，CTB和LTB抗血清仅有轻微的交叉反应。在所用的范围内的任何稀释度下，LTB抗血清不中和CT，而CTB抗血清对LT具有轻微的效力。相反，抗杂合分子之一的抗血清对CT和LT都具有明显的中和活性。即使用CTB完全吸附抗血清的CT中和活性后，仍有明显的LT中和活性。这些结果表明在CTB分子中进行的取代导入了中和的LTB抗原决定簇，而同时保留CT中和抗原决定簇。很明显用LCTBB免疫的小鼠抗血清表现出的抗LT的中和活性水平几乎比得上LCTBA免疫的小鼠血清所发现的水平，尽管用GM1ELISA试验仅存在低水平的LTB特异性抗体。这表明在B亚基结构的94和95位的氨基酸形成部分有力的中和表位，它可能位于或靠近受体结合位点。说明书实验部分提供的结果的小结本工作描述了基本上由CTB组成的两个杂合B亚基毒性分子的合成和分析，其中的突变将特定氨基酸残基改变成类似于人LTB的相应位置。发现两种蛋白质均以高水平表达且保留CTB和LTB的基本特征。两者都组装成5聚体且都结合到GM1神经节苷脂上。两种分子除了以交叉反应性单克隆抗体LT39同样地与野生型CTB和LTB反应外，还以多克隆抗血清强烈、地与CTB或LTB反应。然而，在与其它LTB-或CTB特异性单克隆抗体的反应中，不同蛋白质有区别，表明新蛋白质确实在相同分子上携带对各野生型蛋白质特异性的抗原决定簇。以免疫实验进一步说明了这一点，它表明从用杂合分子免疫的动物获得的血清交叉反应性增强。还证实了在CHO细胞毒性中和试验中，抗杂合分子的抗血清比抗单独的CTB的抗血清更有效地中和LT，且该活性不被CTB吸附掉。生产用于本工作的2个杂合分子以说明在CTB分子不同区域的突变的影响。在第一个构建体中，CTB的氨酸末端改变，而在第二个中，在靠近认为涉及受体结合的底物特异性的羧基末端的位置的两个残基改变。在本工作中未研究LCTBB位置1Thr→Ala的突变。用于对照的重组CTB从前面所述的表达系统生产(Lebens和Johansson等，1993)且也进行了我们以前显示无免疫意义的这种突变(Leben和Johansson等，1993和MLeben和J.Holmgren，未公开的资料)。从这些结果很清楚在CTB的氨基末端所作的改变越大，与产生可检测但极低抗LTB特异性GM1-ELISA滴度的成熟蛋白质94和95位两个残基改变相比产生更多LTB特异性抗体(以不被CTB-Sepharose吸附掉的GM1-ELISA抗体滴度来限定)。因此，相当有趣的是发现了在CHO细胞中抗两个成熟B亚基的抗血清对LT(和CT)的中和相似。这表明尽管由第二种杂合体产生的LTB特异性抗体的滴度似乎很低，但该抗体具有相当的中和效力，这表明受影响的两个残基位于中和表位内。进一步的证据是在B亚基分子上有一个以上的该中和表位，因为没有突变体丧失中和CT的能力，尽管存在由于取代一些CTB特异性中和表位已丧失的可能。突变CTB分子的交叉反应性由产生的特异性改变引起，因为它产生LTB特异性抗体，该抗体不受免疫吸附除去CTB-特异性以所有交叉反应性抗体导致CHO细胞试验中完全丧失CT中和活性的影响。然而LT中和活性得以保留。从这些研究清楚了可生产含CTB-和LTB特异性中和表位的杂合分子。另外，最近描述的CTB的过度表达系统允许大量生产这些蛋白质。因此现在提供该分子用于将其掺入分离的霍乱和ETEC疫苗中或掺入设计成对两类腹泻疾病产生明显的保护的单个广谱疫苗中。材料和方法细菌菌株和质粒用于本工作生产重组CTB(rCTB)和LTB(rLTB)及突变衍生物的细菌菌株是O1E1T或霍乱弧菌菌株JBK70(Kaper和Lockman等，1984)，以及O1典型霍乱弧菌菌株JS1569(Lebens和Johansson，等，1993)。携带合适重组质粒的菌株冻存于-70℃含20％甘油的培养基中。经过各菌株划线于含氨苄青霉素100μg/ml的L-琼脂上复苏培养物。本研究产生的质粒在图2中显示。DNA操作包括质粒制备，限制性酶使用，DNA连接和琼脂糖凝胶电泳的DNA操作基本上按Sambrook和Fritsch等(1989)所述的标准程序进行。限制性酶在厂商提供的缓冲液中使用。从InnovagenAB，瑞典获得用于经连接插入质粒或用于使用PCR扩增的寡核苷酸。根据Schdel和Milich等(1991)所述的方法将PCR用于将突变导入来自质粒的ctxB基因中。使用从Amersham(UK)获得的测序酶Version20试剂盒进行DNA测序。CTB和LTB及其突变衍生物的制备粗制rCTB和其衍生物从携带相关表达质粒的菌株霍乱弧菌JS1569中制备。从携带表达质粒pMMB68的霍乱弧菌菌株JBK70中制备LTB(Sandqvist和Hist，等，1987)。培养物在改良的syncase上生长(Lebens和Johansson，等，1993)且在培养基中积累的CTB或LTB以前面描述的六偏磷酸沉淀法回收(Lebens和Johansson等，1993)。获得的B亚基浓度使用交叉反应性单克隆抗体LT39以GM1-ELISA(Svennerholm和Holmgren，1978)测定。使用HPLC建立进一步纯化LTB和CTB衍生物的方法。六偏磷酸沉淀重悬于20mMTris-HClpH9中。然后将所得的悬液以10,000rpm离心3分钟，含B亚基的上清通过0.2m无菌滤器过滤。使用DEAEMem-SepHP1000柱(MilliporeCorp.，USA)在水600多溶剂传递系统(MilliporeCorp，USA)上进行HPLC。首先将B亚基结合到pH9的柱上(20mMTris-HCl)并用0.16M(对LCTBA)或0.18M(对LCTBB)乙酸钠在pH8下洗脱柱。体外抗原性和蛋白质分析聚苯乙烯ELISA平板的小孔用100μl0.3nmol/mlGM1神经节苷脂在室温下覆盖6小时并保存于4℃备用。首先以两次更换PBS洗涤覆盖的平板并用磷酸盐缓冲液pH7.2(PBS)，0.1％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)37℃封闭30分钟。经过在PBS，0.1％BSA中稀释浓缩的贮液获得25ng/ml各B亚基制品的溶液。这些稀释样品的100ml等分试样经过在室温下培养1小时用于覆盖封闭的平板。然后将不同抗体的溶液加入第一排平板上并用5倍系列稀释液滴定掉。然后用与辣根过氧化物酶(HRP)连接的第二抗小鼠或抗免免疫球蛋白(Jackson，PA，USA)检测结合于B亚基上的抗体。室温下培养1小时后，按以前所述(Svennerholm和Holmgren，1978)使用生色底物邻苯二胺(OPD)和H2O2在柠檬酸缓冲液(pH4.5)中检测抗体的结合。在各步骤之间用PBS，0.05％Tween洗涤平板3次。反应10分钟后以产生450nm下吸光率超出背景0.4的倒数稀释测定滴度。在厂家推荐的条件下使用从Biorad(CA.USA)获得的miniproteanII装置进行SDS-聚丙烯凝胶电泳和电转移分辨的蛋白质到硝酸纤维素上。小鼠免疫C57/Black小鼠对用CTB，LTB或突变的CTB衍生物之一经腹膜内注射免疫3次。含10mgB亚基的前两次剂量在含Freunds不完全佐剂的200ml中施用，且给药间隔10天。第二次剂量14天后施用无任何佐剂的20mgB亚基的第三次剂量。在前2次剂量前给小鼠抽血并在第三次剂量7天后处死小鼠，之后收集血液用于分析。制备血清并贮存于-20℃备用。血清滴度测定以GM1-ELISA(Svennerholm和Holmgren，1978)试验免疫获得的血清。使用前用GM1覆盖的平板首先立即用PBS洗涤2次并用PBS，0.1％BSA在37℃封闭30分钟。然后将平板分成2组。将在PBS，0.1％BSA中的100μlCTB加入第一组平板的孔中并将在PBS，0.1％BSA中的100tlLTB0.5μg/ml加入第二组的孔中。然后将平板在室温下保温1小时并用PBS，0.05％Tween洗涤3次。然后将100μlPBS，0.1％BSA，0.05％Tween的溶液加入除第一排的所有孔中。向第一排的孔中加入在PBS，0.1％BSA中1/1000稀释的血清的150ml等分试样。然后用系列3倍稀释液滴定它们并在室温下培养1小时。用PBS，0.05％Tween洗涤3次后，结合于CTB和LTB上的抗体经过用与HRP连接的抗小鼠IgG(Jackson，PA，USA)培养测定结合于CTB和LTB上的抗体。生色底物是OPD且滴度以上面所述测定体外抗原性所用的相同方式计算。CTB抗体吸附为了去掉CTB特异性抗体和与LTB交叉反应的抗体将血清用CTBSepharose珠吸附。根据厂家说明书经过将CTB五聚体共价连接到溴化氰激活的Sepharose(PharmaciaAB，Sweden)上制备CTB-Sepharose。血清首先在PBS中以1∶10稀释。100μl该稀释液与50μlSepharose-CTB珠在微型离心管中以间歇摇动在室温下培养1小时。然后将它们在台式顶部微量离心机中以9000rpm离心2分钟并回收上清。然后重复该程序。按上面所述以GM1-ELISA试验抗CTB和LTB的吸附的血清。毒性中和试验用各种CTB衍生物和CTB第3次免疫小鼠后获得的血清在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞试验(Guerrant和Brunton等，1974)中试验其用CTB-Sepharose吸附前和后抑制CT或LT毒性的能力。未吸附的血清首先以1∶20稀释。所得血清的50ml等份试样然后以一式二份在微量滴定平板上用3倍稀释液进行系列稀释。向第一组一式二份的孔中加入在50μl含1％BSA的HAMF12培养基中的0.2ngCT并向第二组中加入在相同培养基中的LT溶液。平板在室温下培养1小时，之后向所有孔中加入100μl在F12HAM培养其中的2×105细胞/ml的悬液。在37℃在10％CO2，5％O2的气体中使培养进行1小时。用甲醇固定细胞并用Giemsa溶液(Merck)染色。以光学显微镜观察细胞的损伤。对用CTB-Sepharose珠吸附的血清应用相同的程序。所有实验以一式二份进行。参考文献(a)Clemens.J.，Sack，D.，Harris，J.R.J.，Chakrabony，J.，Neogy，P.K.Stanton，B，Huda，N.，Khan，M.U.，Kay，B.A.，Khan，M.R.，Ansaruzzaman，M.，Yunus，M.，Rao，M.R.，SvennerholmA，-M.和Holmgren，J.(1988)传染病杂志158，372-377。(b)Clemens，J.，Sack，D.，Harris，J.R.J.，vanLoon，F.，Chakraborty，J.Ahmed，F.，Rao，M.R，Khan，M.R.，Yunus，M.，Huda，N.，Stanton，B.，Kay，B.A.，Walter，S，Eeckels，R，SvennerholmA-M和Holmgre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