专利名称：一种甄别霍乱毒素的细胞学检测试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及一种甄别霍乱毒素的细胞学检测试剂盒，以及利用该试剂盒检测霍乱毒素的方法。
背景技术：
在霍乱弧菌疫情的防控工作中，菌体是否产生CT是一个极为重要的检测指标。霍乱弧菌流行株几乎均为产CT的菌株，而非流行株均不产生CT。CT由CtxAB基因编码，是霍乱弧菌分泌的一种具有ADP-核糖基转移酶活性的毒蛋白，该基因位于染色体CTX遗传单元上，其415kb的核心区域包含至少5个基因(c印，orfU，ace, zot，ctxAB)，是由溶原性噬菌体 CTXΦ携带，可在霍乱弧菌间水平转移。CT毒素由5个B亚单位和1个A亚单位组成，B亚单位作用于肠黏膜上皮细胞特异性受体GMl (Gangliosidoses，神经节苷脂类分子)，使得A 亚单位能够进入肠细胞，A亚基作用于腺苷酸环化酶，使其活化，从而使环磷酸腺苷(cAMP) 含量增高，cAMP在小肠上皮细胞内起水、电解质代谢调节作用，其浓度的增高导致肠液分泌功能增强，打开细胞膜离子通道，引起大量的水和电解质流入肠腔，进而导致细胞大量失水引起腹泻。因此，有效地将产毒株与非产毒株进行甄别，加强产毒株的监测和控制，可极大地提高防治的效果和效益，对于霍乱的预防控制具有重要的意义。目前，传统的CT检测方法主要依靠动物实验，传统细胞学、免疫学、分子生物学和生物传感器等技术，但是这些方法检测周期长，灵敏度低，而且无法针对霍乱毒素的活性进行有效甄别。因此，有必要建立一种能够实时动态、高灵敏度的霍乱毒素检测方法。
发明内容
本发明目的是一种能够高特异性、快速、准确地鉴定霍乱毒素的细胞学检测试剂盒及其检测方法。本发明采用的技术方案是一种甄别霍乱毒素的细胞学检测试剂盒，主要包括Y1肾上腺皮质细胞(本发明中为市购，ATCC:CCL-79)，抗霍乱毒素中和抗体，多聚赖氨酸，96-E-plate，以及用于Yl肾上腺皮质细胞的细胞培养基。所述细胞培养基可为常规适用于Yl肾上腺皮质细胞的培养基，本发明中所述细胞培养基组成如下马血清15% (ν/ν)，胎牛血清2. 5% (ν/ν)，溶剂为F-I^(培养基。本试剂盒也可含有霍乱毒素标准品，检测时同时以梯度浓度的标准品于同等条件下进行检测，以加入已知霍乱毒素的时间点至达到20%细胞病变的时间点所需时间与霍乱毒素的浓度关系绘制标准曲线，根据待测阳性样本加入的时间点至达到20%病变时间点所需的时间，对照标准曲线，即可获知待测样本中的霍乱毒素浓度。本发明还涉及一种利用所述试剂盒检测霍乱毒素的方法，所述方法包括(1)多聚赖氨酸用磷酸盐缓冲液稀释后包被96-E-plate ；具体方法如下将多聚赖氨酸(0.1g/L)用磷酸盐缓冲液(PBQ按照1 4(体积比)稀释后，每孔100μ1体积包被96-E-plate，室温10分钟，除去后用磷酸盐缓冲液清洗2次，待用；多聚赖氨酸由25 30赖氨酸残基聚合而成，具有强烈的抑菌能力和增强细胞黏附性，用于孔板的包被，可使细胞保持良好的生长状态； (2)将Yl肾上腺皮质细胞以1 2 X IO4细胞/孔的密度铺板，细胞培养基体积为 100 200 μ 1/孔，在实时细胞分析系统上于37°C、5% CO2条件下培养；(3)细胞培养18 20小时后，取待测样本(菌体培养上清液或者粪便等样本上清液)，加入细胞生长孔中，同时另取一份待测样本和抗霍乱毒素中和抗体混合、孵育后，加入细胞生长孔中，在实时细胞分析系统上于37°C、5% CO2条件下培养；(4)以不加样品的细胞生长孔作为阴性对照，观察加入待测样本后的细胞生长曲线，若加入待检样本后细胞生长曲线值出现20%细胞病变、同时与抗霍乱毒素中和抗体混合后无细胞病变，则判断为阳性(一般来说，如果是阳性，在加入样本后2小时内会达到 20%病变)。所述细胞培养基组成如下马血清15%，胎牛血清2. 5%，溶剂为F-I^(培养基。本发明的有益效果主要体现在提供了一种甄别霍乱毒素的细胞学检测试剂盒及其检测方法，针对霍乱毒素的特异性细胞学反应，建立了一种能够实时动态、高灵敏度的霍乱毒素检测体系，可高特异性、快速、准确地鉴定霍乱毒素，能有效地将产毒株与非产毒株进行甄别，加强了产毒株的监测和控制，可极大地提高防治的效果和效益，对于霍乱的预防控制具有重要的意义。
图1 为标准品检测结果；1 8 分别为0. 9ng/ml、0. 45ng/ml、0. 22ng/ml、0. llng/ ml、55pg/ml、27. 5pg/ml、14pg/ml 和阴性对照；图2为非线形标准曲线；图3为17例阳性模拟样本检测结果；图4为例阴性样本检测结果。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例1 1、材料Yl肾上腺皮质细胞(ATCC :CCL-79) ,F-12K培养基、马血清购自ATCC公司；胎牛血清购自Hyclone公司；霍乱毒素购自List biological laboratories公司；多聚赖氨酸、牛血清白蛋白和抗霍乱毒素中和抗体购自Sigma公司；96-E-plate购自瑞士 Roche公司。实时细胞分析系统购自瑞士 Roche公司。2、检测方法2. 1 96-E-plate的包被和细胞铺板将多聚赖氨酸用磷酸盐缓冲液(pH7. 2)按照1 4 (ν/ν)稀释配成包被液，每孔加 100 μ 1体积包被液包被96-E-plate，室温静置10分钟，除去包被液后用磷酸盐缓冲液清洗2次，待用。将F-I^(培养基按照15%和2. 5%分别加入马血清和胎牛血清，混合均勻。将试剂盒中的Yl肾上腺皮质细胞按照终浓度1. 5 X IO4细胞/孔铺板，细胞培养基体积为150 μ 1/ 孔，在实时细胞分析系统上37°C、5% CO2 (另95%为空气)条件下培养，细胞的生长曲线值随着培养时间的延长而不断地增加。2. 2霍乱毒素检测待细胞培养至18 20小时，加入毒素或菌体培养上清液。针对每一个产霍乱毒素的菌株和非产霍乱毒素的菌株培养上清液，分别取两份15 μ 1，一份直接加入到有细胞生长孔，一份与等体积的抗霍乱毒素中和抗体混合，37°C孵育30分钟，然后加入细胞生长孔， 用的霍乱纯毒素作为阳性对照。观察细胞生长曲线的变化情况。2. 3定量检测方法的建立阴性粪便样本上清液(将固体粪便样本按照1 5(g mL)稀释后，800 IOOg离心5 10分钟，取上清待用；如为腹泻样本，则800 IOOg离心5 10分钟，取上清待用)， 采用含有0.1% (w/w)牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液按照1 10体积比稀释，取15μ1，一份直接加入到细胞生长孔，一份先与等体积的抗霍乱毒素中和抗体混合，37°C孵育30分钟后再加入至不同的细胞生长孔。将霍乱毒素标准品用上述溶液以2倍体积系列梯度稀释成0. 9ng/ml 14pg/ml， 共7个梯度，结果见图1。3、结论阳性结果的判定标准为加入待检样本后细胞生长曲线值出现20%细胞病变， 同时与抗霍乱毒素中和抗体混合后无细胞病变；并以加入已知霍乱毒素的时间点至达到 20%细胞病变的时间点所需时间与霍乱毒素的浓度绘制标准曲线，(见图2，标准方程为y =0. 8387χ-°·3045)。( 一般来说，如果是阳性，在加入样本后2小时内会达到20%病变)。以阳性模拟样本(霍乱毒素标准品溶液掺入阴性样本中制备)进行检测，结果见图3，均呈阳性结果。以非产毒性霍乱弧菌、副溶血性弧菌、志贺菌、艰难梭菌、沙门菌等进行检测，结果见图4，均无阳性结果出现。由以上实验可知，本发明试剂盒可实时动态、高灵敏度地对霍乱毒素进行甄别，能有效地将产毒株与非产毒株进行甄别，对于霍乱的预防控制具有重要的意义。
权利要求
1.一种甄别霍乱毒素的细胞学检测试剂盒，主要包括Yi肾上腺皮质细胞，抗霍乱毒素中和抗体，多聚赖氨酸，96-E-plate，以及用于Yl肾上腺皮质细胞的细胞培养基。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述细胞培养基组成如下马血清15%，胎牛血清2. 5%，溶剂为F-II培养基。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还含有霍乱毒素标准品。
4.一种利用权利要求1所述试剂盒检测霍乱毒素的方法，所述方法包括(1)多聚赖氨酸用磷酸盐缓冲液稀释后包被96-E-plate；(2)将Yl肾上腺皮质细胞以1 2XIO4细胞/孔的密度铺板，细胞培养基体积为100 200 μ 1/孔，在实时细胞分析系统上于37°C、5% CO2条件下培养；(3)细胞培养18 20小时后，取待测样本，加入细胞生长孔中，同时另取一份待测样本和抗霍乱毒素中和抗体混合、37°C孵育30分钟后，加入细胞生长孔中，在实时细胞分析系统上于37°C、5% CO2条件下培养；(4)以不加样品的细胞生长孔作为阴性对照，观察加入待测样本后的细胞生长曲线，若加入待检样本后细胞生长曲线值出现20%细胞病变、同时与抗霍乱毒素中和抗体混合后无细胞病变，则判断为阳性。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述细胞培养基组成如下马血清15%，胎牛血清2. 5 %，溶剂为F-II培养基。
全文摘要
本发明提供了一种甄别霍乱毒素的细胞学检测试剂盒及检测方法。所述试剂盒主要包括Y1肾上腺皮质细胞，抗霍乱毒素中和抗体，多聚赖氨酸，96-E-plate，以及用于Y1肾上腺皮质细胞的细胞培养基。本发明提供了一种甄别霍乱毒素的细胞学检测试剂盒及其检测方法，针对霍乱毒素的特异性细胞学反应，建立了一种能够实时动态、高灵敏度的霍乱毒素检测体系，可高特异性、快速、准确地鉴定霍乱毒素，能有效地将产毒株与非产毒株进行甄别，加强了产毒株的监测和控制，可极大地提高防治的效果和效益，对于霍乱的预防控制具有重要的意义。
文档编号C12Q1/02GK102533926SQ20121001424
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月17日 优先权日2012年1月17日
发明者张政, 罗芸, 金大智 申请人:浙江省疾病预防控制中心