专利名称：：霍乱灭活口服疫苗效力的测定方法及检测试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种检测方法及其检测试剂盒，确切讲本发明是一种用于检测霍乱灭活口服疫苗效力指标的检测方法，和这种检测方法所使用的检测试剂盒。
背景技术：
：由于人们越来越认识到肠道局部的粘膜免疫应答在预防霍乱感染中的重要性。霍乱口服灭活疫苗的研究也逐渐受到重视。二十世纪八十年代初人们正式开始了对口服霍乱疫苗的研究，先后研制出了单纯全菌体死疫苗(WCV)和全菌体加霍乱毒素B亚单位疫苗(WC/BS)。为确保霍乱疫苗的质量和安全性，在疫苗制备出后必须进行检测，以确定其效力。现阶段采用的霍乱口服灭活疫苗效力检测的方式是通过非肠道给药的家兔免疫原性试验，测定疫苗免疫动物后的抗体效价水平，以及采用小鼠免疫后的半数有效剂量(ED5tl)方法，上述方法均受动物自身条件的影响，无法正确反应出一次剂量后的免疫应答，试验结果无一致性和重复性。此外这种方法还存在试验成本大、试验时间周期长的不足。世界卫生组织(WHO)于2002年发布了《口服霍乱灭活疫苗的生产及检定准则》一文，文中指出，对霍乱疫苗保护力的评价目前尚无国际公认的直接方法，同时也没有能衡量和预测疫苗对人群的作用的动物模型。
发明内容本发明提供一种可克服现有技术不足的，其效果能与现采用的试验方法效果一致的检测霍乱灭活口服疫苗效力指标的方法，本发明的另一个目的是提供这种方法使用的检测装置。本发明的方法是分别从霍乱弧菌01群菌株和0139型菌株提取脂多糖(LPS)，以01群和0139型菌株的LPS为抗原，或者以抗01LPS、0139LPS的兔抗体为抗体，采用间接酶联吸附试验半定量测定霍乱灭活口服疫苗中霍乱01群和0139型的LPS含量，根据所测得的霍乱灭活口服疫苗中01群和0139型的LPS含量范围来确定疫苗的效力。本发明优选的测定方法是以霍乱弧菌01群和0139型菌株的LPS为抗原，采用间接ELISA法测定霍乱灭活口服疫苗的效力指标。本发明具体的一个测定方法是a.从霍乱弧菌中分离出霍乱01群菌株和非01群0139型菌株，再分别从所得到的01群菌株和0139型菌株中提取01群霍乱弧菌LPS和0139型霍乱弧菌LPS，标化后将所得到的01群霍乱弧菌LPS和0139型LPS分别用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释，将霍乱01LPS参比品稀释为10μg/ml,0139LPS稀释为2.5μg/ml，再将稀释后的OlLPS和0139LPS分别包被于固相载体上，每孔0.lml，01脂多糖和0139脂多糖各加一行。酶标板可以为聚苯乙烯或聚乙烯酶标板。b.将被检疫苗用PBS稀释为5XIO7菌/ml，每孔包被0.Iml，以上述霍乱OlLPS和0139LPS的包被孔为参照，，再在其中加入经稀释的兔抗鼠IgG-HRP，即按常规间接ELISA法进行操作，最后加入显色底物，37°C放置5-7分钟，加入2M硫酸终止反应，测定OD45tl的吸光值，根据LPS参照孔和疫苗试验孔的OD45tl数值进行对比，得以判断被检疫苗的效力。以前述的方法进行霍乱灭活口服疫苗效力的测定方法使用的检测试剂盒以下内容组成a.孔酶标板，最好采用96孔酶标板b.霍乱弧菌01群菌株LPS和0139型菌株LPSc.酶标抗抗体d.底物Ae.底物Bf.酶标洗液g.终止液。本发明的试剂盒中优选采用96孔聚苯乙烯或聚乙烯酶标板，底物A优选采用四甲级联苯二胺(TMB)；底物B优选采用过氧化氢(H2O2)；终止液优选采用2M的硫酸。在具体使用中应将酶标洗液按IOX稀释。由于本发明不使用动物进行试验，因此不存在受动物自身条件的影响，结果具有一致性，其次，采用本发明试验成本较低，其试验所需时间较短。附图1为间接ELISA标准曲线与01菌群检测曲线，附图2为间接ELISA标准曲线与0139菌群检测曲线.具体实施例方式以下为本发明的实施例。一、材料1.脂多糖(LPS)的制备Ll01LPS采用热酚法用Vibriocholera0118001、569B提取纯化所得。1.20139LPS为热酚法用Vibriocholera0139提取纯化所得。2.血清2.1抗01LPS小鼠血清一用纯化的01LPS免疫NIH小鼠，将免疫血清效价标化为11280待用。2.2抗0139LPS小鼠血清一用纯化的0139LPS免疫NIH小鼠，将免疫血清效价标化为11280待用。3.三乙胺水溶液一每IOOOml无热源水加入5g或6.81ml三乙胺。4.ELISA试剂4.1封闭液一1%BSA小牛血清白蛋白。4.2洗涤液一pH8.0的0.Imol·L^1Tris-HCl缓冲液(0.15mol·L-1NaCl,加入0.Iml·L_1Tween80)。4.3抗体稀释液一PH8.0的0.Imol·L^1Tris-HCl缓冲液，0.5mol·L-1NaCl,加入Iml·L-1TweenSO04.4辣根过氧化物酶标记抗体一HRP标记羊抗鼠IgG购自Sigma公司4.5酶稀释液一pH8.0的0.Imol·Γ1Tris-HCl缓冲液，1.5mMMgSO4,1%BSA4.6底物一底物A为TMB，底物B为H2O2。4.7终止液一2mol·L-1H2SO4二、检测方法1.样品的处理1.1霍乱弧菌01LPS的处理准确称取纯化的01LPS，溶解于三乙胺水溶液中，使之浓度达到lmg/ml。将该溶液于100W超声波处理10分钟后用于ELISA包板。1.2霍乱弧菌0139LPS的处理准确称取纯化的0139LPS，溶解于三乙胺水溶液中，使之浓度达到lmg/ml。将该溶液于100W超声波处理10分钟后备用。1.3待测样品的处理将兰州生物制品所生产的霍乱双价灭活口服疫苗成品胶囊中的内容物放入Eppendorf管中，加适量无热源蒸馏水溶解，SOOOrpm离心5分钟弃上清，重复上述步骤1次。沉淀加入适量的无热源蒸馏水，使得浓度达到IXIOltl菌/ml。将该溶液于100W超声波处理20分钟后备用。2.间接ELISA法标准曲线的建立2.1.微量反应板的处理将要包被的微量反应板放在支架上，使板与40W紫外灯管的距离为10cm，照射20分钟后备用。2.2LPS的稀释与包被将超声波处理后的01和0139LPS用包被液稀释为10μg/ml，分别在不同的微量反应板上用包被液在110列进行倍比稀释，共作5组(AE行)，第11列只加入包被液作为空白对照，第12列加入与第1列浓度相同的LPS溶液，上述溶液每孔均为100μ1。37°C放置1小时后于4°C过夜。2.3封闭用Bio-RADModel1250Immunowash洗板3次，每次间隔1分钟。在干净滤纸上拍干，每孔加入150μ1的封闭液，37°C放置1小时。2.4加入抗体血清用抗体稀释液分别将抗01和0139LPS的小鼠血清稀释100倍备用，将正常小鼠血清用抗体稀释液稀释100倍作为阴性对照血清备用。重复前述方法，再每孔加入上述稀释的抗01和0139LPS小鼠血清，第12列只加入阴性对照血清，每孔均为100μ1，37°C放置1小时。2.5加入辣根过氧化物酶标记抗体重复前述方法，再根据试剂说明书将HRP标记羊抗鼠IgG稀释至其工作浓度，每孔加入100μ1，37°C放置1小时。2.6显色反应洗板，将底物A和底物B等体积混勻，用多道微量加样器按列加入，每孔100μ1，37°C放置1015分钟显色后，用用多道微量加样器按列加入终止液，每孔100μ1。2.7绘制标准曲线用Bio-RADModel550MICROPLATEREADER在450nm波长读取各孔的A值，绘制标准曲线。2.8两种LPS免疫小鼠制备标准血清免疫NIH品系小鼠，每只全程免疫20μgLPS，腹腔注射0.3ml，同时皮下注射0.Iml0第一针加完全佐剂，间隔14天后进行第二针免疫，加不完全佐剂免疫；第三、四、五针均不加佐剂免疫，间隔7天，未次免疫后7天采血。用间接酶标法测定血清效价。用相应菌株的LPSlOyg包板，检测血清倍比稀释，要求小鼠血清效价大于11280为合格。将两种LPS免疫血清标化将11280的18001和569B株免疫的血清按各50%体积稀释100倍后备用；同样，将11280的0139型霍乱93_3株LPS免疫血清稀释100倍后备用。3.霍乱灭活口服疫苗成品的LPS含量检测3.1样品的稀释与包被将按前述步骤处理的待测霍乱灭活口服疫苗成品样品用包被液稀释至5XIO7菌/ml，分别在AB两行包被，10μg/ml01LPS包被C行，2.5μg/ml包被D行，第11列只加包被液，第12列加入5XIO7菌/ml的样品，每孔均为100μ1。37°C放置1小时后于4°C过夜。3.2封闭一方法与2.3步骤相同3.3加入抗体血清一方法与2.4步骤相同3.4加入辣根过氧化物酶标记抗体一加入抗体血清一方法与2.5步骤相同3.5显色反应一加入抗体血清一方法与2.6步骤相同实际结果是以01或0139LPS标准作为对照，所测的口服疫苗菌苗中01LPS含量大于10μg,0139LPS含量大于2.5μg。与前述方法相近的另一种方法为用100倍稀释标化的抗01LPS、0139LPS兔抗体包被，标化兔免血清需经50%饱和硫酸铵沉淀，盐析后加PBS溶解，4°C透析过夜，用280nm波长测定OD值及浓度，测得浓度霍乱01为1.724ug/ml，霍乱0139为1.764ug/ml；抗原分别加LPS和检测疫苗，LPS的浓度分别为lOOug，分别系列稀释和10倍稀释至12个稀释度，疫苗的浓度为1000亿系列稀释至12个稀释度，第三层加200倍稀释的鼠抗01LPS、0139LPS血清，再加入兔抗鼠IgG_HRP，3000倍稀释；每孔加入IOOul的TMB底物，37°C放置5_7分钟，加入2M硫酸终止反应，测定OD450的吸光值。4动物实验4.1疫苗免疫小鼠及家兔用1个胶囊的霍乱灭活口服疫苗溶解于生理盐水中，使浓度为1.2XIO1Vml0将小鼠分为4组，分别为口服免疫组和口服乳糖对照组，将小鼠提前停食1天，每只小鼠口服0.3ml，0、7、14天共口服3剂，末次免疫后10天于尾静脉采血供检测。同法免疫家兔，每次口服1XIO10/只，0、7、14天共口服3剂，末次免疫1014天耳静脉采血供检测。4.2免疫小鼠的保护力试验将末次免疫14天后的小鼠用IOOXLD5q菌量的0139(93-3株)和569B强毒菌液进行攻毒试验，计算其保护力。4.3兔肠袢试验检测疫苗保护力试验将口服免疫01/0139型霍乱疫苗3次后，效价为1320的家兔开腹行肠袢结扎试验，将4cm结肠结扎，间隔2cm，共3段，分别注入0.5ml01群霍乱弧菌强毒株菌液(IOOXLD50)jO.5ml0139型霍乱弧菌强毒株菌液(100XLD5tl)，取健康家兔1只作对照，注入0.5ml磷酸缓冲生理盐水，做法同上。5小时后开腹检查结果，根据肠积液产生强度判定保护力情况。具体检测结果101/0139霍乱口服疫苗中LPS含量的检测将lOOOOng/ml浓度的01LPS在酶标板上进行2倍的连续稀释，共4组，将2XIO8菌/ml的处理后的疫苗在同一酶标板上进行2倍的连续稀释，共4组，用间接ELISA法，力口入抗01LPS的小鼠血清，测得A值见表1。表1间接ELISA法检测不同浓度01LPS及疫苗的A值<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>用上述结果的A值与01LPS和口服疫苗相应的浓度作图见图1。图1中曲线为01LPS标准曲线■为疫苗中的01菌A值。OlLPS的浓度为0-10000ng/ml，2倍稀释；疫苗的浓度为0-2XIO82倍稀释。将lOOOOng/ml浓度的0139LPS在酶标板上进行2倍的连续稀释，共4组，将2XIO8菌/ml的处理后的疫苗在同一酶标板上进行2倍的连续稀释，共4组，用间接ELISA法，加入抗0139LPS的小鼠血清，测得A值见表2。表2间接ELISA法检测不同浓度0139LPS及疫苗的A值<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>用上述结果的A值与0139LPS和口服疫苗相应的浓度作图见图2，图中0139LPS标准曲线；■为疫苗的0139菌A值，其中0139LPS的浓度为O-lOOOOng/ml，2倍稀释；疫苗的浓度为0-2X1082倍稀释。上述结果表明用间接ELISA法检测不同稀释度的LPS，其结果也呈现出一定的线性，同样用该方法检测不同浓度的疫苗中LPS的含量，其A值随浓度的增加而增加。通过标准曲线，可以对疫苗中的LPS含量进行定量。但由于各种可变因素，这种定量是不精确的。在检测疫苗中01LPS含量时，该试剂的灵敏度较低，只能检测到浓度为2.5X107的疫苗中LPS含量，这可能与免疫的抗01LPS血清效价有关。从图2中看到两条曲线出现了交叉，这表明标准曲线并不能对疫苗中的LPS进行精确定量，但能提供一定范围内的参考值。因此，要确立疫苗中LPS含量的指标，可选择在曲线中接近直线的区间作为参考标准。根据图1，01LPS浓度在1562500ng之间的A值线性关系较好；根据图2，0139LPS浓度也在在1562500ng之间的A值线性关系较好。疫苗浓度低于5X107菌/ml时，其中01LPS含量用上述试剂和方法无法检测到，因此还需一定的改进；疫苗浓度在3.12X1065X107之间，用该法检测到的LPS含量与疫苗浓度的线性关系明显，因此未来检测样品的浓度可选在这一范围内。综上所述，间接ELISA法可用于疫苗中LPS含量的检测，考虑到各种可变因素，LPS标准品应与待检样品在同一酶标板上进行ELISA试验。在各条件都稳定的情况下LPS标准品可以不作标准曲线，但必须有几个稀释度；样品的浓度应在其线性较好的范围内进行试验。2抗体效价与保护力之间的关系2.1口服免疫01/0139型霍乱疫苗后的抗体反应从表3中可以看出小鼠口服免疫01/0139型霍乱疫苗三剂后，口服免疫组血清抗IgG效价为18，小肠分泌性IgA效价能达到14，01/0139型霍乱疫苗口服免疫家兔三剂后，血清效价可13201640，肠液分泌性IgA抗体效价为18。表3口服免疫01/0139型霍乱疫苗后的抗体反应<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>2.2免疫小鼠的保护力试验试验结果证明用01/0139霍乱疫苗口服免疫小鼠三次，每次40亿/只，末次免疫后7天分别用100XLD5(101群和0139型霍乱强毒菌攻击，分别可产生56%和67%的保护率(见表4)。表4免疫小鼠的保护力试验<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>2.3兔肠袢试验检测疫苗保护力试验结果(口服免疫/肠段攻击评价结果)试验结果见表5。结果显示口服免疫01/0139霍乱疫苗三剂，每剂疫苗100亿菌，血清效价为1320的兔子能够抵抗100XLD5Q的01群和0139型强毒菌的攻击。表5家兔口服免疫/肠段攻击评价结果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>根据试验方法的验证，表明霍乱LPS含量与传统动物试验方法具有一定的相关性，将霍乱LPS明确定量后，与家兔肠攀试验、小鼠保护力试验以及小鼠抗体产生试验进行对比后发现，霍乱LPS的含量在一定范围内，具有良好的线性关系，这种针对霍乱LPS半定量的方法，可以替代传统动物试验的方法，进行疫苗半定量的间接ELISA方法，具有联合的重复性和稳定性。可进行疫苗效力试验的检测。权利要求霍乱灭活口服疫苗效力的测定方法，其特征是分别从霍乱弧菌O1群菌株和O139型菌株提取脂多糖，以霍乱O1群和O139型的脂多糖为抗原，或者以抗O1LPS、O139LPS的兔抗体为抗体，采用间接酶联吸附试验半定量测定霍乱灭活口服疫苗中霍乱弧菌O1群和O139型的脂多糖含量，根据所测得的霍乱灭活口服疫苗中O1群和O139型的脂多糖含量确定疫苗的效力。2.权利要求1所述的霍乱灭活口服疫苗效力的测定方法，其特征是以霍乱01群和0139型的脂多糖为抗原，采用间接ELISA法测定霍乱灭活口服疫苗的效力指标。3.权利要求1所述的霍乱灭活口服疫苗效力的测定方法，其特征是a.从霍乱弧菌中分离出霍乱弧菌01群菌株和非01群0139型菌株，再分别从所得到的01群菌株和0139型菌株中提取01群霍乱弧菌的脂多糖和0139型霍乱弧菌脂多糖，标化后将所得到的01群霍乱弧菌脂多糖和0139型脂多糖分别用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释，将霍乱01LPS参比品稀释为10μg/ml、0139LPS稀释为2.5μg/ml，再将稀释后的01脂多糖和0139脂多糖分别包被于固相载体上，每孔0.lml,01脂多糖和0139脂多糖各加一行。酶标板可以为聚苯乙烯或聚乙烯酶标板。b.将被检疫苗用PBS稀释为5XIO7菌/ml，每孔包被0.Iml,以上述01脂多糖和0139脂多糖的包被孔为参照，，再在其中加入经稀释的兔抗鼠IgG-HRP，即按常规间接ELISA法进行操作，最后加入显色底物，37°C放置5-7分钟，加入2M硫酸终止反应，测定OD45tl的吸光值，根据LPS参照孔和疫苗试验孔的OD45tl数值进行对比，得以判断被检疫苗的效力。4.用于进行权利要求2或3所述的方法进行霍乱灭活口服疫苗效力的测定方法的检测试剂盒，其检测试剂盒是由以下内容组成a.孔酶标板b.霍乱弧菌01群菌株和0139型菌株脂多糖c.酶标抗抗体d.底物Ae.底物Bf.酶标洗液g.终止液。全文摘要本发明公开一种用于检测霍乱灭活口服疫苗效力的检测方法，和这种检测方法使用的检测试剂盒。本发明的方法是分别从霍乱弧菌O1菌群和O139菌型提取脂多糖，以O1菌群和O139菌群的脂多糖为抗原，或者以抗O1LPS、O139LPS的兔抗体为抗体，采用间接酶联吸附试验半定量测定霍乱灭活口服疫苗中细菌O1菌群和O139菌群的脂多糖含量，根据所测得的霍乱灭活口服疫苗中O1菌群和O139菌型的脂多糖含量确定疫苗的效力。文档编号G01N21/31GK101825577SQ20101014336公开日2010年9月8日申请日期2010年3月10日优先权日2010年3月10日发明者宣俊文,朱卫华,李生迪,王永谦,陈翠萍申请人:兰州生物制品研究所