抗肿瘤剂、肿瘤检测标志物及口服疫苗剂的制作方法

抗肿瘤剂、肿瘤检测标志物及口服疫苗剂的制作方法
【专利摘要】本发明的目的在于，提供一种侵袭性少、副作用小、且靶特异性高的抗肿瘤剂和/或肿瘤检测标志物。提供一种通过将含有编码由信号肽、低分子量的单链抗体及功能性肽构成的分泌型融合蛋白质的核酸的重组专性厌氧革兰氏阳性菌用作有效成分、能够向靶细胞递送功能性肽的抗肿瘤剂和/或可以经时地监视治疗效果的肿瘤检测标志物。
【专利说明】抗肿瘤剂、肿瘤检测标志物及口服疫苗剂

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种以重组专性厌氧革兰氏阳性菌为有效成分的抗肿瘤剂、肿瘤检测 标志物及口服疫苗剂。

【背景技术】
[0002] 以双歧杆菌为主的专性厌氧菌给药于静脉内的情况下，具有非常高的选择性，仅 在肿瘤中增殖（非专利文献1)。其被认为是由于肿瘤的中心部为低氧区域，因此存在厌氧 环境，专性厌氧菌可以生存及增殖。另外，也具有双歧杆菌为革兰氏阳性菌、死后也没有放 出内毒素的危险性的优点。另一方面，肿瘤组织的中心部的该厌氧环境也被认为是在现有 的化学疗法中产生抵抗性的原因（非专利文献2)。因此，利用双歧杆菌的上述特征，作为对 于肿瘤组织的DDS(药物递送系统）载体的有用性正在备受关注。
[0003] 例如，在专利文献1及非专利文献3中，以实体癌治疗为目的，公开有如下发明： 制作出能够将作为前药的5-氟胞嘧啶（5-FC)转化为5-氟尿嘧啶（5-FU)的表达大肠杆 菌的胞啼陡脱氨酶（⑶：cytosinedeaminase)的重组双歧杆菌，通过将该重组双歧杆菌与 5-FC同时给药而得到抗肿瘤效果。但是，该方法存在如下问题：除重组双歧杆菌之外，需要 将5-FC大量地给药于生物体，因此繁琐，考虑副作用等时，在临床开发时产生各种制约。
[0004] 另外，在专利文献2中公开有如下发明：制作出可以使具有生物活性的多肽以高 水平分泌表达的重组双歧杆菌，将重组双歧杆菌直接注入于肿瘤中。但是，该方法存在如下 问题：由于需要准确地锁定肿瘤的位置，因此适用范围窄，另外，在体内深部存在肿瘤的情 况下，侵袭性高，因此缺乏通用性。
[0005] 作为使用其它细菌的肿瘤治疗方法,报道有专利文献3及非专利文献4及5中记 载的诺维梭状芽孢杆菌（Clostridiumnovyi)或非专利文献6及7中记载的鼠伤寒沙门氏 杆菌（Salmonellatyphimurium)等，但均为来自病原性细菌，分泌有害的外毒素，因此在给 药的生物体的安全方面存在大问题。
[0006] 现有技术文献
[0007] 专利文献
[0008] 专利文献1:日本专利第3642755
[0009]专利文献 2 :TO/2010/126073
[0010] 专利文献3:日本特开2009-541319
[0011] 非专利文献
[0012] 非专利文献I:KimuraN.T.，等人，1980,CancerRes.，40 (6) :2061-2068.
[0013]非专利文献 2:Tredan0,等人，2007,JNatlCancerInst，99 :1441-1454.
[0014]非专利文献 3 :S.Taniguchi等人，2010,Cancer.Sci.，101 (9) :1925.
[0015]非专利文献 4:DangL.Η·,等人，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，98: 15155-15160.
[0016]非专利文献 5:IanC.，等人，2006,Science314 :1308-1311.
[0017]非专利文献 6:PawelekJ.Μ·，等人，1997,CancerRes.，57 :4537-4544.
[0018]非专利文献 7:TosoJ.F.，等人，2002,J.Clin.Oncol.，20 :142-152.


【发明内容】

[0019] 本发明的课题在于，提供一种重组专性厌氧革兰氏阳性菌，其作为能够将处在可 表达及分泌编码功能性肽的状态下的核酸递送至靶细胞周边的药剂递送载体发挥作用。
[0020] 本发明的课题在于，提供一种侵袭性低、副作用小、靶特异性高的抗肿瘤剂和/或 可以经时地监视治疗效果的肿瘤检测标志物。
[0021] 本发明的课题在于，提供一种口服疫苗剂，其为非侵袭性，副作用低，且靶特异性 商。
[0022] 考虑作为药剂递送载体的专性厌氧菌的临床应用时，通用性高的静脉内给药的治 疗法是有效的。但是，为此需要构建以癌细胞为特异性的靶，且细胞伤害活性高的生理活性 肽。但是，存在在双歧杆菌内使免疫球蛋白（IgG)表达的情况下，具有功能性的抗体没有表 达的大问题。
[0023] 本发明人等为了解决上述课题，制作含有编码由信号肽、单链抗体构成的低分子 量的抗肿瘤抗体、及外毒素构成的分泌型融合蛋白质的核酸的基因重组双歧杆菌，对荷瘤 小鼠异种移植动物模型（Xenograftmodel)给药于静脉内，结果在以下方面取得成功：该 重组双歧杆菌以非常高的选择性蓄积在肿瘤内，且不给生物体带来大的副作用，根据所分 泌的融合蛋白质的细胞伤害活性抑制该肿瘤细胞的增殖90%以上。本发明是基于该研究结 果的发明，具体而言，提供以下的发明。
[0024] (1)-种重组专性厌氧革兰氏阳性菌，其含有处于可表达状态的编码含有信号肽、 单链抗体及一种或两种以上的功能性肽的融合蛋白质的核酸。
[0025] (2)如⑴所述的重组专性厌氧革兰氏阳性菌，其中，专性厌氧革兰氏阳性菌为双 歧杆菌属（bifidobacterium)。
[0026] (3)如（1)或（2)所述的重组专性厌氧革兰氏阳性菌，其中，所述单链抗体为分子 量在35kDa以下的低分子抗体。
[0027] (4)如⑴?⑶中任一项所述的重组专性厌氧革兰氏阳性菌，其中，所述核酸编 码两个以上的单链抗体。
[0028](5)如⑴?⑷中任一项所述的重组专性厌氧革兰氏阳性菌，其中，所述单链抗 体识别靶细胞的表面抗原并进行结合。
[0029] (6)如（5)所述的重组专性厌氧革兰氏阳性菌，其中，所述靶细胞为肿瘤细胞。
[0030] (7)如（5)或（6)所述的重组专性厌氧革兰氏阳性菌，其中，所述功能性肽为外毒 素和/或标记性蛋白质。
[0031] (8)如（7)所述的重组专性厌氧革兰氏阳性菌，其中，所述标记性蛋白质为荧光蛋 白质或发光蛋白质。
[0032] (9)如⑴?（5)中任一项所述的重组专性厌氧革兰氏阳性菌，其中，所述功能性 肽为疫苗抗原肽。
[0033] (10) -种抗肿瘤剂，其以（7)所述的重组专性厌氧革兰氏阳性菌为有效成分。
[0034] (11) 一种抗肿瘤剂和/或肿瘤检测标志物，其以（7)或⑶所述的重组专性厌氧 革兰氏阳性菌为有效成分。
[0035] (12) -种口服疫苗剂，其以（9)所述的重组专性厌氧革兰氏阳性菌为有效成分。
[0036] 本说明书包含作为本申请的优先权的基础的日本国专利申请2012-158044号的 说明书和/或附图中所记载的内容。

【专利附图】

【附图说明】
[0037] 图1是表示编码用于实验的融合蛋白质的各表达盒的结构的图。
[0038] 图2是表示构建的融合蛋白质的免疫印迹的图。
[0039] 图3a是表示各融合蛋白质导致的A431细胞的增殖抑制的图。
[0040] 图3b是表示各融合蛋白质导致的BxPC-3细胞的增殖抑制的图。
[0041] 图3c是表示各融合蛋白质导致的HT-29细胞的增殖抑制的图。
[0042] 图4a表示A431细胞与EC-8C7EGFP的结合。左柱表示仅添加有缓冲剂的阴性对 照的结果，右柱表示添加EC-8C7EGFP时的结果。各柱的上段为荧光像，下段为同视野的明 视野像。
[0043] 图4b表示HT-29细胞与EC-8C7EGFP的结合。左柱表示仅添加缓冲剂的阴性对照 的结果，右柱表示添加EC-8C7EGFP时的结果。各柱的上段为荧光像，下段为同视野的明视 野像。
[0044] 图4c表示A431细胞中的EGFR内化的经时的结果。上段为荧光像，下段为同视野 的明视野像。
[0045] 图5是表示Ec-8C7EGFP和重组人类EGFR细胞外结构域的结合亲和性的图。
[0046] 图6是表示双歧杆菌和大肠杆菌的穿梭载体pKKT427的结构的图。
[0047] 图7是表示在MRS选择琼脂培养基上出现的表达8C7毒素的重组双歧杆菌的菌落 数的图。肿瘤、血液及脾脏均为从将来自人皮肤癌的细胞A431进行了皮下移植的荷瘤小鼠 中采取的样品。另外，在各样品中，白圆、黑圆、三角等表示来自相同个体。各样品的横棒表 不平均值。
[0048] 图8是表示对于将A431细胞进行了皮下移植的荷瘤小鼠，静脉内给药表达8C7毒 素的重组双歧杆菌时小鼠中的肝功能的变化的图。（η= 5)
[0049] 图9是表示在Α431细胞荷瘤小鼠中由重组双歧杆菌分泌的8C7EGFP的EGFR内 化的图。
[0050] 图10是表示对于将Α431细胞进行了皮下移植的荷瘤小鼠，静脉内给药表达8C7 毒素的重组双歧杆菌时的抗肿瘤效果的图。
[0051] 图11是表示对于将BxPC-3细胞进行皮下移植的荷瘤小鼠，静脉内给药表达8C7 毒素的重组双歧杆菌时的抗肿瘤效果的图。
[0052] 图12是表示对将来自人类非小细胞肺癌的细胞的PC-9细胞进行了皮下移植的荷 瘤小鼠静脉内给药表达8C7毒素的重组双歧杆菌时的抗肿瘤效果的图。
[0053] 图13是表示口服给药表达8C7EGFP的重组双歧杆菌的小鼠（8C7EGFP)及口服 给药作为阴性对照的含PKKT427重组双歧杆菌的小鼠（pKKT427)的各自的粪便中的抗EGFP 抗体产生量的图。
[0054] 图14是表示对于将colon26细胞进行了皮下移植的荷瘤小鼠，静脉内给药表达 8C7毒素的重组双歧杆菌时的血清中的抗8C7EGFP抗体的诱导性的图。nlgG表示阴性对 照的正常小鼠IgG。抗EGFP抗体为阳性对照。

【具体实施方式】
[0055] 下面，对本发明进行具体说明。
[0056] 1.重组专性厌氧革兰氏阳性菌
[0057] 1-1.概要及定义
[0058] 本发明的第1方面为重组专性厌氧革兰氏阳性菌（以下，经常简称为"重组细 菌"）。本发明的重组细菌为含有处于可表达状态的编码融合蛋白质的核酸的药剂递送载 体。
[0059] "专性厌氧革兰氏阳性菌"是指被分类为革兰氏阳性菌的专性厌氧菌。在此，"专 性厌氧菌"也被称为绝对厌氧菌，是具有在高氧存在下不能增殖、灭绝的性质的细菌。因此， 在哺乳动物的体内，其可以在低氧下在厌氧状态的消化器官内，主要在肠内增殖，但在溶存 氧存在的血液等体液中或通常的组织内不能增殖。"革兰氏阳性菌"为通过革兰氏染色被 染色为紫色或藏蓝色的细菌的总称。就革兰氏阳性菌而言，已知有杆菌、球菌、螺旋菌，在本 说明书中没有特别限定。由于革兰氏阳性菌不含有内毒素（Endotoxin)，因此死后也不会 放出内毒素。因此，在安全性方面，优选作为本发明的药剂递送载体。作为本发明的重组细 菌，符合的有例如双歧杆菌属（Bifidobacterium)(在本说明书中，以下将双歧杆菌属总称 为"双歧杆菌"）、梭菌属（Clostridium)。优选为双歧杆菌。这是因为，双歧杆菌不分泌外 毒素（Exotoxin)，另外，作为乳酸菌日常被利用，对于人体等的安全性被确认。双歧杆菌可 以为任一种，优选为在人的肠道内栖息的种类，具体而言，为双叉双歧杆菌（B.bifidum)、长 双歧杆菌（B.Iongum)、短双岐杆菌（B.brave)、婴儿双歧杆菌（B.infantis)及青春双岐杆 菌（B.adolescentis)〇
[0060] 1-2.构成
[0061] 本发明的专性厌氧革兰氏阳性菌含有处于可表达状态的编码融合蛋白质的核酸 (以下，经常称为"融合基因"）。以下，对赋予本发明的重组细菌以特征的融合基因及设为 可表达该基因的状态的表达盒的构成进行具体说明。
[0062] 1-2-1.融合基因的构成
[0063] 在本说明书中，"编码融合蛋白质的核酸（融合基因）"是指利用基因重组技术融 合多个基因等而构建的、编码融合蛋白质的外来性核酸。融合基因在被插入后述的表达盒 内的状态下被导入本发明的重组细菌内。
[0064] 在本说明书中，所谓"融合蛋白质"，为含有信号肽、单链抗体及功能性肽，将它们 连接而成的细胞外分泌性蛋白质。信号肽、单链抗体及功能性肽既可以直接连接，也可以经 由连接肽而间接性地连接。连接肽的长度和氨基酸序列只要不抑制单链抗体及功能性肽各 自的功能，就没有特别限定。例如，优选为在20氨基酸以下，或15氨基酸以下不自折叠的 氨基酸序列等。以下，对构成融合蛋白质的信号肽、单链抗体及功能性肽进行具体说明。
[0065] (1)信号肽
[0066] 信号肽为在细胞内生物合成的蛋白质的细胞外转移中需要的肽。通常，配置在N 末端侧具有Lys和Arg那样的正电荷的氨基酸，与其连续而配置Ala、Leu、Val、Ile、Val及 Phe那样的疏水性高的氨基酸序列。另外，在信号肽的C末端侧，可以具有促进信号肽的切 断和分泌的信号序列后插入序列和/或含有从融合蛋白质中切断信号肽的信号肽酶识别 位点的氨基酸序列。信号肽担负将在本发明的细菌内所表达的上述融合蛋白质经由存在于 膜中的转位因子等分泌到细胞外的功能。信号肽的氨基酸序列没有特别限定。可以利用可 在专性厌氧革兰氏阳性菌内起作用的公知的所有的信号序列的氨基酸序列。另外，信号肽 的氨基酸长度也没有特别限定。通常在3氨基酸?60氨基酸的范围内即可。但是，为了使 融合蛋白质的分子量不过大，优选氨基酸长度短的信号肽。
[0067] 信号肽配置于融合蛋白质的N末端侧。
[0068] (2)单链抗体
[0069] 在上述融合蛋白质中含有单链抗体。在本说明书中，"单链抗体"是指：由单链多 肽构成，且能够以单体识别靶物质并结合的抗体。这是因为，由两条链以上构成的抗体由于 分子量过大，因此在专性厌氧革兰氏阳性菌内不能表达，和不能构建具有抗体功能的适合 的立体结构的可能性高。因此，本发明的单链抗体优选每1个的分子量为35kDa以下的低 分子抗体。天然抗体及人工抗体不限。
[0070] 在本说明书中，"天然抗体"是指具有与任一种脊椎动物产生的抗体相同的氨基酸 序列的抗体。作为天然抗体的单链抗体的具体例，可列举例如骆驼科的动物产生的单链抗 体（ZhangL.，等人，1993,Nature，362 :446-448)(以下，在本说明书中，称为"骆驼科单链 抗体")。骆驼科单链抗体为由不是L链而仅由H链构成的抗体，可以仅在H链的Vh区域与 抗原结合，因此分子量约为14kDa，仅为通常的抗体的十分之一左右。另外，一般而言，具有 抗原亲和性高，对于热、酸及碱的耐性高的性质（Deffar，K.，等人，2009,AfricanJournal ofBiotechnology8(12) :2645-2652)。因此，作为本发明中的单链抗体非常适合。骆驼科 的动物物种只要能产生骆驼科单链抗体，则其种类不限。例如，来自美洲驼、羊驼、骆驼等任 一种动物物种的抗体也可以利用。
[0071] 在本说明书中，"人工抗体"为人工性地构建的抗体。例如，除在上述天然抗体 的氨基酸序列中导入有适当的变异的单链抗体之外，可列举进行了天然界中原则上不 存在的结构上的改变的单链抗体。作为后者的人工抗体的单链抗体的具体例，可列举 单链Fv(scFv:singlechainFragmentofvariableregion)(PierceCatalogand Handbook, 1994-1995,PierceChemicalCo. ,Rockford,IL)。单链Fv为在免疫球蛋白分子 中将位于L链和H链的可变区域（即分别为'及VH)通过充分的长度的柔软性连接体而连 接，具有包含于1条多肽链的结构的、分子量约35kDa以下的合成抗体。在单链Fv内，两个 可变区域可以相互自集合而形成1个功能性的抗原结合位点。
[0072] 在上述融合蛋白质中，可以含有两个以上单链抗体。但是，抗体数变多时，融合蛋 白质的分子量变大，因此单链抗体优选为数个，例如2?4个、2?3个或2个。各个单链抗 体优选用适当的连接肽连接。连接肽的长度和氨基酸序列只要不抑制各自的单链抗体的抗 原结合活性，就没有特别限定。例如，可以与连接上述的单链抗体和外毒素的连接肽相同。 含有两个以上单链抗体的情况下，各个单链抗体可以识别不同的抗原表位。含有识别作为 抗原的相同靶物质的不同的表位的两个以上单链抗体的融合蛋白质可以进一步提高抗原 亲和性。
[0073] 单链抗体的靶物质没有特别限定，优选为细胞。因此，单链抗体优选识别靶细胞的 表面抗原并结合。如上所述，本发明的重组细菌可以仅在厌氧环境下增殖，因此在生物体内 成为厌氧环境下的细胞适合作为靶细胞。具体而言，可列举肿瘤细胞或肠道上皮细胞。
[0074] 单链抗体只要在融合蛋白质中为信号肽的C末端侧，则与后述的功能性肽的顺序 没有特别限制，优选配置在功能性肽的N末端侧。
[0075] (3)功能性肽
[0076] 在上述融合蛋白质中含有功能性肽。在本说明书中，"功能性肽"是指：在生物体 内或细胞内具有特定的生物活性，例如酶活性、催化剂活性、作为基质的功能，或生物学的 抑制或亢进功能（例如细胞伤害活性）的肽。具体而言，可列举例如外毒素、荧光蛋白质或 发光蛋白质、酶、抗原肽。
[0077] 来自功能性肽的生物种不限。另外，功能性肽可以为天然型或非天然型的任一种。 天然型的功能性多肽是指天然界中存在的肽。另一方面，非天然型的功能性多肽是指：基于 天然型的功能性多肽的氨基酸序列，在不失去该能性肽具有的特有的功能的范围内，在氨 基酸序列中导入有适当的变异（进行了氨基酸的附加、缺失、置换的变异）的改变肽。
[0078] 在上述融合蛋白质中，可以含有两个以上功能性肽。但是，含有多个功能性肽的情 况下，由于融合蛋白质整体的分子量过大，因此功能性肽的总分子量设为SOkDa以下，优选 40kDa以下即可。包含两个以上的功能性肽的情况下，各自的功能性肽可以设为相同的或不 同的种类。可列举例如将外毒素与酶，或外毒素与荧光蛋白质或发光蛋白质组合成的功能 性肽。包含两个以上的功能性肽的情况下，各自的功能性肽可以直接连接，但优选以各自的 功能性肽可以有效地发挥独自的功能的方式用适当的连接肽连接。连接肽的长度和氨基酸 序列只要不抑制功能性肽的功能，就没有特别限定。通过将两个以上的不同的功能性肽包 含于1个融合蛋白质中，可以对单链抗体识别的靶物质赋予不同的功能。
[0079] 功能性肽只要在融合蛋白质中为信号肽的C末端侧，就没有特别限制，优选配置 在上述单链抗体的C末端侧。
[0080] 以下，对在本发明的重组细菌中可以作为功能性肽起作用的上述的外毒素、酶、荧 光蛋白质或发光蛋白质、抗原肽进行具体说明。
[0081] ⑴外毒素
[0082] 所谓"外毒素"（Exotoxin)，为细菌在菌体外分泌的毒性蛋白质。外毒素只要是 具有细胞伤害活性，且其碱基序列为已知的，则其种类不限。可列举例如假单胞菌毒素 (Pseudomonastoxin;PT)及其衍生物，例如从PT中除去了细胞粘接结构域的外毒素A(序 列号9)、白喉毒素（Diphtheriatoxin:DT)及其衍生物，以及菌麻蛋白（Ricin)及其衍生 物（BrinkmannU.&PastanI. , 1994,BiochimicaetBiophysicaActa,1198(1) :27-45)〇 已知有假单胞菌外毒素A被摄入癌细胞内之后，通过将EF-2进行ADP核糖基化并惰性化而 抑制蛋白质合成，发挥强的灭细胞效果。在上述单链抗体中连接有外毒素的融合蛋白质可 以作为免疫毒素（Immunotoxin)起作用。
[0083] (ii)酶
[0084] 作为功能性肽的酶的种类，只要碱基序列为已知的，就没有特别限制。既可以为对 靶物质直接作用的酶，也可以为对靶物质不直接作用、而在其周边起作用的酶。作为后者的 具体示例，可列举有助于发光的萤光素酶、过氧化物酶（例如辣根过氧化物酶）等。在上述 单链抗体上连接有酶的融合蛋白质可以作为免疫酶（Immunoenzyme)起作用。
[0085] (iii)灭光蛋白质或发光蛋白质（标记性蛋白质）
[0086] 作为功能性肽的荧光蛋白质的种类，只要碱基序列为已知的，就没有特别限制。可 以为上述天然型及非天然型的任一种。但是，从上述理由出发，优选氨基酸长度短的荧光蛋 白质。另外，激发波长、荧光波长也没有特别限定。这些波长根据状况及需要适当选择即可。 作为具体的荧光蛋白质，可列举例如CFP、RFP、DsRecUYFP、PE、PerCP、APC、GFP等。
[0087] 另外，关于发光蛋白质，只要碱基序列为已知的，其种类也没有特别限制。与上述 荧光蛋白质同样地，可以为天然型及非天然型的任一种，但优选氨基酸长度短的发光蛋白 质。作为具体的发光蛋白质，可列举例如水母素等。
[0088] (iv)抗原肽
[0089] 在本说明书中，"抗原肽"是指：包含一个以上的表位（抗原决定簇），对于给药该 肽的个体可诱导免疫应答的肽。抗原肽只要具有上述免疫应答的诱导活性，即含有一个以 上抗原表位，则其种类不限。可列举例如：来自病毒（流感病毒、C型肝炎病毒、E型肝炎病 毒、单纯疱疹病毒、人类T细胞白血病病毒-1型、AIDS病毒、西尼罗河热病毒、乳头瘤病毒、 轮状病毒、诺沃克病毒）的肽、来自HER2蛋白质、痕原虫、克氏锥虫（Trypanosoma)原虫、伤 寒杆菌的肽等。但是，以不是融合蛋白质中的单链抗体识别的抗原为前提。另外，抗原肽 的氨基酸的长度只要含有一个以上的表位，也没有特别限定。但是，如上所述，功能性肽的 总分子量某种程度上受限制，因此上限为800氨基酸以下，优选为400氨基酸以下。另外， 下限为可以含有1个表位的最小的氨基酸长度，例如为7氨基酸以上，优选8氨基酸以上， 更优选9氨基酸以上。在上述单链抗体上连接有抗原肽的融合蛋白质可以作为免疫抗原 (Immunizingantigen;抗体和抗原的融合肽）起作用。
[0090] 1-2-2.表达盒的构成
[0091] 在本说明书中，"表达盒"是指：含有上述融合基因，可以设为可将其作为融合蛋白 质表达的状态的表达系统。在本说明书中，"可表达的状态"是指：以该表达盒中所含的融 合基因可在重组细菌内表达的方式配置在基因表达中需要的元件的控制下的状态。基因表 达中需要的元件可列举启动子及终止子。
[0092]启动子只要是可在重组细菌内工作的启动子，就没有特别限制，优选使用来自专 性厌氧革兰氏阳性菌的启动子。例如，在专性厌氧革兰氏阳性菌中使用双歧杆菌的长双歧 杆菌的情况下，可列举长双歧杆菌的hup基因启动子（序列号4)。另外，在启动子中，根据 其表达控制的性质，已知有过量表达型启动子、组成型启动子、位点特异性启动子、阶段特 异性启动子，或诱导型启动子等。本发明中的表达盒中使用的启动子只要为任一种启动子， 就没有特别限定。根据需要适当选择即可。优选为过量表达型启动子或组成型启动子。在 上述表达盒中，启动子配置在比上述融合基因的起始密码子更靠上游的5M则。
[0093] 终止子只要是可以终结在重组细菌内利用上述启动子转录的基因的转录的序列， 就没有特别限定。可列举例如组蛋白样蛋白质终止子（HUT)(序列号10)。优选为与启动子 来自同一生物物种的终止子，更优选在启动子所来自的生物物种的染色体组上与该启动子 成为组的终止子。在上述表达盒中，终止子配置在比上述融合基因的终止密码子更靠下游 的3M则。
[0094] 为了使上述融合蛋白质在重组细菌内稳定地表达，可以将包含表达盒的载体作为 表达载体导入同菌体内。或者，也可以经由同源性重组而插入到同菌的染色体组内。使用表 达载体的情况下，可以在载体中使用质粒等。载体可以在本发明的重组细菌内复制，另外， 使用在菌体内含有稳定地保持的适当的选拔标志物基因的载体。载体可以为在大肠杆菌等 其它细菌内也能够复制的穿梭载体。可列举例如pKKT427、pBESAF2、pPSABl等。插入到重 组细菌的染色体组内的情况下，可以仅将融合基因以成为在重组细菌的染色体组中可表达 的状态的方式插入。即，可以在重组细菌的内在性的启动子和终止子的控制下插入融合基 因。
[0095] 表达盒可以为在1个表达盒内含有1个融合基因的单顺反子，也可以为含有两个 以上的融合基因的多顺反子。
[0096] 1-3.重组专性厌氧革兰氏阳性菌的制造方法
[0097] 本发明的重组细菌可以使用该领域中公知的分子遗传学的方法来制造。例如， 如果为上述融合基因，则使用例如Sambrook等人，MolecularCloning, 3rdEd.，Current ProtocolsinMolecularBiology(2001),ColdSpringHarborLaboratoryPress和 Ausubel等人，ShortProtocolsinMolecularBiology, 3rdEd. ,Acompendiumof MethodsfromCurrentProtocolsinMolecularBiology(1995)，JohnWiley&Sons中记 载的方法构建分别编码信号肽、单链抗体及外毒素的核酸即可。
[0098] 上述单链抗体可以以任意的靶物质为抗原。但是，该情况下，需要编码特异性地识 别靶物质并结合的抗体的基因的碱基序列信息。只要针对靶物质的抗体的碱基序列为公知 的，则该抗体的碱基序列信息可以利用该序列信息。
[0099] 在对于靶物质的抗体为未知的情况下，针对该靶物质的单克隆抗体的制作，按照 该领域中公知的方法进行即可。以下，示出其制作例。
[0100] 以作为靶的肿瘤细胞等为免疫原，对骆驼科的动物给药而进行免疫。如果需要， 则可以为了有效地进行免疫而添加佐剂。作为佐剂的实例，可列举市售的弗氏完全佐剂 (FCA)、弗氏不完全佐剂（FIA)等，可以将它们单独使用或混合使用。每1只上述动物免疫 原溶液的1次的给药量含有约50?200μg的免疫原即可。免疫的间隔没有特别限定，初 次免疫后，以数日至数周间隔，优选以1?4周间隔进行2?10次，优选5?7次追加免疫。 初次免疫之后，利用ELISA(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay)法等重复进行免疫动 物的血清中的抗体效价的测定。接着，从被免疫的动物中采取抗体形成细胞。作为抗体形 成细胞，可列举脾脏细胞、淋巴结细胞、末梢血细胞等，但优选末梢血细胞。接着，从末梢血 细胞中提取RNA，使用低聚dT引物及无规6mer引物合成cDNA。从该cDNA通过PCR扩增骆 驼科单链抗体的可变区域（Vhh区域）的基因，在PCANTAB6等噬粒载体上插入上述基因，用 电穿孔法导入于大肠杆菌TG1。使M13K07辅助噬菌体感染上述大肠杆菌TG1，回收噬菌体， 由此取得骆驼科单链抗体可变区域（Vhh区域）表达噬菌体库。标准来讲，成为IX107Pfu种 以上的库。
[0101]为了挑选表达针对靶抗原的抗体的噬菌体，进行生物淘选。其为如下方法：使抗体 噬菌体库与固定化的靶抗原反应，将没有结合的噬菌体通过清洗而除去后，使结合的噬菌 体溶出并感染大肠杆菌而增殖，将上述操作进行3次至5次，由此在靶抗原中浓缩特异的噬 菌体。使淘选的噬菌体再感染大肠杆菌TGl后，将含有Vhh插入pCANTAB噬粒载体的TGl克 隆进行分离，在各个TGl克隆中使K07辅助噬菌体感染，得到展示Vhh抗体的克隆化噬菌体。 从这些物质中选择与抗原反应的克隆。可以从取得的噬菌体中得到抗体的碱基序列。
[0102] 融合基因以可表达的方式在上述表达盒内使用分子遗传学的方法被插入。表达 盒根据需要插入到例如质粒等载体中。为了在载体上插入表达盒，可以采用用适当的限制 酶切断表达盒的5'末端及3'末端，在载体内的多克隆位点等对应的限制位点插入的方法 等。另外，载体为在本发明的重组细菌内可表达的表达载体的情况下，通过将上述融合基因 插入到该表达载体的表达控制区域内（载体内的启动子及终止子间的多克隆位点等），也 可以与构建表达盒同时构建目标表达载体。关于这些具体的方法，例如参照上述Sambrook 等人（2001)中记载的方法即可。
[0103] 目标重组细菌可以通过将上述表达载体、表达盒或融合基因导入于作为药剂递 送载体的专性厌氧革兰氏阳性菌来制造。将表达载体等向目标专性厌氧革兰氏阳性菌 内导入的方法使用该领域中公知的分子生物学的方法即可。例如，可以使用电穿孔法 (electroporation法）和磷酸钙法的公知的方法。关于这些具体的方法，例如参照上述 Sambrook等人，（2001)中记载的方法即可。
[0104] 2.抗肿瘤剂
[0105] 2-1.概要
[0106] 本发明的第2方面为抗肿瘤剂。在本发明中，"抗肿瘤剂"是指：对肿瘤细胞具有 细胞伤害活性，使该细胞至细胞凋亡，其结果可以抑制肿瘤细胞的增殖的药剂。但是，其药 效只要能够抑制肿瘤细胞的增殖即可，无需使肿瘤细胞根绝。
[0107] 本发明的抗肿瘤剂的特征在于，以第1方面的重组细菌为有效成分。根据本发明 的抗肿瘤剂，作为有效成分的重组细菌仅在肿瘤内增殖，在肿瘤内分泌免疫毒素，由此可以 有效地抑制肿瘤的增殖，使肿瘤萎缩。
[0108] 2-2.构成
[0109] 本发明的抗肿瘤剂如上所述以第1方面的重组细菌为有效成分。该情况的重组细 菌的融合基因编码识别作为靶细胞的肿瘤细胞的表面抗原并结合的单链抗体，另外，功能 性肽编码外毒素。因此，作为本发明的抗肿瘤剂的有效成分的重组细菌会分泌细胞外分泌 性抗肿瘤细胞免疫毒素。
[0110] 一般而言，肿瘤细胞在其细胞表面表达癌细胞表面抗原。可列举例如癌胚抗原、间 皮素。被融合基因编码的单链抗体优选识别这种表面抗原并结合的单链抗体。或者，在控 制EGFR(上皮生长因子受体）那样的细胞的增殖等的受体通过功能亢进而进行癌化（如果 为例示的EGFR的情况，则为非小细胞肺癌、前列腺癌等）的情况下，可以为识别成为其癌 化的原因的受体等（在上述的例示中为EGFR)的细胞外结构域并结合的单链抗体。这样， 作为有效成分的重组细菌在编码细胞外分泌性免疫毒素的融合基因中交换单链抗体部分 的碱基序列，由此可以对应于所有的肿瘤抗原。成为本发明的抗肿瘤剂的靶的肿瘤只要形 成肿瘤，不管良性、恶性，可以为任一种肿瘤。作为靶肿瘤，可列举例如：脑肿瘤、甲状腺癌、 口腔癌、食道癌、胃癌、大肠癌、咽喉癌、肺癌、肝癌、肾癌、肾上腺癌、胰腺癌、胆道癌、子宫颈 癌、子宫体癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、纤维肉瘤、肥大细胞瘤或黑色素瘤。
[0111] 本发明的重组细菌表达融合基因的情况下，作为其产物的细胞外分泌性抗肿瘤细 胞免疫毒素分泌到细胞外。所分泌的免疫毒素在单链抗体部分与作为靶物质的肿瘤细胞结 合，该细胞通过外毒素部分的细胞伤害活性而诱导细胞凋亡。
[0112] 在抗肿瘤剂中以活菌状态含有作为本发明的有效成分的重组细菌。本发明的第1 方面中记载的重组细菌在高浓度的氧存在下不能增殖，不久灭绝。因此，在生物体内，仅在 氧分压低的部位可以增殖、生存。作为这种部位的代表的例子，可列举进行性癌中所看到的 肿瘤（实体癌）的中心部位或肠道内。因此，通过注射等体内给药本发明的抗肿瘤剂的情 况下，可以成为肿瘤选择的递送性高的抗肿瘤剂。
[0113] 另外，本发明的抗肿瘤剂可以在不阻碍或不抑制作为有效成分的重组细菌的生 存、增殖、免疫毒素的表达及分泌的范围内与其它抗肿瘤剂并用。
[0114] 本发明的抗肿瘤剂可以以在活菌状态下维持或保存重组细菌为前提，作为 原则用该领域中公知的方法进行制剂化。例如，使用Remington'sPharmaceutical Sciences(MerckPublishingCo. ,Easton,Pa.)中记载的方法即可。具体的制剂化的方法 因给药方法而不同。给药方法大致区分为口服给药和非口服给药，但本发明的抗肿瘤剂的 情况下，更优选为非口服给药。
[0115] 非口服给药本发明的抗肿瘤剂的情况下，作为其具体例，可列举通过注射进行的 给药。通过注射给药本发明的抗肿瘤剂的情况下，可以作为将重组细菌与制药上可允许的 溶剂混合，根据需要加入有制药上可允许的载体的悬浮液剂制备。
[0116] "制药上可允许的溶剂"可以为水或其以外的药学上可以允许的水溶液，或油性液 体的任一种。作为水溶液，可列举例如含有生理食盐水、葡萄糖和其它补充剂的等张液。作 为补充剂，可列举例如：D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化钠、其它低浓度的非离子型 表面活性剂（例如聚山梨酸酯80(TM)、HC0_60)、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯类等。作为 油性液体，可列举香油、大豆油，也可以与作为溶解补充剂的苯甲酸苄酯、苄醇并用。另外， 也可以与缓冲剂，例如磷酸盐缓冲液、醋酸钠缓冲液；无痛化剂，例如盐酸普鲁卡因；稳定 齐U，例如苄醇、苯酚；抗氧化剂配合。
[0117] 注射剂通过与制药上允许的赋形剂、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、pH调节 剂等适当组合，以一般认可的制药实施中所要求的单位用量形态混合来进行制剂化即可。
[0118] 注射可列举例如血管内注射、淋巴管内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射 等，从作为本发明的抗肿瘤剂的有效成分的重组细菌在肿瘤内增殖，抑制该肿瘤细胞的增 殖的机制出发，在肿瘤灶的位置不明确的情况下，优选作为全身给药的血管内注射或淋巴 管内注射等的循环器内给药。血管内注射有静脉内注射及动脉内注射等，但可以为给药本 发明的抗肿瘤剂的情况任一种。另一方面，在肿瘤灶的位置确定的情况下，除上述全身给药 之外，可以为对肿瘤直接给药的局部给药。
[0119] 关于口服给药本发明的抗肿瘤剂的情况，根据后述的口服疫苗剂的项中记载的方 法即可，因此，在此省略其说明。
[0120] 本发明的抗肿瘤剂中的重组细菌的含量为原则上以1次的给药，以其菌体可在靶 肿瘤中生存且增殖的状态能够达到的量，且对适用其的受试者几乎或完全不赋予有害的副 作用的量即可。这种含量因抗肿瘤剂的靶细胞的种类、癌的进行度、肿瘤的大小、全身中的 肿瘤灶数、抗肿瘤剂的剂型及给药方法而不同，因此，考虑各自的条件而适当确定。
[0121] 本说明书的抗肿瘤剂的给药对象为具有肿瘤或具有的可能性高的受试者。在本说 明书中，"受试者"是指适用本发明的抗肿瘤剂的动物。例如为哺乳动物，优选为人、狗、猫、 马、小鼠、大鼠、兔、牛、猴子等，更优选为人。
[0122] 2-3.效果
[0123] 根据本发明的抗肿瘤剂，作为有效成分的重组细菌仅在氧分压低的肿瘤内生存及 增殖，分泌抗肿瘤细胞免疫毒素。因此，可以将该免疫毒素有效地递送至肿瘤细胞，且继续 起作用。另外，通过免疫毒素的作用而抑制肿瘤细胞的增殖，肿瘤萎缩，由此，组织中的氧分 压升高时，作为专性厌氧革兰氏阳性菌的重组细菌将不能生存，因此可以从生物体内自动 地排除。由此，可以提供一种安全且简便的治疗法，其与现有的细菌疗法相比，对于实体癌 不在非病原性的专性厌氧菌中给药其它抗肿瘤药，可以通过单独的向静脉内的给药而发挥 抗肿瘤效果。
[0124] 另外，本发明的抗肿瘤剂可以进行静脉内注射，因此，具有给予受试者的侵袭性也 低的优点。
[0125] 3.肿瘤检测标志物
[0126] 3-1.概要
[0127] 本发明的第3方面为肿瘤检测标志物。在本发明中，所谓"肿瘤检测标志物"，为可 以在生物体内检测肿瘤的标志物。
[0128] 本发明的肿瘤检测标志物的特征在于，以第1方面的重组细菌为有效成分。根据 本发明的肿瘤检测标志物，作为有效成分的重组细菌仅在肿瘤内增殖，在肿瘤内分泌酶、荧 光蛋白质或发光蛋白质，由此可以监视生物体内的肿瘤的位置和大小。
[0129] 3-2.构成
[0130] 基本的构成以第2方面的抗肿瘤剂为依据。因此，在此主要对与上述抗肿瘤剂不 同的方面进行说明，对重复的构成原则上省略。
[0131] 本发明的肿瘤检测标志物以如上所述第1方面的重组细菌为有效成分。该情况的 重组细菌的融合基因编码识别并结合作为靶细胞的肿瘤细胞的表面抗原的单链抗体，功能 性肽编码诱导标记性蛋白质或标记化的蛋白质。作为标记性蛋白质，可列举例如上述的荧 光蛋白质或发光蛋白质。另外，作为诱导标记化的蛋白质，可列举以荧光素和鲁米诺那样的 发光素或荧光素为基质的酶（萤光素酶和过氧化物酶）。因此，作为本发明的肿瘤检测标志 物的有效成分的重组细菌，会分泌细胞外分泌性抗肿瘤细胞免疫标志物（免疫标记物）。
[0132] 本发明的重组细菌表达融合基因的情况下，作为其产物的细胞外分泌性抗肿瘤细 胞免疫标志物被分泌到细胞外。所分泌的免疫标志物在单链抗体部分与作为靶物质的肿瘤 细胞结合，该细胞被标记。具体而言，功能性肽为发光蛋白质或荧光蛋白质那样的标记性蛋 白质的情况下，肿瘤细胞通过与单链抗体部分连接的这些标记性蛋白质而直接标记化。另 一方面，功能性肽为酶的情况下，肿瘤细胞通过与单链抗体部分连接的酶而进行酶标记化。
[0133] 本发明的肿瘤检测标志物可以与第2方面的抗肿瘤剂并用。该情况下，作为有效 成分的重组细菌既可以为将肿瘤检测标志物和抗肿瘤剂分别作为独立的分子分泌的，即分 泌含有识别相同靶物质的单链抗体的不同的融合蛋白质的，相同的或不同的重组细菌，也 可以为分泌在功能性蛋白质部分含有外毒素和标记性蛋白质或酶的1个融合蛋白质的重 组细菌。这些情况下，与将相同的肿瘤细胞标记化同时，可以通过外毒素的作用对肿瘤细胞 赋予细胞伤害。
[0134] 另外，也可以在不阻碍或不抑制作为有效成分的重组细菌的生存、增殖、免疫标志 物的表达及分泌的范围内与其它抗肿瘤剂并用。
[0135] 3-3.检测
[0136] 将本发明的肿瘤检测标志物给药于受试者的情况下，如果该个体具有肿瘤，则作 为有效成分的重组细菌在该肿瘤内增殖，分泌抗肿瘤细胞免疫标志物。所分泌的免疫标志 物将肿瘤细胞标记化。就被标记化的肿瘤细胞的检测而言，在免疫标志物为发光蛋白质或 荧光蛋白质那样的标记性蛋白质的情况下，检测该标记性蛋白质自身发出的发光或荧光即 可，另外，在免疫标志物为酶标记的情况下，检测给药于生物体内的荧光素等基质的酶反应 引起的发光或荧光即可。免疫标志物的检测方法没有特别限定。由于许多肿瘤存在于生物 体内部，因此，既可以在通过开腹等手术露出肿瘤的基础上检测免疫标志物，也可以从体外 非侵袭性地检测生物体内的发光或荧光。优选为从体外检测的方法。作为从体外检测来自 免疫标志物的发光或荧光的方法，没有限定，例如可以使用体内生物影像法。可以使用例 如Katz,M.H.等人，2003,CancerRes. 63 :5521_5525、Schmitt,C.A.等人，2002,Cancer Cell,I:289-298,Katz,Μ·Η·等人，2003,J.Surg.Res.，113 :151-160 等中记载的方法进行 检测。可以利用市售的IVIS成像系统（Caliper)和与其类似的装置进行检测。
[0137] 3-4.效果
[0138] 根据本发明的肿瘤检测标志物，可以基于免疫标志物从生物体外部监视生物体内 的肿瘤的位置及大小。另外，通过并用本发明的肿瘤检测标志物和第2方面的抗肿瘤剂，与 利用免疫毒素抑制肿瘤细胞的增殖同时，利用免疫标志物从生物体外部检测生物体内的肿 瘤，由此可以经时地监视肿瘤的萎缩及治愈效果。
[0139] 4. 口服疫苗剂
[0140] 4-L概要
[0141] 本发明的第4方面为口服疫苗剂。在本发明中，" 口服疫苗剂"是指：通过口服给 药，可以诱导其给药个体的肠道免疫应答的疫苗剂。
[0142] 本发明的口服疫苗剂的特征在于，以第1方面的重组细菌为有效成分。根据本发 明的口服疫苗剂，作为有效成分的重组细菌在消化器官内，特别是肠内增殖并分泌细胞外 分泌性抗原肽（免疫抗原），由此可以经由肠道粘膜对给药个体诱导对于抗原肽的免疫应 答。
[0143] 4-2.构成
[0144] 基本的构成以第2方面的抗肿瘤剂为依据。因此，在此主要对与上述抗肿瘤剂不 同的方面进行说明，对重复的构成原则上省略。
[0145] 本发明的口服疫苗剂与第2方面的抗肿瘤剂同样以第1方面的重组细菌为有效 成分。但是，与第2方面的抗肿瘤剂不同，该情况的重组细菌在融合基因编码的单链抗体 识别肠道上皮细胞等的表面抗原，或由杯细胞分泌的粘蛋白等并结合的方面及功能性肽编 码抗原肽的方面不同。上述肠道上皮细胞可以为M细胞、潘纳斯细胞、杯细胞、吸收上皮 细胞、肠道内分泌细胞的任一种。优选为存在于连滤泡上皮（FAE;follicle-associated epithelium)的M细胞。抗原肽如第1方面中记载的那样，为具有1个以上的表位，且应该 对给药的个体进行免疫应答诱导的各种肽。
[0146] 本发明的重组细菌在消化器官内表达融合基因的情况下，作为其产物的免疫抗原 可以与肠道上皮细胞或肠粘膜结合并诱导肠道免疫应答。
[0147] 本发明的口服疫苗剂的特征在于，通过口服给药对给药个体诱导免疫应答。因此， 本发明的口服疫苗剂为口服给药剂。
[0148] 本发明的口服疫苗剂除作为有效成分的重组细菌之外，可以添加制药上可允许的 载体。
[0149] "制药上可允许的载体"是指：为了容易进行药剂的制剂化及对生物体的适用，另 外维持作为有效成分的重组细菌的生存，在不阻碍或不抑制其菌体的作用的范围内添加的 物质。可列举例如：赋形剂、粘合剂、崩解剂、填充剂、乳化剂、流动添加调节剂或润滑剂。
[0150] 作为"赋形剂"，可列举例如：单糖、二糖类、环糊精及多糖类之类的糖（具体没有 限定，但含有葡萄糖、蔗糖、乳糖、棉子糖、甘露醇、山梨糖醇、肌醇、糊精、麦芽糊精、淀粉及 纤维素）、金属盐（例如磷酸钠或磷酸钙、硫酸钙、硫酸镁）、柠檬酸、酒石酸、甘氨酸、低、中、 高分子量的聚乙二醇（PEG)、普卢兰尼克，或它们的组合。
[0151] 作为"粘合剂"，可列举例如：使用有玉米、小麦、稻米或马铃薯的淀粉的淀粉糊、明 胶、黄芪胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯基吡咯烷酮等。
[0152] 作为"崩解剂"，可列举例如：上述淀粉及羧甲基淀粉、交联聚乙烯基吡咯烷酮、琼 月旨、海藻酸或海藻酸钠或它们的盐。
[0153] 作为"填充剂"，可列举例如：上述糖和/或磷酸钙（例如磷酸三钙或磷酸氢钙）。
[0154] 作为"乳化剂"，可列举例如：山梨糖醇酐脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、 丙二醇脂肪酸酯。
[0155] 作为"流动添加调节剂"及"润滑剂"，可列举例如：硅酸盐、滑石、硬脂酸盐或聚乙 二醇。
[0156] 此外，也可以根据需要含有矫味矫臭剂、悬浮剂、稀释剂、表面活性剂、增量剂、附 湿剂（付湿剤）、保湿剂（例如甘油、淀粉等）、吸附剂（例如淀粉、乳糖、高岭土、膨润土、胶 体状硅酸等）、崩解抑制剂（例如白糖、甘油硬脂酸酯、可可脂、氢化油等）、涂层剂、着色剂、 保存剂、抗氧化剂、香料、调味剂、甜味剂、缓冲剂等。根据需要适当使用如上所述的载体一 种或两种以上即可。
[0157] 作为口服疫苗剂的剂型，可以列举例如：固形剂（含有片剂、丸剂、舌下剂、胶囊 齐IJ、糖浆剂）、颗粒剂、粉剂、散剂、液剂等。进而，固形剂可以根据需要制成实施有该领域中 公知的包衣（coating)的剂型，例如糖衣片剂、明胶包衣片剂、肠溶片剂、膜包衣片剂、双重 片剂、多层片剂。关于剂型的具体的形状、大小，均为在各自的剂型中该领域中公知的剂型 的范围内即可，没有特别限定。
[0158] 4-3.效果
[0159] 根据本发明的口服疫苗剂，可以非侵袭性地口服给药目前通过注射等给药于生物 体的疫苗剂。
[0160] 根据本发明的口服疫苗剂，作为有效成分的重组细菌可以在肠道内持续地生存及 增殖，因此，可以继续地对给药个体赋予作为疫苗的免疫抗原。
[0161] 实施例
[0162] 实施例1 :表达盒的构建
[0163]以下，对作为专性厌氧革兰氏阳性菌在本实施例中使用的双歧杆菌导入表达盒的 结构及其构建方法进行说明。
[0164](1)抗EGFR抗体/假单胞菌外毒素A融合蛋白质表达盒（以下，称为"8C7毒素"） (图Ia;序列号1/氨基酸序列：序列号16)
[0165] 其为包含具有本发明的第1方面中记载的结构的融合基因的融合蛋白质表达盒。 该表达盒是设计按HindIII切断位点、来自长双歧杆菌hup基因的启动子区域（序列号 4)、来自长双歧杆菌的usp分泌信号序列（序列号5)、DTY(信号序列后插入序列）、用连接 肽（GGSGG) 2编码序列（序列号6)连接的2个抗EGFR美洲驼单链抗体编码序列（PMP8C7 ; 序列号7及8 ;日本特开2008-534933,日本特表2009-511032)、作为外毒素的除去了参与 细胞粘接的结构域的假单胞菌外毒素A编码序列（序列号9;BrinkmannU.，等人，1994， BiochimicaetBiophysicaActa, 1198:27-45)、终止密码子、SpeI位点、来自组蛋白样蛋 白质的终止子（HUT)(序列号10)、以及NotI切断位点的顺序连接的融合基因并进行DNA合 成而制作的。其后，在pBluescript质粒（lifetechnologies)中进行克隆，确认DNA序列。
[0166] (2)抗EGFR抗体/EGFP融合蛋白质表达盒（以下，称为"8C7EGFP"）（图Ib;序 列号2)
[0167] 本表达盒是取代外毒素而连接有荧光蛋白质EGFP的对照及检测定位的表达盒。 该表达盒从HindIII切断位点至2个抗EGFR羊驼单链抗体具有与上述8C7毒素相同的结 构，设计与其连续而再按连接肽（GGSGG)2编码序列、EGFP(ZhangG.，等人，1996,Biochem BiophysResCommun，227(3) :707_11)、终止密码子、SpeI切断位点、HUT、His_Tag序列、以 及NotI切断位点的顺序连接的基因并进行DNA合成而制作的。其后，在pBluescript质粒 中进行克隆，确认DNA序列。
[0168] (3)假单胞菌外毒素A蛋白质表达盒（以下，称为"毒素对照（图Ic;序列号3)
[0169] 本表达盒为仅由不含有单链抗体部分的外毒素构成的对照表达盒。该表达盒具有 在从8C7毒素中除去含有连接肽的2个抗EGFR美洲驼单链抗体编码序列、除去了细胞粘接 结构域的假单胞菌外毒素A编码序列（序列号9)的C末端附加有His-Tag序列的结构，进 行DNA合成而制作的。其后，在pBluescript质粒中进行克隆，确认DNA序列。
[0170] 实施例2:融合蛋白质8C7毒素的细胞增殖抑制活性
[0171] 在本实施例中，对表达实施例1中记载的8C7毒素等融合蛋白质的重组大肠杆菌 BL21 (DE3)的制备和该融合蛋白质的细胞增殖抑制活性进行了验证。
[0172] (1)大肠杆菌表达用Ec-8C7毒素、Ec-毒素对照及Ec-8C7EGFP的表达载体的构 建
[0173] 大肠杆菌表达用Ec-8C7毒素表达盒以插入pBluescript质粒中的8C7毒素为模 板，使用序列号11及12的引物试剂盒进行利用PCR的扩增。就PCR的条件而言，将使用作 为DNA聚合酶的PrimeSTARGXLDNAPolymerase(TaKaRaBio,大津市，日本）以在 95°C下 1分钟的1个循环，在98°C下10秒、在60°C下15秒、在68°C下2分钟的25个循环实施。 就扩增产物而言，使用MinElute柱（Qiagen社）按照所附的说明书进行纯化，用NdeI及 NotI进行限制酶消化后，用1. 2%琼脂糖进行电泳，从凝胶中切出目标条带，使用DNA凝胶 提取试剂盒（Qiagen社）按照所附的说明书进行纯化分离。将其插入pET_22b(+)(Novagen 社）的多克隆位点（MCS)对应的限制位点，构建具有用StrepTag(SchmidtT.G.，Skerra A. ,2007,NatProtoc. 2 (6) :1528-35)、（GGSGG)2连接肽连接的 2 个PMP8C7、除去了参与细 胞粘接的结构域的假单胞菌外毒素A的序列、HisTag的Ec-8C7毒素（图Id)。
[0174] 就大肠杆菌表达用Ec_8C7EGFP表达盒而言，以插入pBluescript质粒的抗EGFR 抗体/EGFP融合蛋白质表达盒为模板，使用序列号13及14的引物试剂盒进行利用PCR的 扩增。PCR的条件设为与上述相同。扩增产物使用MinElute柱按照所附的说明书进行纯 化，用NdeI及NotI进行限制酶消化后，用1. 2%琼脂糖进行电泳，从凝胶中切出目标条带， 使用DNA凝胶提取试剂盒按照所附的说明书进行纯化分离。将其插入pET-22b(+)的MCS 的对应的限制位点，构建具有用Str印Tag、（GGSGG)2连接肽连接的2个PMP8C7、（GGSGG) 2 连接肽、绿色荧光蛋白质（EGFP)、HisTag的Ec-8C7EGFP(图Ie)。
[0175] 就大肠杆菌表达用Ec-毒素对照表达盒而言，以插入pBluescript质粒中的毒素 对照表达盒为模板，使用序列号15及12的引物试剂盒进行利用PCR的扩增。PCR的条件设 为与上述相同。就扩增产物而言，使用MinElute柱按照所附的说明书进行纯化，用NdeI及 NotI进行限制酶消化后，用1. 5%琼脂糖进行电泳，从凝胶中切出目标条带，使用DNA凝胶 提取试剂盒按照所附的说明书进行纯化分离。将其插入PET-22M+)的MCS的对应的限制 位点，构建具有StrepTag、除去了参与细胞粘接的结构域的假单胞菌外毒素A的序列、His Tag的Ec-毒素对照（图If)。
[0176] (2)Ec-8C7毒素、Ec-毒素对照及Ec-8C7EGFP的表达及纯化
[0177] 将含有上述（1)中构建的各表达盒的pET_22b(+)质粒DNA按照所附的说明书导 入于大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞（Novage社）或BL21Star?(DE3)0neShot感受态细 胞（Invitrogen社）。在以下的条件进行来自各转化体的重组蛋白质的表达。将大肠杆菌 BL21 (DE3)转化体克隆在2YTA培养基（含有100μg/mL的氨苄青霉素的2YT培养基）中于 37°C进行培养，在达到0D600 = 0. 5?0. 6的时刻以成为终浓度ImM(在BL21 (DE3)StarTM 株中为 0.5mM)的方式在培养基中加入IPTG(Isopropyl_i3-D-thiogalactopyranoside， TaKaRaBio社），在30°C下培养3小时。收集细菌后，再悬浮于每IOOmL培养液IOmL的提 取缓冲液（50mM磷酸钠pH7. 8,300mMNaCl，无EDTA蛋白酶抑制剂混合物（Roche社））中， 在冰中使用Sonifier250(Branson社），在OutputControl2、Dutycycle50%的条件下 进行超声波处理，将菌体破碎。将处理后的悬浮液以15000rpm在4°C下离心分离15分钟， 回收上清液。融合蛋白质的纯化使用HisTrap柱（GEHealthcareUK，Buckinghamshire， England)。将超声波处理悬浮液的离心上清液直接悬挂于HisTrap柱,用结合缓冲液（20mM 磷酸钠，〇. 5MNaCl，20mM咪唑pH7. 4)清洗柱之后，用含有500mM咪唑的溶出液使融合蛋白 质溶出。
[0178] 将纯化的结果通过使用针对位于全部的融合蛋白质的C末端的His标签的抗 HisTag抗体的蛋白质印迹进行检测并确认。其结果，分别在预料的位置检测到条带（数 据未示出）。另外，对融合蛋白质为全长，使用与重组蛋白质的N末端的StrepTag结合的 StrepTactinHRP(Bio-rad社），在清洗膜后加入化学发光试剂LuminataTMForte,使用 ImageQuantLAS4000(富士膜/GE)进行检测。将结果示于图2。由上述结果确认：可以纯 化全长的Ec-8C7毒素、Ec-8C7EGFP、Ec-毒素对照。得到的融合蛋白质添加10%甘油，在 4°C下保存。
[0179] (3)Ec_8C7毒素的细胞增殖抑制活性
[0180] 研究了相对于过量表达EGFR的A431细胞（来自人类皮肤癌的细胞，由日本筑 波市的理化学研究所生物资源中心获得），各融合蛋白质对EGFR的表达量少的BxPC-3 细胞（来自人类胰腺癌的细胞，由美国马纳萨斯的ATCC获得）（FoliaPharmacol. Jpn. 2011，137 ;31-41)及HT-29细胞（来自人类结肠癌的细胞、由美国马纳萨斯的ATCC获 得）的增殖抑制作用。在？&1(：〇1196孔培养板出6(^〇110。1^118〇11社）上，在2.5\10 4细 胞/50μL培养基（含有 0.2%胎牛血清（TissueCultureBiologicals，Tulare，USA)的 DMEM培养基）/孔中加入细胞，培养3小时后，添加以400、200、100、50及25ng/mL含有由上 述（2)纯化的Ec-8C7毒素、Ec-8C7EGFP、Ec-毒素对照的培养基各50yL。上述3种的细胞 株在含有0. 2 %胎牛血清的DMEM培养基中培养3天的条件下，细胞没有死，但是几乎不增 殖。Ec-8C7 毒素、Ec-8C7EGFP、Ec-毒素对照使用以HisTrap柱（GEHealthcareNJ,USA) 纯化的样品，因此，考虑在添加于培养基时混入的缓冲液成分，放置缓冲液对照。在培养第 三天加入10μL的MTT试剂（NacalaiTesque社）。进而，在培养2小时后，以100μL/孔 加入溶胞产物，用吸量管将细胞溶解，测定〇D57(lnm的吸光度。将无细胞、添加培养基的孔的 测定值作为背景值，从总测定值中减去。将各稀释的缓冲液对照的孔设为100%，用其相对 值表示。通过重复进行分析，取2孔的平均值。
[0181] 图3表示结果。图3a为Α431细胞的结果，图3b为BxPC-3细胞的结果，图3c为 HT-29细胞的结果。如图3a所示，就Ec-8C7毒素而言，对A431细胞检测到浓度依赖的增 殖抑制活性，IC5tl为0. 68nmol/L(47. 5ng/mL)。另一方面，在作为阴性对照的Ec-毒素对照 中，没有检测到增殖抑制活性。因此，证明了Ec-8C7毒素的靶细胞特异的细胞增殖抑制活 性。该结果暗示：Ec-8C7毒素在抗EGFR抗体部分与EGFR结合，产生EGFR内化（McClintock J.L.&CeresaB.P·，2010,InvestOphthalmolVisSci. 51 (7) 3455-3461)而被摄摄入细 胞内，其后，外毒素部分向细胞质内迁移，将EF-2进行ADP核糖基化并惰性化，由此可抑制 A431细胞的蛋白质合成。另外，用作为阴性对照的Ec-8C7EGFP没有检测到细胞增殖抑制 活性则暗示：即使Ec-8C7EGFP在抗EGFR抗体部分与EGFR结合，也没有外毒素部分，由此 不能抑制EGFR的信号递送，没有给细胞增殖带来影响。另一方面，如图3b所示，对于EGFR 的表达量少的BxPC-3细胞，Ec-8C7毒素仅检测到弱的增殖抑制活性（在200ng/mL的8C7 毒素中约为40%抑制活性），另外，如图3c所示，没有检测到Ec-8C7毒素对于HT-29细胞 的增殖抑制活性。
[0182] 实施例3 :与8C7EGFP的肿瘤细胞的结合及与EGFRE⑶的解离常数的测定
[0183] 在本实施例中，研究了实施例2中记载的Ec-8C7EGFP与表达EGFR的活细胞的结 合。
[0184] (1)与Ec-8C7EGFP的肿瘤细胞的结合
[0185]在Falcon24 孔板（BectonDickinson社）上，在 2. 5XIO5细胞/0·5mL培养基 (含有0. 2%胎牛血清的DMEM培养基）/孔中分别接种EGFR的过量表达株A431细胞及低 表达株HT-29细胞，第二天，在包含含有实施例2中纯化的Ec-8C7EGFPlOyg/mL的0. 2% 胎牛血清的DMEM培养基上进行交换。2小时培养后，除去上述培养基，用PBS(无Mg2+、Ca2+ 的磷酸盐缓冲盐水）清洗2次，在0. 5mL/孔中加入PBS，用荧光显微镜（ECLIPSTi，Nikon) 进行观察。由于使用用HisTrap柱纯化的Ec-8C7EGFP，因此，考虑在培养基上添加时混入的 缓冲液成分，设置了缓冲液对照。
[0186] 图4a及4b表示结果。在图4a中，在A431细胞的表面检测到EC-8C7EGFP的荧光， 可以检测Ec-8C7 EGFP与A431细胞的结合。另外，在一部分细胞中确认了EGFR的内化。另 一方面可知：在图4b的HT-29细胞中，没有检测到Ec-8C7EGFP的荧光，Ec-8C7 EGFP没有 与HT-29细胞结合。
[0187] (2)Ec_8C7EGFP的EGFR内化的检测
[0188] 使用A431细胞经时地观察EGFR内化。将A431细胞在1父106细胞/2!^培养基 (含有10 %胎牛血清的DMEM培养基）/35mmΦ平皿中接种于3个平皿中，培养1天后，在含 有10μg/mL的Ec-8C7EGFP的培养基（含有10 %胎牛血清的DMEM培养基）上进行交换， 1个在4°C下培养1小时，1个在37°C下培养2小时，另一个在37°C下培养4小时。分别用 2mL的PBS/平皿清洗2次，用荧光显微镜进行观察。
[0189] 图4C表示结果。在37°C的条件下，可以在大部分的细胞中观察EGFR内化。
[0190] (3)Ec_8C7EGFP和EGFR细胞外结构域（ECD!extracellulardomain)的解离常 数（Kd)的测定
[0191]将Ec-8C7EGFP和重组人类EGFRECD(SinoBiological，Beijing，China)的结 合亲和性用使用有Biac〇re3000(GEHealthcare，NJ，USA)的表面共振法进行分析。测 定方法用单循环动力学法（AnalyticalBiochemistryVolume349,Issue1，IFebruary 2006, 136-147 页）进行，将Ec-8C7EGFP按照I. 56nM(第I次）、3· 13nM(第 2 次）、 6. 25nM(第3次）、12. 5nM(第4次）、25nM(第5次）的顺序连续添加并进行测定。
[0192] 图5表示结果。Ec-8C7EGFP和重组人类EGFRECD的Kd值为llnm。
[0193] 实施例4:重组双歧杆菌的肿瘤蓄积性和对小鼠的影响
[0194] 在裸小鼠背部移植A431细胞而形成实体癌的异种移植动物模型中，验证了向静 脉内给药表达并分泌8C7毒素的重组双歧杆菌时的该重组双歧杆菌的肿瘤蓄积性和对小 鼠的影响。
[0195] (1)8C7毒素的表达载体及表达8C7毒素的重组双歧杆菌的构建
[0196]载体使用含有pTB6(TanakaK，等人，2005，BiosciBiotechnolBiochem. 69 (2): 422-425)的复制子的双歧杆菌和大肠杆菌的穿梭载体pKKT427 (图6;YasuiK，等 人，2009,NucleicAcidsRes. ,37(1) :e3)。在pKKT427 的MCS(多克隆位点）中的HindIII 和NotI之间插入双歧杆菌表达盒（图la)。在长双歧杆菌105-A(由原京都药科大学加纳 康正教授供给）中使用电穿孔法导入构建的表达载体。就电穿孔的条件而言，在2. 4kV/cm、 25μF、200Ω的条件下进行。将得到的重组双歧杆菌再悬浮于生理食盐水，制备裸小鼠给药 液。
[0197] (2)重组双歧杆菌的肿瘤蓄积性
[0198] 在6周龄的雌性KSN/Slc裸小鼠（日本SLC，滨松，日本）中皮下移植2Χ106的 A431细胞，在形成实体癌的2周后，将上述（1)中制备的重组双歧杆菌I. 5XIO9个向静脉 内给药。阴性对照使用没有向静脉内给药重组双歧杆菌的裸小鼠。为了补充体内的重组 双歧杆菌的营养，对全部小鼠向腹腔内给药每天ImL的20 %半乳糖苷果糖（和光纯药，大 阪，日本）。给药后，在1周后从小鼠中回收肿瘤（n= 5、平均值277.2mm3)及作为对照的 血液及脾脏，血液直接均质化，肿瘤和脾脏在MRS培养基（LactobacilliMRSBroth(Difco Laboratories,Detroit,MI)、50mM鹿糖、3. 4mg/mT,L-抗坏血酸钠盐及 0· 2mg/mLL-疏基丙 氨酸盐酸盐）中均质化，其后，在含有100μg/mL壮观霉素的MRS琼脂培养基（在上述MRS 液体培养基上添加1.5%的细菌琼脂（DifcoLaboratories)而制备）上进行涂布，在容器 或袋内加入作为脱氧剂的AnaeroPack-Kenki(三菱气体化学，东京，日本），在设为双歧杆 菌可以增殖的程度的低氧状态的厌氧环境下在37°C下培养2天，测量在MRS选择琼脂培养 基上出现的菌落。
[0199] 图7表示结果。如该图所示，可知：与血液或脾脏相比，重组双歧杆菌以100倍至 1，〇〇〇倍的选择性蓄积在肿瘤中。
[0200] (3)重组双歧杆菌的静脉内给药引起的体重及GPT值的变化
[0201] 在给药有（2)的重组双歧杆菌的裸小鼠中，在重组双歧杆菌的静脉内给药日（第0 天）和给药后1周（第7天）肿瘤回收时测量体重。作为阴性对照，使用没有向静脉内给 药重组双歧杆菌的A431细胞移植小鼠。各组以η= 5实施。
[0202] 表1表示结果。
[0203]表1
[0204]

【权利要求】
1. 一种重组专性厌氧革兰氏阳性菌，其含有处于可表达状态的编码含有信号肽、单链 抗体及一种或两种以上的功能性肽的融合蛋白质的核酸。
2. 如权利要求1所述的重组专性厌氧革兰氏阳性菌，其中，专性厌氧革兰氏阳性菌为 双歧杆菌属（bifidobacterium)。
3. 如权利要求1或2所述的重组专性厌氧革兰氏阳性菌，其中，所述单链抗体为分子量 在35kDa以下的低分子抗体。
4. 如权利要求1?3中任一项所述的重组专性厌氧革兰氏阳性菌，其中，所述核酸编码 两个以上的单链抗体。
5. 如权利要求1?4中任一项所述的重组专性厌氧革兰氏阳性菌，其中，所述单链抗体 识别靶细胞的表面抗原并进行结合。
6. 如权利要求5所述的重组专性厌氧革兰氏阳性菌，其中，所述靶细胞为肿瘤细胞。
7. 如权利要求5或6所述的重组专性厌氧革兰氏阳性菌，其中，所述功能性肽为外毒素 和/或标记性蛋白质。
8. 如权利要求7所述的重组专性厌氧革兰氏阳性菌，其中，所述标记性蛋白质为荧光 蛋白质或发光蛋白质。
9. 如权利要求1?5中任一项所述的重组专性厌氧革兰氏阳性菌，其中，所述功能性肽 为疫苗抗原肽。
10. -种抗肿瘤剂，其以权利要求7所述的重组专性厌氧革兰氏阳性菌为有效成分。
11. 一种肿瘤检测标志物，其以权利要求7或8所述的重组专性厌氧革兰氏阳性菌为有 效成分。
12. -种口服疫苗剂，其以权利要求9所述的重组专性厌氧革兰氏阳性菌为有效成分。
【文档编号】C12N15/09GK104428408SQ201380036660
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年7月12日 优先权日:2012年7月13日
【发明者】平裕一郎, 石田功 申请人:学校法人帝京平成大学