用于治疗念珠菌病的组合物和方法

专利名称：用于治疗念珠菌病的组合物和方法
技术领域：
本发明涉及新的口服疫苗，尤其涉及用于预防或治疗念珠菌病的口服疫苗。发明背景 白色念珠菌(Candida albicans)为酵母样二型真菌，位于人的口腔、阴道和胃肠 道粘膜表面，是正常微生物菌群的一部分。它也是机会致病菌，可以引起局部粘膜炎，如口 炎和阴道炎，或侵入引起全身感染。显然，不同的结果反映了宿主_寄生物间的不同平衡关系。虽然保护机制还没有 完全阐明，但认为细胞机制(特别是T淋巴细胞-巨噬细胞组分)对局部和全身的微生物 扩散具有重要作用。粘膜炎的临床范围包括复发件/持续件口炎这是老年人的普遍问题，特别是那些有假牙(托牙)的老年人。后者的约三分之 二发展为与白色念珠菌定植有关的粘膜炎，其中的白色念珠菌定植于积聚在假牙上的斑块 内。有意思的是，在这种情况下仅有较少的抗原量，并可能参与特异的宿主反应。类似的真 菌问题也可见于青年人，通常是戴假牙的年轻人。对细胞免疫缺陷的受试者(特别是患HIV 病的受试者)持续的白色念珠菌相关的口炎(或鹅口疮)是普遍且值得注意的并发症。受 试者使用通常用于治疗哮喘的吸入性类固醇一般会发生鹅口疮，原因是类固醇引起粘膜防 御能力的下调。复发件外阴阴道念珠菌病普遍发生于妇女(3-5% )月经周期雌激素减少(月经前)时，这时“粘膜门”关 闭，特异性T细胞不能进入粘膜组织。本组中“T细胞池”减少，因此这时将白色念珠菌限制 在生殖道的脆弱控制受到挑战，导致临床粘膜炎。食管炎这是免疫受损患者共同和受到关注的并发症，大部分与全身性疾病如癌症有关或 与采取免疫抑制治疗有关。它经常是无症状的，在鹅口疮后成为病灶，由此产生危及生命的 全身扩散。因此，能最大发挥粘膜T细胞功能进而降低局部/全身疾病危险的口服疫苗，对 于预防(危险人群)或治疗(临床粘膜炎)上胃肠道白色念珠菌感染是相当有用的，特别 是免疫抑制的患者应该是这种疫苗的主要适应症。肠定棺据认为白色念珠菌在肠道定植引起特别大范围的疾病和症状，从慢性疲劳到“全 身过敏”。围绕“控制念珠菌”的工业已经成长起来。可降低肠道念珠菌几个数量级的疫苗 是有益的，而且是一个吸引人的治疗建议。其它粘膜位置和情况
支气管受损时，特别是在重复应用抗生素后或有粘膜损伤时，白色念珠菌可以定 植。偶见受试者的下泌尿道也可以发生白色念珠菌定植。更常见的问题是重复应用抗生素 后一个或其它部位复发或持续的“鹅口疮”。这种情况提供了临床上应用疫苗的机会，特别 是以预防的方式，即当长期应用某种抗生素时，通过施与疫苗可以降低白色念珠菌过度生 长的危险。因此，需要改进的用于预防和/或治疗念珠菌病的疫苗和方法。本发明的一个目的是至少克服或改善以前治疗的某些缺点，或提供一种有用的选择。发明概述本发明部分来自意外的发现，即通过口服白色念珠菌芽生孢子获得免疫可以预防 生物体引起的感染或治疗已建立的感染。而以前的研究认为侵入性的菌丝形态是最理想的 免疫原。本发明也是基于观察到念珠菌属的芽生孢子形态可以促进T细胞-巨噬细胞组分 分泌特殊的细胞因子如干扰素IFN-Y和一氧化氮(NO)到唾液中。这样不仅能创造一个对 真菌有毒的环境，而且可以阻止真菌向菌丝(侵害性的)形态转化。这种效应预期对所有 粘膜表面和分泌物都相似。第一方面，提供了适于口服施用的组合物，该组合物包含灭活的白色念珠菌和佐 齐U，用于预防性或治疗性治疗口腔、鼻咽或呼吸道的白色念珠菌定植和/或感染。第二发面，提供了适于口服施用的组合物，该组合物包含白色念珠菌的芽生孢子 形式，用于预防性或治疗性治疗由于白色念珠菌定植和/或感染引起的疾病。优选地，疾病选自口、鼻咽或呼吸道的白色念珠菌定植和/或感染。组合物可为包括整个生物体(灭活生物体或减毒活生物体)、生物体的超声产物、 或包含一种或多种单一抗原的生物体碎片的疫苗。当用整个生物体时，尤其优选芽生孢子形态，但也可使用菌丝形态。本发明的组合物也可包含常用的药用载体和佐剂。当包含佐剂时，所选择的佐剂 优选地具有诱导Thl反应的能力。本发明的组合物也可包含益生素，优选地为益生菌。有利地，该益生菌可选自乳酸 菌且优选的细菌为嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)。第三方面，提供了根据第一方面的组合物在制备用于预防性或治疗性治疗口腔、 鼻咽或呼吸道的白色念珠菌定植和/或感染的药物中的用途。第四方面，提供了根据第二方面的组合物在制备用于预防性或治疗性治疗由于白 色念珠菌定植和/或感染引起的疾病的药物中的用途。优选的疾病是粘膜炎。更优选的疾病选自复发/持续的口炎、复发的外阴阴道念珠菌病、食管炎和下泌 尿道或肠定植。根据本发明的治疗方法可进一步包括施用一种或多种佐剂。佐剂优选地选择可以引起经典Thl反应的佐剂(例如BCG)，或如果需要可选择引 起Th2反应的佐剂(例如霍乱毒素B亚单位等)或简化的疫苗(如百日咳)。佐剂可被施与益生素替代或补充以益生素，其中所述益生素如微生物，诸如乳杆 菌属。更优选乳杆菌属微生物，特别是嗜酸乳杆菌。但是，其它的细菌例如发酵乳杆菌和牝牛分枝杆菌也可使用。此外，可以引起Thl反应的微生物或其组分也是其它的合适佐剂。在本发明上下文中所用的术语“益生素”包括不必起常规益生素作用但如此处所述可诱导T 细胞反应或改变细胞因子模式的制剂。益生素和/或佐剂可以口服或肠胃外施用，并且可以在应用本发明化合物治疗之 前、之中或停止之后施用益生素，在本发明的化合物治疗之前、之中或之后施用益生素是尤 其优选的，因为它们可以改变细胞因子的模式并因此达到最佳的细胞因子平衡从而进行有 效的治疗。第五方面，提供了一种监测疫苗需要量或疫苗功效的方法，包括测定IFN-γ、NO 和/或IL-4。第六方面，提供了鉴定可有效作为疫苗或疫苗成分的念珠菌分离株和/或念珠菌 抗原的方法，包括测定小鼠模型的IFN-Y、NO、IL-12和/或IL-4。为方便起见，可以测定 唾液样本，但也可以用血液样本和组织样本如淋巴结样本等。当用淋巴结或类似的淋巴样 组织时，可对表达相关细胞因子的细胞构成比进行评估。附图简述

图1、白色念珠菌在BALB/c和DBA/2小鼠的定植模式A(左图)用白色念珠菌(lxl08CFU/mL)拭口腔粘膜感染小鼠。在所示的不同的 时间，通过拭口腔测定定植水平。结果以3 5只小鼠的均值士标准误表示。*p<0.05，
0.001表示来自BALB/c和DBA/2小鼠的值之间有显著性差异。B(右图)口腔组 织中芽生孢子和菌丝的数目以苏木精依红和过碘酸希夫染色后光镜下(放大40倍)计数。 结果以3 5只小鼠的均值士标准误表示。图2、淋巴细胞增殖颈淋巴结(CLN)细胞以念珠菌抗原刺激或不刺激4天后，进行胸腺嘧啶脱氧核苷 掺入测定。结果以3只小鼠的cpm均值士标准误表示。与来自未刺激细胞的值比较
< 0. 05，**p < 0. 01。图3、白色念珠菌特异的血清IgG和IgA抗体ELISA测定感染小鼠血清和唾液的白色念珠菌特异的IgG和IgA抗体水平。0时 间点表示未感染的小鼠。结果以3只小鼠的均值士标准误表示。对来自BALB/c或DBA/2 小鼠的值进行比较* P <0. 05 "ρ <0.01。图4、CLN细胞中IL-4和IFN- y mRNA基因的表达从感染白色念珠菌的小鼠CLN细胞提取总RNA，用细胞因子特异的引物进行 RT-PCR分析。以G3DPH信息校正每个样本的等值上样量。图5、体外刺激CLN细胞IL-4， IL-12和IFN-Y的产生来自感染小鼠的CLN细胞用白色念珠菌抗原刺激3天，然后ELISA测定培养上清 的细胞因子。0时间点表示未感染的小鼠。结果以3至5只小鼠的均值士标准误表示，对 来自BALB/c或DBA/2小鼠的值进行比较* ρ < 0. 05，* * ρ < 0. 01。图6、抗IL-4抗体处理对抵抗急性白色念珠菌感染的影响在用酵母细胞攻击后的第1、3、5天，BALB/c小鼠腹腔注射大鼠抗IL_4或纯化的 匹配大鼠IgGl同种型30 μ g。在不同的天，测定口腔酵母的数目，结果以3至5只小鼠的平 均菌落形成单位(CFU) 士标准误表示，\ ρ < 0. 05。
图7、用芽生孢子⑶或菌丝(H)经口免疫的小鼠对白色念珠菌的清除率。图8、经口免疫对唾液IFN- γ水平的影响图9、L-MLNA处理对小鼠白色念珠菌清除率的影响 图10、比较经口和皮下施用念珠菌疫苗(Candivax)对免疫功效的影响图11、用念珠菌可溶性抗原进行经口免疫图12、Candivax对念珠菌抗原刺激引起T细胞增殖的作用图13、免疫前和免疫后用白色念珠菌攻击后的口腔定植图14、免疫前和免疫后用白色念珠菌攻击后的肠定植图15、共同施用乳杆菌和Candivax对防止口腔念珠菌病的保护作用现参照非限定性的实施例对本发明进行更加详细的描述。
实施例实施例1 材料和一般方法小鼠除非另外说明，雄性BALB/c (H_2d)和DBA/2 (H_2d)小鼠，6-8周龄，购自西澳大利 亚珀斯动物资源中心。每组3-5只，可随意获取食物和水。所有小鼠适应新环境1周后再 使用。真菌培养白色念珠菌分离株3630来自澳大利亚悉尼皇家北海岸医院国家重点实验室。酵 母细胞培养于25°C水浴摇床中的沙氏葡萄糖肉汤培养基(Oxoid，Hampshire, UK)48小时。 芽生孢子转入新鲜的培养基，于25°C继续培养18小时。离心收集芽生孢子，磷酸缓冲盐水 (PBS)洗两次，然后用时在PBS中调整芽生孢子为IO8个/ml。念珠菌抗原新鲜培养的白色念珠菌分离株3630以IXlOicVml重悬于PBS，然后用MSE Soniprep 设备超声，振幅为10，间歇冷却并超声30个循环。超声产物2000g离心10分钟，收集上清 并在PBS中透析。评估蛋白后，溶液无菌过滤，分装储存于-20°C备用。口腔感染小鼠腹膜内注射75mL氯胺酮=Xylazil (100mg/ml 20mg/mL)麻醉。简述如下， PBS中108/ml芽生孢子于14000g离心5分钟。以细尖无菌拭子(Corsham，Wiltshire，UK) 取沉淀，然后通过局部施用经口接种至口腔。经口感染的定量除非另外说明，每组3-5只小鼠在不同时间点处死，确定口腔粘膜白色念珠菌的 数目。口腔(即颊、舌和软腭)用棉签的尖端彻底擦拭。拭后，切除棉签末端并置于含有 Iml PBS的微量离心管中。该酵母细胞培养前，涡悬混勻重悬，于补充了氯霉素(0.05g/L) 的沙氏葡萄糖琼脂(0xoid，UK)中，10倍比稀释，37°C 48小时。为了进行组化研究，口腔组 织固定于10%甲醛水溶液中，石蜡包埋。组织切片为5mm厚，固定于玻璃载玻片上，然后以 苏木精和伊红(H&E)或过碘酸希夫染色真菌。光镜下计数芽生孢子和菌丝的数目。结果取 5个40倍放大视野的平均计数。细胞分离和流式细胞测定
颈淋巴结(CLN)切自3-5只白色念珠菌感染后的每个时间点的小鼠，并制备单细 胞悬液(17)。合并的颈淋巴结细胞群在两色模式下用Lysis2软件和FASCan流式细胞仪 (Bectin-Dickinson, Mountain View, Calif)分析。用于染色的单克隆抗体是异硫氰酸荧 光素(FITC)-连接的(H129. 19抗-CD4和H57-597抗-a/b TCR)或藻红蛋白(PE)-连接的 (H53-6. 7抗-CD8a，ID3抗-CD 19和GL3抗_a/d TCR)。FITC或PE连接的同种型匹配抗体 作为阴性对照。所有单克隆抗体购自Pharmingen。每个分析样品至少用10000个活细胞。淋巴细胞增殖检测
合并的颈淋巴结细胞于含10% FCS的RPMI 1640培养基中培养，96孔圆底微滴定 板(Nunc，Denmark)，每孔0. 2xl06细胞，3个平行孔。将白色念珠菌抗原加入每孔，终浓度 为2.5mg/mL。于潮湿的含5% CO2的培养箱中培养72小时。在收获和计数前的最后6小 时以IyCi 3H-标记的胸腺嘧啶脱氧核苷(Amersham，Aylesbury, UK)脉冲式刺激细胞，然 后进行胸腺嘧啶脱氧核苷掺入测定。结果以平均cpm+标准误表示。抗体测定用微量板ELISA测定法定量唾液和血清中的特异抗体。酶标板孔底以溶于0. IM 硼酸钠缓冲的生理盐水(PH8.4)的50 μ g/mL白色念珠菌抗原包被。适当系列稀释的唾液 和血清加到每个孔中。加入生物素标记的山羊抗小鼠IgG或IgA(Sigma-Aldrich)后加入 碱性磷酸酶连接的链亲合素(AMRAD，澳大利亚)，检测结合的抗体。加入底物溶液后，双样 本的光密度在ELISA酶标仪(BioRad，Richmond, VA) 450nm处读取。RT-PCR已描述了从淋巴样细胞提取RNA并扩增合成的cDNA(31，42)。简述如下，IOmL 从4xl06/mL颈淋巴结细胞提取的总RNA加到20mL含有6mL 5X RT反应缓冲液(250mM Tris-HCl，375mM KCl 禾Π 15mMMgC12)、3mL IOOmM 二硫苏糖醇、1. 5mL 脱氧核苷酸(IOmM)， ImLRNA 酶抑制剂(40U/mL)，0. 5mL MMLV-RT (200U/mL)，3mL 寡聚-(dT) 15，3mL 乙酰化 BSA(lmg/mL)和2mL DEPC处理水的RT混合液中。cDNA合成为42°C 1小时，然后72°C 10 分钟。PCR扩增为加入5mL第一链cDNA到PCR混合液中，其中PCR混合液包括ImM各种引 物(20mM), ImL 4mM dNTP 混合液，5mL IOX PCR 缓冲液，1.2mL 1. 5mMMgCl2,0. 2mL Taq DNA 聚合酶(50U/mL)和31mL DEPC处理的水。混合物用热循环仪(Hybaid，Middlesex，UK)扩 ±1,94°C 1 分钟(IL-4 和 G3DPH)，对 IFN-g 为 30 秒，60°C 2 分钟(IL-4 和 G3DPH)，62°C 1 分 钟(IFN-g)，72°C 3分钟(IL-4和G3DPH)，对IFN- γ为90秒，最后终延伸步骤为72°C 10分 钟。进行PCR扩增35-40个循环。PCR片段于2%琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙啶染色，紫 外灯下观察。引物序列如下IL-4，正义GAA TGT ACC AGG AGC CAT ATC ；反义CTC AGT ACT ACG AGTATT CCA ； IFN_g，正义 TCT CTC CTG CCT GAA GGA C ；反义 ACACAG TGA TCC TGT GGA A0 IL 4和IFN- γ扩增的DNA产物大小分别为399bp和460bp。细胞因子测定含10% FCS的RPMI 1640培养基中的颈淋巴结细胞以4xl06个细胞/孔于24孔 板中在存在2. 5mg/mL白色念珠菌抗原时培养3天(如上所述)。收集培养上清并ELISA 测定IL-4、IL-12和IFN-γ，以匹配的抗体对和重组细胞因子作为标准(Pharmingen，San Diego, CA)。简述如下，酶标板(Nunc,Denmark)包被溶于碳酸氢钠缓冲液(pH8. 4)的1 μ g/ mL的捕捉大鼠单克隆抗IL-4 (IgGl)，IL-12 (IgG2a)或IFN-γ (IgGl)抗体，4°C过夜。冲洗每孔，以BSA封闭，然后培养上清和适当的标准加入每一孔。生物素标记的大鼠单克隆 抗IL-4，IL-12或IFN-Y抗体2mg/mL作为二级抗体加入。用链亲合素过氧化酶(AMRAD， Delbourne，澳大利亚)和TMD(Sigma-Aldrich)进行检测。ELISA检测细胞因子的敏感度为 31pg/mL。结果以念珠菌诱导的计数减去背景的净剩值表示。感染和用抗IL-4单克隆抗体处理每只小鼠在口腔感染IO8个酵母细胞(白色念珠菌)后的第1、3、5天，小鼠腹腔注 射溶于 200ml PBS 的 30 μ g 大鼠抗 rIL_4 (31)(克隆 11B11, Pharmingen, San Diego, CA)， 或纯化的大鼠IgGl匹配的同种型。口腔的酵母数目以上述的方法测定。统计分析
数据比较用非参数Marm-Whitney U检验。P值< 0. 05认为有显著性。所有计算 使用统计软件程序(StatView ;Abacus Concepts, CA)进行。实施例2 :BALB/c和DBA/2小鼠口腔感染白色念珠菌的动力学在第0天BALB/c和DBA/2小鼠的口腔粘膜以IO8个白色念珠菌芽生孢子感染，此 后28天检测定植的水平。图1所示(左图)，BALB/c和DBA/2小鼠感染6小时后的定植水 平相似。但是，BALB/c小鼠接种1天后定植开始减少，此后抵抗感染的能力在第2天明显， 而DBAA小鼠酵母数目增加I-Iog (ρ < 0. 05)。BALB/c和DBA"小鼠在第4天定植降低，而 第6天DBA/2小鼠的酵母数目比BALB/c小鼠增高了 2-log(p < 0. 001)。在第8天，BALB/ c小鼠口腔没有酵母，而DBA/2小鼠酵母数目大于31og，其到第15天逐渐降低到背景水平。 接种白色念珠菌的小鼠粪块的培养显示没有生长或每个粪块<3CFU，因此排除了由于粪便 污染导致DBA/2小鼠感染重复循环的可能性。为确定感染的形式是否以白色念珠菌的不同形态为特点，计数口腔组织中芽生孢 子和菌丝形态的比例。图1 (右图)表示BALB/c和DBA/2小鼠口腔粘膜组织切片念珠菌芽 生孢子与菌丝形态的比值。接种后DBA/2和BALB/c小鼠芽生孢子与菌丝的比值相似。到 第2天，与BALB/c小鼠相比，DBA/2小鼠菌丝更多于芽生孢子。在第4天，两种小鼠的芽生 孢子与菌丝的比值大致相同。在BALB/c小鼠，芽生孢子与菌丝的比值随时间继续升高，第8 天清除前，第6天时口腔粘膜为100%酵母芽生孢子。DBAA小鼠则明显相反，在主要是芽 生孢子的酵母在第15天被清除前，第6天时芽生孢子与菌丝的比值较低，然后增高，直至第 10天。实施例3 颈淋巴结的细胞反应BALB/c小鼠感染白色念珠菌4天后，从颈淋巴结获得的细胞平均数从9. SxlO6 升高到22xl06个/小鼠，DBA/2小鼠从颈淋巴结获得的细胞平均数从9. 5xl06升高到 ISxlO6 (表1)。BALB/c和DBA/2小鼠清除白色念珠菌后第六天细胞计数减少，但是在DBA/2 小鼠第15天降低之前重新感染后细胞计数增高。虽然CD19+B细胞与多种T细胞亚群的相 对比值保持不变，但在感染过程中Y / S T细胞的百分比显著高于背景水平。BALB/c小鼠在 第6天Y/δΤ细胞数目增高5-6倍，在感染清除后随后降低。相反，在DBA/2小鼠，γ/δΤ 细胞数目增高是循环式的，第4天和第8天达到最高水平，在感染清除后的第28天降低到 背景水平。颈淋巴结细胞的体外刺激白色念珠菌定植对T细胞增殖的影响通过用白色念珠菌抗原刺激培养的颈淋巴结细胞测定。如图2所示，DBAA小鼠与未刺激的对照比较，抗原刺激的T细胞增殖反应明 显增高，在第4天(ρ <0.05)和第10天(ρ <0.05)达到峰值。相反，在BALB/c小鼠，增 殖反应的增高在第四天较低(但仍有显著性)(P < 0. 05)，在第6天(ρ < 0. 01)达峰值后 维持相似的水平。但是DBA/2小鼠的增殖反应持续降低，到28天时降至对照水平。实施例4 血清和局部IgG、IgA抗体反应如图3所示，BALB/c和DBA/2小鼠感染后10天，可检测到血清IgG抗体水平升高， 在第15天达到最大水平。BALB/c与DBA/2小鼠相比，前者的IgG抗体水平在第10天和第 15天(ρ < 0. 05)、以及在第28天(ρ < 0. 01)明显较高。类似的，BALB/c与DBA/2小鼠 相比，前者唾液IgA水平在从第8天开始并在第28天下降前的所有时间点均明显较高(P < 0. 05)，第15天(ρ < 0. 05)达到最大水平。实施例5 感染对IL-4和IFN- y mRNA基因表达的影响RT-PCR检测定植对颈淋巴结细胞IL-4和IFN- YmRNA基因表达的影响。如图4 所示，BALB/c小鼠在第2天可检测IL-4基因表达，而DBA/2小鼠直到第6天才表达。虽然 BALB/c小鼠IL-4基因表达在第10天消失，但在DBA/2小鼠直到第15天仍有持续表达。相 反，在BALB/c小鼠，IFN-γ mRNA基因表达在感染后第6小时即可首次检测到，然后逐渐降 低，然而在DBA/2小鼠持续高表达直到第28天。白色念珠菌抗原刺激颈淋巴结细胞产生IL-4、IL_12和IFN- Y。为确定感染后细 胞因子产生的模式和动力学，颈淋巴结细胞以白色念珠菌抗原刺激72小时后，测定培养上 清的IL-4和IFN-Y水平。表IBALB/c和DBA"小鼠初次感染后的Y / δ T细胞(0天表示未感染的小鼠。不 同的表型以FACS分析的总白细胞百分比表示。结果以3至5只小鼠的均值士标准误表
示) 细胞数目以每只小鼠的计数表示，Υ/δΤ细胞的百分比显著高于背景。与背景水 平比较*ρ < 0. 05，**ρ < 0. 01。如图5所示，BALB/c小鼠产生的IL-4水平分别于第2天显著高于DBA"小鼠，在第4天和第6天达到最大水平(P < 0. Ol和P < 0. 05)。相反，BALB/c和DBA/2小鼠的 IFN- γ水平升高，但是感染后6小时和2天时DBA/2小鼠水平分别显著高于BALB/c小鼠(P
<0. 05和P < 0. 01)。在第4天和第6天，BALB/c小鼠IFN- γ产生达到最高，而DBA"小 鼠产生IFN- γ在第6天为背景水平(P < 0. 01)。BALB/c小鼠排除在第15天时IFN- γ轻 微的升高，IFN-Y产生下降了，而DBA/2小鼠在第8天(P < 0. 05)和第10天(P < 0. 01) 则显著升高。在第28天时，两种小鼠的IFN-Y水平回复到背景水平。为确定不同的IL-4和IFN-Y产生水平是否与IL-12产生有关，在不同的时间从 感染的BALB/c和DBA/2小鼠分离颈淋巴结细胞，然后以白色念珠菌抗原刺激3天，此后测 定培养上清的IL-12。如图5所示，DBA/2小鼠感染后早至第2天IL-12产生显著升高(P
<0. 05)。在BALB/c小鼠，在第6天和第8天IL-12水平升高(P < 0.05)。在DBA"小鼠 进一步升高后，两种小鼠的IL-12在相似的水平维持28天。实施例6 :BALB/c小鼠多次注射抗IL_4单克隆抗体对念珠菌感染易感性的影响为确定BALB/c小鼠IL_4的高产量是否与酵母的快速清除有关，测定给予抗IL_4 的效果。图6显示BALB/c小鼠在感染酵母后的第1、3、5天给予抗IL-430 μ g，与未处理的 对照相比，处理的BALB/c小鼠酵母的清除延迟并且有更高的携带率。但是，抗IL-4单克隆 抗体处理的小鼠与白色念珠菌感染的对照小鼠相比，颈淋巴结细胞培养上清的IFN-Y的 产量没有可检测到的差异。实施例7 白色念珠菌芽生孢子和菌丝致免疫对念珠菌清除率的影响DBAA小鼠(η = 3-5)通过胃肠道插管每2天给予IxlO9个在0. 2mLPBS中热灭活的 白色念珠菌芽生孢子或菌丝免疫，共18天。最后一次致免疫后一天，小鼠口腔粘膜通过局 部涂抹感染IO8个酵母细胞。为与全身免疫比较，多组小鼠皮下注射在PBS中的IxlO9酵母 细胞。在不同的时间点，通过拭整个口腔确定口腔粘膜酵母的清除率。拭子重悬于PBS中， 连续稀释的细胞悬液铺于沙氏葡萄糖琼脂上。结果(平均士SEM)以每只小鼠的log 10CFU 表示。如图7所示，口腔免疫芽生孢子或菌丝的小鼠比未免疫的对照小鼠清除的更快。芽 生孢子免疫小鼠在不同时间点的清除率比菌丝免疫的小鼠更快。通过比较，皮下免疫的小 鼠清除率较差，尽管到第15天时酵母被清除而未免疫的对照没有清除，提示抗性机制涉及 通过口服免疫产生的抗体而非细胞介导的免疫，从而产生快速的清除酵母。实施例8 白色念珠菌感染和口服免疫后的IFN- γ和NO的产生为确定保护的免疫参数，白色念珠菌感染后在不同的时间测定IFN-Y水平。图8 显示了 口服免疫对唾液IFN- γ水平的影响。感染前(0天)处于高水平，比口腔感染后对 照小鼠达到类似水平早2天。表明口服免疫诱导唾液的IFN-γ高水平从而保护对抗感染。由于一氧化氮(NO)产生与寄生物感染的宿主防御有关，所以对这两类小鼠感染 后的NO进行定量，而这两类小鼠都是H2d MHC单倍型。本实验中，白色念珠菌感染小鼠，然 后每天腹腔注射NO合酶抑制剂-NG-单甲基-L-精氨酸单乙酸盐(MNLA)，共3天，此后确定 酵母的清除率。如图9所示，MNLA处理的两种小鼠在不同的时间点的酵母清除均比未处理 的小鼠延迟，提示NO产生的降低与抵抗感染有关。实施例9 经口施与念珠菌疫苗对用活白色念珠菌攻击口腔粘膜的抵抗作用DBAA雄性小鼠(6-8周龄)口服免疫IxlO8个热灭活的芽生孢子(Candivax) 5次， 每2天一次，共10天，或皮下注射IxlO6个芽生孢子4次，每2天一次，然后在活白色念珠菌攻击前的第14天加强一次。小鼠经口获得免疫比皮下注射的保护更好(图10)。结果与粘 膜途径的粘膜免疫系统比全身途径的免疫能更有效地对抗粘膜部位的感染的观点一致。但 是，以活生物体的超声产物口服获得免疫保护性较差(图11)。实施例10 念珠菌疫苗对局部淋巴结T细胞增殖反应的影响DBAA小鼠口服含IX IO8个芽生孢子PBS的念珠菌疫苗免疫，每两天一次，连续10 次，共20天。8周后，一组小鼠在以白色念珠菌感染口腔一周前给予口腔加强，对照小鼠喂 以PBS。感染后各组小鼠于第2、6、8天处死。测定颈淋巴结细胞的T细胞增殖反应，培养 时以念珠菌抗原刺激。培养3天后，通过胸腺嘧啶脱氧核苷摄入测定增殖反应。如图12所 示，Candivax或Candivax加上加强免疫的小鼠T细胞增殖高于对照小鼠。而且，单独给予 Candivax的小鼠比给予疫苗加上口服加强的小鼠反应性更好。在这两种条件下，小鼠受到 免于活菌攻击的保护。实施例11 =Candivax对口腔和胃肠道念珠菌病的治疗作用两组DBA/2雄性小鼠(6-8周龄)口腔以IXlO8个白色念珠菌感染。在第二天，一组小鼠每日用溶于200 μ 1 PBS的高压灭菌的热灭活IxlO8个白色念珠菌免疫连续5天，而 对照组只给予200 μ 1 PBS。口腔感染后的第4、6、8、12、15天处死小鼠，4个一组，并确定口腔和肠道白色念珠 菌感染的模式。简述如下，各组小鼠在不同的时间点处死。完全地擦拭口腔。酵母细胞用 涡旋混合器重悬，然后将一系列10倍比稀释的培养铺于沙氏葡萄糖琼脂板上。此外，移出每只小鼠的全部肠内容物并重悬于10μ 1 PBS中，400g离心去除腔内 容物，10 μ 1系列10倍比稀释培养于含有氯霉素的沙氏葡萄糖琼脂板上。37°C培养24小时 后，计数克隆数，确定口腔和肠道白色念珠菌的数目，以CFU/ml表示。图13显示口腔白色念珠菌的数目，图14显示肠道白色念珠菌的数目。结果显示，白色念珠菌免疫组在第6、8天时，口腔感染水平比对照组降低，在第8、 12、15天时肠道感染水平也降低了。结果显示本发明的白色念珠菌疫苗对已建立的白色念珠菌感染有治疗作用。结果 也显示本发明的疫苗组合物对白色念珠菌感染口腔和胃肠道都有治疗作用。实施例12 施用嗜酸乳杆菌对念珠菌疫苗抗口念珠菌病功效的影响DBA/2小鼠(6-8周龄)，每隔一天经口分别给予嗜酸乳杆菌(VRI 011)和IXlO7 热灭活的念珠菌疫苗或PBS 20天。在最后一次剂量后的第二天，以白色念珠菌感染小鼠口 腔。在第0、2、6、10天，处死小鼠并确定口腔的定植水平。嗜酸乳杆菌(VRI 011)来自澳大 利亚悉尼新南威尔士大学微生物学和免疫学学院培养中心。但是，很多其他常用于嗜酸乳 杆菌和其他有机物的资源为本领域技术人员熟知。图15表示给予嗜酸乳杆菌和念珠菌疫苗的小鼠与对照比较，前者保护口腔免受 白色念珠菌感染显著好于只给念珠菌疫苗的小鼠(P < 0. 05)。实施例13 =Candivax的组合物组合物A这是一种单价口服热灭活候选疫苗，其由IxlO8个灭活白色念珠菌芽生孢子组成。 白色念珠菌(分离株3630，澳大利亚悉尼皇家北海岸医院国家重点试验室)培养于沙氏葡 萄糖肉汤培养基(OxoidjK)中，在水浴摇床25°C培养48小时。将生物体转移到新鲜的培养基中在25°C继续培养18小时。4°C 600g离心10分钟收集芽生孢子，PBS洗3次，重悬 于PBS，然后121°C高压灭菌30分钟。高压灭菌后，芽生孢子用无菌PBS离心洗涤3次，以 IxlO9个细胞/ml重悬于Kreb' s Ringer磷酸葡萄糖缓冲液(KRPB)中，然后储存于4°C备 用。疫苗可以保持稳定6个月。组合物B 这是一种联合的口服灭活念珠菌疫苗，其由IxlO7个热灭活的白色念珠菌芽生孢 子和IxlO7个嗜酸乳杆菌(VRI 011)组成。联合疫苗的口服免疫比单一的芽生孢子或嗜酸 乳杆菌都更有效(图15)。以上研究结果表明，在小鼠模型中宿主对口腔粘膜白色念珠菌感染的抗性与局部 淋巴结中特定的细胞因子反应模式和Y/S T细胞的聚集有关。“感染抗性”BALB/c小鼠和 “感染易感性”DBA/2小鼠在感染后的白色念珠菌定植方式的差异与T细胞增殖和细胞因子 IL-4、IL-12*IFN-y的分泌模式有关。在DBA/2小鼠中，白色念珠菌的芽生孢子和菌丝两 种形式的定植方式是循环的高水平定植。较具感染抵抗性的BALB/c小鼠只有一个较低的 定植峰，且口腔白色念珠菌清除更快。在两种小鼠中，局部淋巴结Y/S T细胞的选择性扩 增与感染的清除在时间上有关。持续的抗原特异性T细胞增殖仅在具感染抵抗性的BALB/ c小鼠产生。在BALB/c小鼠，感染消退后血清IgG和唾液IgA水平较高，而DBA/2小鼠程 度较低。在DBA/2小鼠，大量真菌的循环定植和感染的清除延迟与感染后早期的IFN- γ、 IL-12高水平及IL-4反应的延迟和钝化有关。相反，感染抵抗性的BALB/c小鼠表现为一个 较低水平的定植峰，然后是白色念珠菌快速清除，这也与IL-4和IFN-Y的早期产生有关。 多次注射抗IL-4单克隆抗体IlBll对IL-4的中和作用导致携带率的提高和从口腔清除白 色念珠菌的延迟。总之，结果显示诱导平衡的Thl和Th2辅助细胞反应以IFN-Y和IL-4 产生、Y/ δ T细胞增殖为特点，在口念珠菌病中这些都是与宿主抵抗白色念珠菌感染有关 的因素。抗白色念珠菌感染的宿主保护机制已经在小鼠念珠菌病模型中进行了广泛的研 究，方式为通过不同效应子的免疫机制影响T细胞细胞因子(10)。在侵害性的念珠菌病中， 嗜中性粒细胞和巨噬细胞参与了宿主防御(2)。抵抗性与易感性和T细胞细胞因子的联系 已经在这些模型中以死亡率或生存率的形式阐明了(在2中进行了综述)。例如，抗性和易 感性小鼠感染后都快速产生了 IFN-Y (28，44)，中和IFN-Y增加了抗性小鼠对感染的易感 性(40)，因为IL-12介导了 IFN-Y的过度产生(28)。在一项IFN-γ缺陷小鼠的研究中， 诱导巨噬细胞活化的IFN-Y是存活所必需的(24)。然而，其他一些研究显示IFN-Y对于 宿主防御全身念珠菌病并不是必需的(37)。在此类研究中，将限制粘膜定植的机制与防止 全身侵入的机制及存活必需的机制区分开来是重要的。当进行涉及使用单一组分进行宿主 反应的研究时，对其值需小心解释。本研究检验了在自我限制的口念珠菌病的自然模型宿 主抗性和易感性机制，在“感染抗性”的BALB/c小鼠和“感染易感性”的DBAA小鼠中比较 了定植和IFN- γ和IL-4产生的不同模式。虽然BALB/c和DBA/2小鼠最初感染白色念珠 菌后早期(于6小时)检测到了 IFN-Y转录本，在DBAA小鼠IFN-Y的产生自身并不阻 止更延长的定植。是否DBA/2小鼠补体的第五组分缺陷促进了 口念珠菌病定植的延长还不 清楚。几个饲养包括来自不同遗传背景的同类DBA/2小鼠的研究报告，C5缺陷并不是侵害 性念珠菌病发病所必需的因素，因为在C5缺陷的DBA/2小鼠感染局部的炎症损伤降低非常显著(1,2) ο本研究显示，在DBA/2小鼠，高水平的IL-12、IFN- γ和延迟信使表达及低水平的 IL-4与白色念珠菌高水平的定植和延迟清除有关。这与易感的DBA/2小鼠胃粘膜感染白色 念珠菌和肠道集合淋巴结IL-4表达降低有关的观察(10)相一致。相反，BALB/c小鼠较低 水平IL-12、IFN-Y和早期较高的IL-4产生与低定植和快速清除白色念珠菌有关，提示细 胞因子的程度、动力学和混合可能是决定感染后保护的关键因素。虽然Thl和Th2细胞因 子以不同的产生动力学和不同的量存在，但Thl和Th2细胞因子均存在于口念珠菌病恢复 的DBA/2和BALB/c小鼠，正如在胃念珠菌病时观察到的一样(10)。因此，在口腔粘膜中对 原发的白色念珠菌感染的抵抗与Thl和Th2反应有关。此外，IL-4似乎在这一过程中起重 要的作用，因为BALB/c小鼠以抗IL-4抗体处理后，携带率提高并延迟口腔粘膜清除白色念 珠菌。IL-4提高口腔粘膜抵抗白色念珠菌感染的机制还不清楚。在原发的全身念珠菌病 中，IL-4可通过促进包括效应子Thl细胞分化在内的效应子介导免疫限制了白色念珠菌的 感染(31)。特别是在全身和胃念珠菌病时IL-4促进了保护性的Thl的反应(10)。其他研 究显示IL-4缺陷的小鼠比正常的对照更容易患急性系统感染(32)，但是感染后食管念珠 菌病的易感性没有差别(49)。这些矛盾的发现可解释为由于实验模型中所用的小鼠品系 不同和诱导全身或粘膜念珠菌病的白色念珠菌感染途径及剂量的不同。例如，BALB/c小鼠 经胃内 感染白色念珠菌时诱导的胃念珠菌病比DBA/2小鼠更严重，而全身念珠菌病则相反 (10)。在当前的模型中，通过局部涂用白色念珠菌诱导急性口念珠菌病，而胃内感染则通过 用白色念珠菌的大丸剂诱导食管念珠菌病(32)。此外，局部涂用白色念珠菌到口腔粘膜将 抗原提供限制在肠相关淋巴样组织(GALT)，后者可通过激活共同的粘膜免疫系统来调节感 染的进程(14)。的确，在DBA/2小鼠中发现灭活的白色念珠菌口服免疫导致更低的酵母定 植和快速清除。本研究中，BALB/c和DBA/2小鼠在抗体产生前清除感染，提示血清IgG和分泌型 IgA抗体的产生在粘膜清除中不起重要的作用。这与一项小鼠胃念珠菌病的研究一致，该研 究显示在清除时产生Thl和Th2细胞因子(10)。此外，分泌型IgA抗体产量的增加并不加 速感染的消退(10)。尽管感染后颈淋巴结细胞计数提高，⑶4+、⑶8+、α/βΤ细胞和B细胞的相对比 例保持不变提示为细胞的聚集而不是抗原诱导的细胞增殖。但是，存在Y/S T细胞的选择 性扩散，这与白色念珠菌的消除有关。尽管数目很低，考虑到外周淋巴样组织中Y/δΤ细 胞极少，这种增加仍是显著的(20)。感染细菌、病毒、寄生物后Y/δΤ细胞数目增加，提示 Y/ST细胞在宿主防御的第一道防线有一定的作用。已有报道口腔粘膜Y/δΤ细胞数目 的增加与BALB/c和DBA/2小鼠感染白色念珠菌的定植模式有关(12)。但是Y / δ T细胞是 否是IL-4的来源还不清楚。尽管有报道Y/δ T细胞克隆和细胞系可以分泌这种细胞因子 (4)，但是还不能证明这些小鼠的Y / δ T细胞产生显著量的IL-4(数据未显示)。最近有报 道在皮下注射白色念珠菌的小鼠Y/S T细胞可增加巨噬细胞产生一氧化氮(NO) (23)，进 一步将Y/S T细胞和抵抗机制联系起来。此外，NO可以增加T细胞IL-4的表达(15)，进 一步影响细胞因子分泌的平衡。因此白色念珠菌的粘膜遏制依赖于巨噬细胞和T细胞通过 释放NO和IL-4的相互作用，已报导带有IL-4表面受体的巨噬细胞可增强对酵母细胞的杀灭(19)。γ/ δ T细胞分泌IFN-Y和IL-4，它们都可以激活巨噬细胞并直接作用于白色念 珠菌(38)。本模型检测唾液NO水平的初步研究支持这一假设。总之，分析局部淋巴结细胞群提供的数据与现在关于在感染的实验模型中细胞因 子功能的观点一致。不被任一特定的作用机制所束缚，本研究中的口念珠菌病模型的发现 表明IL-4和IFN-Y的产生可能对整体动物粘膜感染的清除是重要的。IL-4的早期产生提 示这种细胞因子在促进对抗白色念珠菌感染的免疫中具有重要作用。IL-12和IFN-Y高水 平的同时出现支持在清除口腔粘膜感染中平衡的Thl和Th2反应是有效的宿主防御机制。尽管参照具体的实施例和优选的实施方案对本发明进行了描述，但应当理解，与 文中所述的本发明的广义概念和精神相一致的改变形式也包括在本发明的范围内。
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权利要求
适于口服施用的组合物，该组合物包含白色念珠菌的芽生孢子形式，用于预防性或治疗性治疗口腔、鼻咽或呼吸道的白色念珠菌定植和/或感染。
2.根据权利要求1的组合物，其为疫苗形式。
3.根据权利要求1或2的组合物，其包含完整的白色念珠菌。
4.根据权利要求1或2的组合物，其包含灭活的白色念珠菌。
5.根据权利要求1或2中任意一项所述的组合物，其还包含可药用的溶剂、赋形剂、佐 剂或载体。
6.根据权利要求5的组合物，其中对佐剂进行选择，以诱导Thl反应。
7.根据权利要求1或2中任意一项所述的组合物，其还包含益生素。
8.根据权利要求7的组合物，其中益生素为益生菌。
9.根据权利要求8的组合物，其中益生菌为一种乳酸菌。
10.根据权利要求9的组合物，其中乳酸菌为嗜酸乳杆菌。
11.白色念珠菌芽生孢子在制备用于口服施用以预防性或治疗性治疗由于白色念珠菌 定植和/或感染引起的疾病的药物中的用途。
12.根据权利要求11的用途，其中所述药物用于预防性或治疗性治疗口腔、鼻咽或呼 吸道的白色念珠菌定植和/或感染。
13.根据权利要求11或权利要求12的用途，其中的病症为粘膜炎。
14.根据权利要求11的用途，其中疾病选自复发/持续性口炎、复发性外阴阴道念珠菌 病、食管炎和下尿道或/和肠定植。
15.根据权利要求11所述的用途，其中的药物与佐剂联合施用。
16.根据权利要求15的用途，其中对佐剂进行选择，以诱导Thl反应。
17.根据权利要求11所述的用途，其中的药物与益生素联合施用。
18.根据权利要求17的用途，其中益生素为益生菌。
19.根据权利要求18的用途，其中益生菌为一种乳酸菌。
20.根据权利要求19的用途，其中乳酸菌为嗜酸乳杆菌。
21.根据权利要求15或17所述的用途，其中佐剂和/或益生素经口施用。
22.根据权利要求15或17所述的用途，其中佐剂和/或益生素胃肠外施用。
23.根据权利要求15或17所述的用途，其中佐剂和/或益生素在用药物治疗之前、之 中或停止之后施用。
24.根据权利要求23的用途，其中佐剂和/或益生素在用根据权利要求1至6中任意 一项所述的组合物治疗之前施用。
全文摘要
本发明涉及新的口服组合物和疫苗，尤其涉及用于预防或治疗念珠菌病的口服疫苗。
文档编号G01N33/50GK101862449SQ201010200300
公开日2010年10月20日 申请日期2001年6月19日 优先权日2000年6月19日
发明者E·舒克罗拉, G·庞, R·克兰西 申请人:亨特免疫有限公司