专利名称：鸡传染性法氏囊病超强毒的细胞适应株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种超强毒株的细胞适应株及其应用，特别涉及一种鸡传染性法氏囊病超强毒的细胞适应株及其在制备预防鸡传染性法氏囊病药物中的应用。属于生物疫苗领域。
背景技术：
鸡传染性法氏囊病(IBD)是幼龄鸡的一种急性、高度接触性传染病。其病原是鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)。IBDV属双RNA病毒科，禽双RNA病毒属病毒。它有两个血清型，即血清I型和血清II型。I型毒对鸡有致病性，又分为不同亚型，如经典株、变异株、 超强毒株和致弱株等。IBDV倾向于侵袭活跃的分离细胞，在鸡体内，主要侵害中枢免疫器官-法氏囊中的前体B细胞，使其发生凋亡和坏死，进而使成熟B细胞减少，导致免疫抑制， 从而降低机体对其它疫病的易感性和对其它疫苗的反应性。本病现已遍布全球养禽地区， 在工业化养禽业发达的国家尤为严重。
我国于1979年先后在北京、广州等地发生本病，初期病死率较低；八十年代末、 九十年代初，我国开始流行鸡传染性法氏囊病超强毒(wIBDV)，使IBD的发生有了新的变化病死率升高达100%和60%以上；雏鸡易早期感染，急性发病；原有的经典株弱毒苗不能给免疫鸡提供完全的保护；带有较低母源抗体水平的鸡群也常常不能抵抗wIBDV的攻击。李树根等发现，TAD(德国)、D78(荷兰)、BV(美国)、CJ(北京)等弱毒疫苗对由广东分离的6株血清I型IBDV毒株GF903、G^02、GN903、GS904、GB905、GD906等的保护率都不高。 由于wIBDV在抗原性上与经典株和经典疫苗株一致，只是在致病性上出现急剧增强的趋势，理论上讲，常规标准血清I型疫苗能够提供对wIBDV的保护，但在临床实践中，vvIBDV 却能突破母源抗体而感染雏鸡。即使不致雏鸡死亡，也使法氏囊组织受到严重损伤，导致严重后果。因此研制出能抵抗国内wIBDV分离株、免疫原性强、安全性好的疫苗，并将其推广应用就迫在眉睫。目前认为适当提高疫苗的含毒量或选用中毒力疫苗株是提高疫苗免疫效力的两个好办法。Vandenberg等证明，D78疫苗免疫接种的规定含量较PBG98疫苗的高10 倍，前者抗wIBDV的效果就比后者好。而中毒力疫苗或残毒疫苗虽然对IBD的控制效果较好，但不免使人对其毒力和使用后果有些担心。因此本发明人认为，分离国内vvIBDV，筛选、培育出毒价高，抗原性强的毒株，研制IBD灭活苗，用于雏鸡将引起主动免疫，且无毒负作用；用于种鸡，将提高子代鸡的母源抗体水平，防制早期感染，抵抗国内wIBDV的攻击。
近几年，本发明人将分离到的wIBDV-Gx株，经过鉴定、筛选、培育，将其5代细胞适应株(IBDV-G)作为种毒，经鉴定后，研制了超强毒灭活疫苗，并进行了一系列实验室免疫效力试验、安全性试验、对国内wIBDV的攻毒保护试验等，取得了良好的效果。发明内容
本发明的目的之一在于提供一种鸡传染性法氏囊病超强毒的细胞适应株。
本发明的目的之二在于提供所述的鸡传染性法氏囊病超强毒的细胞适应株在制备预防鸡传染性法氏囊病药物中的应用。
本发明的目的之三在于提供一种预防鸡传染性法氏囊病的疫苗组合物。
本发明的目的是通过以下技术手段实现的
本发明人从广西某地IBD免疫后发病鸡群采取法氏囊组织，经标准化方法处理后，得到IBDV-foc株。对foe株进行了致病性试验，克隆其主要保护性抗原基因VP2，并进行了序列分析和比较。结果表明，其与欧洲标准超强毒UK661的亲缘关系较近，主要结构蛋白核苷酸同源性为99%，氨基酸同源性为100%，其对SPF鸡胚半数感染量(EID5tl) 为106·25/0. 2ml,以2X IO3EID50/只的剂量接种9 11日龄的SPF鸡，死亡率达40 %，以 2 X IO3EID50/只的剂量接种4周龄SPF鸡，死亡率达64%。从而证实传染性法氏囊病病毒 Gx为一株符合欧洲超强毒标准和特点的国内超强毒株。
对该foe毒株经SPF鸡胚连续传代5代后，又经SPF鸡胚成纤维细胞连续传代25 代，结果表明病毒在细胞上稳定地大量增殖。其中细胞5代毒在接种后72小时，毒价可达 4. 0Xl(fpFU/ml，病毒对 SPF 鸡胚半数感染量(EID50)为 1081°/0. 2ml,以 2 X IO3EID50/ 只的剂量接种4周龄SPF鸡，死亡率达60%，进而筛选得到了本发明的一种鸡传染性法氏囊病超强毒的细胞适应株，其为鸡传染性法氏囊病超强毒to株的细胞适应株，命名为IBDV-G株， 分类命名为鸡传染性法氏囊病毒，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院，中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为CGMCC No. 5553，保藏日期为2011年12月5日。
将本发明的鸡传染性法氏囊病超强毒的细胞适应株IBDV-G以同步接毒的方式进行批量培养，收获病毒，经甲醛灭活，以矿物油为佐剂制成油乳剂灭活苗。疫苗接种10日龄及36周龄SPF鸡，注苗后均无不良反应。雏鸡免疫后7天开始产生抗体，14天时对超强毒 IBDV-G (vvIBDV-G)的致死性攻击，具有100%的保护率。免疫种鸡后，观天后直至8_10个月，子代鸡均可获得被动保护，10日龄时对wIBDV-G的致死性攻击的保护率为100 %，同国内外部分同类疫苗进行的比较研究中，本超强毒灭活苗抗体阳性率、抗体滴度及对超强毒的保护率，在参与比较的疫苗中，均居于首位。
因此，本发明提出了所述的鸡传染性法氏囊病超强毒的细胞适应株在制备预防鸡传染性法氏囊病药物中的应用。
本发明的一种预防鸡传染性法氏囊病的疫苗组合物，其特征在于所述的疫苗组合物中，其有效成分包含灭活后的本发明所述的鸡传染性法氏囊病超强毒的细胞适应株。
在本发明的研究中将致死率作为本发明的疫苗免疫保护性的可靠性依据及判定标准。鸡传染性法氏囊超强毒株在我国的出现，使病死率已升高到60 100%，由于wIBDV 在致病性上出现了急剧增强的趋势，使得传染性法氏囊病具备了高死亡率的特征，所以使用严重发病及致死率作为免疫保护性指标，可以客观地评价鸡传染性法氏囊病超强毒灭活疫苗对鸡群遭受wIBDV致死性攻击时的保护效率，具有极大的可靠性；免疫攻毒保护的鸡应临床不死亡、不发病、无精神沉郁、食欲废绝现象。
自1962年Cosgrove首次报道鸡传染性法氏囊病的流行以来，世界各国相继开展了 IBD疫苗免疫方面的研究，油佐剂灭活疫苗具有免疫保护期长、免疫效果确实等优点，目前各国使用较多的油佐剂疫苗的毒株包括IBDV的标准毒株和变异株。其对种鸡的免疫可将母源免疫力提供给后代，这些母源抗体能保护鸡免受早期感染而引起的免疫抑制，世界各国鸡传染性法氏囊病油乳剂灭活苗的研制成功和应用在对传染性法氏囊病的控制上发挥了巨大的作用。在本研究中将本产品与部分国内外同类疫苗，包括已批准的鸡传染性法氏囊灭活苗(CJ-801-BKF株)在内进行了比较，结果表明，本疫苗抗体阳性率、抗体滴度及对超强毒的保护率，在参与比较的疫苗中，居于首位，已批准的CJ-801株鸡传染性法氏囊灭活苗的各项指标与超强毒灭活苗相比基本相同，但超强毒灭活苗有着免疫剂量小(超强毒灭活苗成鸡免疫剂量为0. 6ml/只，CJ-801株法氏囊病灭活苗成鸡免疫剂量为1. 2ml/ 只)的明显优势，分析其原因，可能是本灭活苗的毒种具有超强毒的特性，同时能在细胞中适应并大量增殖，易于提高疫苗中的抗原量。
因此，与现有技术相比，采用本发明的鸡传染性法氏囊病超强毒的细胞适应株制成的疫苗具有如下优点
1、本发明的一种鸡传染性法氏囊病超强毒的细胞适应株具有超强毒的特性，能在细胞中适应并大量增殖，易于提高疫苗中的抗原量；
2、本发明的疫苗组合物其抗体阳性率、抗体滴度及对超强毒的保护率高；
3、本发明的超强毒灭活苗有着免疫剂量小(超强毒灭活苗成鸡免疫剂量为 0. 6ml/只，CJ-801株法氏囊病灭活苗成鸡免疫剂量为1. 2ml/只)的明显优势；
4、本研究结果表明，鸡传染性法氏囊病超强毒灭活苗具有免疫原性好、免疫保护持续期长、免疫剂量小等优点。
IBDV流行与分布较广，加之病毒本身对外界抵抗力较强，感染舍的彻底消毒也十分困难，因此使用能够抵抗国内wIBDV流行的高效疫苗对易感鸡群进行免疫预防，减少甚至避免其对养禽业造成的危害势在必行。本研究结果表明，鸡传染性法氏囊病超强毒灭活苗具有免疫原性好、免疫保护持续期长、免疫剂量小等优点，它的的推广应用将有效地预防了我国局部地区vvIBD的暴发和流行，给免疫场带来了明显的经济效益和社会效益，有利地促进了免疫地区乃至我国养禽业的持续、稳定、健康地发展。
图1为IBDV-G在CEF上的生长曲线；
图2为种毒IBDV-G的电镜照片。
具体实施方式
下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。
实施例1鸡传染性法氏囊病超强毒灭活苗制苗用种毒IBDV-G的鉴定
1、材料和方法
1. 1疫苗用种毒的鉴定
1. 1. 1种毒的培养及毒价测定
以10日龄SPF鸡胚制备鸡胚成纤维细胞，以同步接毒方式接种5代细胞毒，即本发明的鸡传染性法氏囊病超强毒的细胞适应株IBDV-G，37°C培养。不同时间收集病毒培养物，以病毒蚀斑形成方法测定病毒含量，绘制病毒生长曲线，并确定收毒时间和种毒毒价。
1. 1. 2电镜观察
种毒细胞培养物冻融后，直接负染法做电镜观察；经不连续蔗糖梯度离心纯化后， 抽取40%蔗糖段的病毒带，加PBS超速离心Q7000rpm，2. 5小时)，少量TNE悬浮后，直接负染法做电镜观察。
1. 1. 3外源病毒检查
IBDV-G培养物，稀释至1 X 104PFU/ml，将其与超强毒IBDV-G单特异血清等量混合并经37°C 1小时中和后，取10日龄SPF鸡20只，以滴鼻、点眼的途径进行接种，每只鸡接种0. 2ml (1. 0 X IO3PFU/只)，20天后，采集血清，分别使用血凝抑制(HI)、琼扩(AGP)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、中和试验(VN)、免疫荧光(IFA)等方法，检测血清中鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)、鸡马立克病毒(MDV)、鸡新城疫病毒(NDV)、禽网状内皮组织增殖征病毒 (REV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、禽流感病毒(AIV)、禽白血病病毒(LLV)、鸡传染性喉气管炎病毒(LTV)、禽脑脊髓炎病毒(AEV)、鸡痘病毒(POX)的抗体阳性率。
1. 1.4生物学特性
以1. OX IO3PFU/只剂量的IBDV-G接种12只10日龄SPF鸡，于接种后3、5、7、10 天，各剖检3只鸡，观察剖检变化和病理组织学变化，并用ELISA方法检测组织中的IBDV。
1. 2疫苗用种毒的特异性及免疫原性
1. 2. 1 特异性
取培养M小时的2个IOOml方瓶CEF，将种毒稀释至1 X 104PFU/ml后与vvIBDV-G 单特异血清等量混合并经37°c 1小时中和后，每瓶接种0. anl，培养5日，观察细胞病变； IBDV-G病毒培养物经27000转/分，2. 5小时超速离心后，80倍浓缩，与鸡传染性法氏囊病 (IBD)、鸡传染性贫血病(CIA)、鸡马立克病(MD)、鸡新城疫(ND)、鸡传染性支气管炎(IB)、 禽流感(Al)、鸡传染性喉气管炎(ILT)等阳性血清作琼扩试验。
1. 2. 2免疫原性
将毒价达4. 0 X 108PFU/ml的IBDV-G病毒培养物，经0. 2 %甲醛溶液灭活48小时后，与白油佐剂按1 1.5混合，制成油乳剂，分别以0.05ml/只、0. Iml/只、0. 2ml/只剂量肌肉注射接种20只10日龄SPF鸡，免疫后14天和28天分别以4. 0 X IO4EID50/只wIBDV_G 株进行攻毒，确定超强毒攻毒保护率并分别在免疫后7、14、21、观天采血，检测AGP和ELISA 抗体，计算免疫后不同时间的血清抗体阳性率。
2.结果
2. 1疫苗用种毒鉴定
2. 1. 1种毒的培养及毒价测定
IBDV-G在CEF上可稳定而有规律地增殖，图1从一定程度上反应出病毒增殖状态。 接种后72小时左右，培养液中的病毒量最多，毒价达4. OX 108PFU/ml以上，因而，收毒时间定为72小时。
2. 1. 2电镜观察
种毒细胞培养物冻融后，直接负染法做电镜观察，可见视野中大量散在的、典型的 IBDV粒子，未见其它病毒粒子，如图2所示。
2. 1. 3外源病毒检查
以IBDV-G培养液经单特异血清中和，接种SPF鸡后，血清中除检测到传染性法氏囊病毒抗体外，无其它病毒抗体，证明种毒较纯，无其它外源病毒的污染；使用SPF鸡进行实验，结果可靠(见表1)。
表1种毒的外源病毒检查
权利要求
1.鸡传染性法氏囊病超强毒的细胞适应株，其特征在于所述的细胞适应株为鸡传染性法氏囊病超强毒foe株的细胞适应株，命名为IBDV-G株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为=CGMCC No. 5553。
2.权利要求1所述的鸡传染性法氏囊病超强毒的细胞适应株在制备预防鸡传染性法氏囊病药物中的应用。
3.一种预防鸡传染性法氏囊病的疫苗组合物，其特征在于所述的疫苗组合物中，其有效成分包含灭活后的权利要求1所述的鸡传染性法氏囊病超强毒的细胞适应株。
全文摘要
本发明公开了一种鸡传染性法氏囊病超强毒的细胞适应株及其在制备预防鸡传染性法氏囊病药物中的应用。本发明的细胞适应株为鸡传染性法氏囊病超强毒Gx株的细胞适应株，命名为IBDV-G株，其菌种保藏编号为CGMCC 5553。将本发明的IBDV-G株灭活后制备成疫苗用于动物的免疫，结果证明本发明的疫苗安全，且对超强度IBDV-G的致死性攻击，具有100％的保护率，本发明的超强毒灭活苗抗体阳性率、抗体滴度及对超强毒的保护率，在参与比较的疫苗中，均居于首位。因此，本发明的推广应用将有效地预防了我国局部地区vvIBD的暴发和流行，有利地促进了免疫地区乃至我国养禽业的持续、稳定、健康地发展。
文档编号C12N7/00GK102533673SQ201210014019
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月17日 优先权日2012年1月17日
发明者王永强, 王笑梅, 祁小乐, 秦立廷, 高宏雷, 高玉龙 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所