一种用短暂厌氧发酵调节重组大肠杆菌代谢的方法

专利名称：一种用短暂厌氧发酵调节重组大肠杆菌代谢的方法
技术领域：
本发明属于微生物发酵技术领域，涉及一种通过在细菌培养的一定阶段进行短暂厌氧发酵的方法来调节重组大肠杆菌的代谢行为，从而提高发酵过程目的产物产量的发酵过程优化和调控新方法。
背景技术：
5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid, ALA)是生物体内四氢卩比咯类化合物(如血红素酶、叶啉和维生素B12等)的共同前体，具有重要的生理活性。ALA在农业上可用做光合作用促进剂、抗逆剂、落叶剂和除草剂等，用途广泛、对环境友好。在医学领域，5-氨基乙酰丙酸作为新一代光动力学药物在脑瘤、皮肤癌等疾病的诊断和治疗方面有着极大的应用价值。
5-氨基乙酰丙酸的生产方法可分为化学合成法和微生物发酵法。化学合成ALA有多种途径，可分别以马尿酸、琥珀酸、四氢糠胺及乙酰丙酸等为原料合成ALA，但是这些方法通常产率低、副产物多、环境污染严重。利用类球红细菌突变株和重组大肠杆菌发酵法生产5-氨基乙酰丙酸在生产成本和产品质量方面均具有显著的竞争优势。通过构建基因工程菌来生产5-氨基乙酰丙酸是一种廉价且有效的方法。专利ZL 200710068169. 0中公开了一种由基因工程菌Rosetta (DE3)-pET28a-A. ^.heniA来发酵生产ALA的方法，其中ALA的产量可达到6. 6g/L。在重组大肠杆菌的发酵体系中，溶解氧浓度对细胞代谢的影响非常复杂。2003年，Antonio De Le6n 等(De Leon A, Hernandez V, Galindo E, Ramirez 0T, EnzymeMicrob Technol, 2003, 33: 689-697)的研究表明，在用重组大肠杆菌研究过量表达青霉素酰基转移酶时，生长耦联型产率系数与溶解氧浓度的关系呈饱和型曲线，而非生长耦联型产率系数则在1%_5%的DOT下达到最大值。精确地控制发酵过程中的溶氧值在较低的水平可以提高目的产物的产量。但是，在工业规模精确控制发酵过程中的溶氧值的操作成本较高。大肠杆菌作为兼性有氧厌氧生物，在进行有氧发酵和厌氧发酵时，其生理和代谢有很大差异。Vemuri 等(Vemuri GN, Eiteman MA, Altman E, J Ind Microbiol Biotechnol,2002，28: 325-332)的研究发现，与完全的好氧发酵相比，采用好氧/厌氧两阶段发酵可以大幅度提高琥珀酸的产量。在这样的两阶段发酵中，从好氧发酵到厌氧发酵的转换时机，会对大肠杆菌的代谢行为产生不可忽略的影响，从而使琥珀酸产量发生显著改变。因此，巧妙地利用这种好氧发酵和厌氧发酵间生理和代谢的变化，就有可能有目的地实现发酵过程代谢流的控制。

发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提出一种用短暂厌氧发酵调节重组大肠杆菌代谢的方法，以进一步提高5-氨基乙酰丙酸的产量。本发明方法所采用的技术方案包括以下步骤步骤(I).用接种针从保藏编号为CGMCC No. 1939的工程菌Rosetta(DE3)-pET28a_A.的甘油管中蘸取菌液后,在含有30 50 ii g/ml卡那霉素和30 50iig/ml氯霉素的LB培养基平板上划线，并将划线后的LB培养基平板放置于37°C下过夜培养；
所述的保藏编号为CGMCC No. 1939的工程菌Rosetta (DE3)-pET28a_A. R. hemA游保藏单位名称中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号；保藏日期2007. 01.25。
步骤(2).将LB培养基平板上的单克隆接种于含30 ~ 50ml LB培养基的250ml摇瓶中，并放置在转速为200 220rpm，温度为37°C的摇床中过夜培养，得到一级种子；
步骤(3).取I ~ 5ml 一级种子接种于含50 ~ 100ml LB培养基的500ml的摇瓶中，并放置在转速为200 - 220rpm，温度为37°C的摇床中培养3 4h，得到二级种子；
步骤(4).将100 ~ 300ml 二级种子接种于含7 ~ 9 L发酵培养基的15 L发酵罐中进 行发酵培养，发酵罐的搅拌转速为300 — oOOrpm,空气流量为5 ~ 10 L/min，起始培养温度为37°C ;2 ~ 3h后培养温度降至26 ~ 30°C,并用0. 02 0. 2mmol/L异丙基-P -D-硫代半乳糖苷诱导；
所述的步骤(4)中的发酵培养基是由质量体积比分别为0. 3 ~ 2%蛋白胨、0. 25 ~ 1%酵母粉、0.3 ~ 1%琥珀酸、0.2 ~ 0. 4%甘氨酸和0.1 ~ 0.5%葡萄糖组成，其pH值为6.0 6. 3 ;发酵培养基最开始用10 ~ 20%体积分数的稀硫酸，将pH控制在5. 8 ~ 6. 0 ；
步骤(5).当菌体生长至5 ~ 6小时后，将发酵罐的搅拌转速调为0，发酵液中溶氧值随之变为0，维持30 ~ 75min的厌氧发酵后恢复发酵罐的搅拌转速；
所述的发酵液，在二级种子接种4 - Sh后通过反馈流加补料培养基，将发酵液的pH调为 6. 1-6. 3 ；
所述的补料培养基体积为800 — 1100ml，且含有70 90 g琥珀酸和50 ~ 70 g甘氨
酸；
步骤￠).当菌体密度0D_达到3 ~ 10时，分批或者连续补加5-氨基乙酰丙酸脱水酶抑制剂；
所述的5-氨基乙酰丙酸脱水酶的抑制剂为3 - 5g/L D-葡萄糖；
所述的步骤(I)中的保藏编号为CGMCC No. 1939工程菌，分类命名中文名为大肠埃希氏菌，拉丁文学名为 Escherichia coli Rosetta (DE3) _pET28a_A. R. hemA。本发明有益效果如下
本发明工艺可操作性强，通过短暂厌氧发酵调节和控制工程菌Rosetta(DE3)-pET28a-A. hemA代谢，所得的胞外5-氨基乙酰丙酸产量高，适合于工业化应用，前景广阔。


图I胞外ALA浓度、甘氨酸、琥珀酸、葡萄糖、菌体密度0D_与发酵时间的关系曲线.
图2溶解氧(D0)、胞外ALA浓度、甘氨酸、琥珀酸、葡萄糖、乙酸及菌体密度OD6tltl与发酵时间的关系曲线。图3溶解氧(D0)、胞外ALA浓度、甘氨酸、琥珀酸、葡萄糖、菌体密度OD6。。与发酵时间的关系曲线。
具体实施例方式以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。实施例I
用短暂厌氧发酵调节重组大肠杆菌代谢的方法，包括以下步骤
1)用接种针从保藏编号为CGMCCNo. 1939的工程菌Rosetta (DE3)-pET28a_A. R. hemA的甘油管中蘸取菌液，在含有30 u g/ml卡那霉素和30 u g/ml氯霉素的LB培养基平板上划线后，在37 °C下过夜培养；
2)将平板上的单克隆接种于含50mlLB培养基的250ml摇瓶中，转速为200rpm，在37°C下过夜培养，得到一级种子；
3)取Iml—级种子接种于多个含100ml LB培养基的500ml的摇瓶中培养3 h，得到二级种子；
4)将200ml二级种子接种于含9 L发酵培养基的15 L发酵罐中进行发酵培养，发酵罐搅拌转速为400 rpm,空气流量为7 L/min,起始培养温度为37°C，2h后降至29°C，再用终浓度为0. 05 mmol/L异丙基-P-D-硫代半乳糖苷诱导；其中发酵培养基是由质量体积比分别为1%蛋白胨、0. 5%酵母粉、0. 3%琥珀酸、0. 2%甘氨酸和0. 2%葡萄糖组成，用氢氧化钠调节PH值为6. I ;
5)在菌体密度OD6tltl达5时，每3小时分批补加4g/LD-葡萄糖作为5-氨基乙酰丙酸脱水酶抑制剂，共3次；
6)发酵培养初始采用20%体积分数的稀硫酸控制pH在5.8 ;培养6h后通过流加补料培养基控制PH为6. 3 ;
所述的补料培养基体积为1000ml，且含有70 g琥珀酸和55 g甘氨酸；
7)在发酵至6h，进行60min厌氧发酵，也即发酵培养5h后停止搅拌，至6h时恢复搅拌。米用Mauzerall和Granick的分析方法(参照MauzerallD, Granick S. J. Bio.Chem. , 1956，219:435 — 442)测定ALA的浓度。由图I可见，通过一次短暂厌氧发酵操作，胞外ALA的最高浓度可达到7. 4 g/L。实施例2:
1)用接种针从保藏编号为CGMCCNo. 1939的工程菌Rosetta (DE3)-pET28a_A. R. hemA的甘油管中蘸取菌液，在含有40 u g/ml卡那霉素和30 u g/ml氯霉素的LB培养基平板上划线后，在37 °C下过夜培养；
2)将平板上的单克隆接种于含30mlLB培养基的250ml摇瓶中，转速为220rpm，在37°C下过夜培养，得到一级种子；
3)取5ml—级种子接种于多个含75ml LB培养基的500ml的摇瓶中培养3 . 5h，得到二级种子；
4)将300ml二级种子接种于含7L发酵培养基的15 L发酵罐中进行发酵培养，发酵罐搅拌转速为500 rpm,空气流量为5L/min，起始培养温度为37°C，3h后降至30°C，再用终浓度为0. 2 mmol/L异丙基-D-硫代半乳糖苷诱导；其中发酵培养基是由质量体积比分别为2%蛋白胨、0. 25%酵母粉、1%琥珀酸、0. 4%甘氨酸和0. 5%葡萄糖组成，用氢氧化钠调节pH值为6. 3 ；
5)在菌体密度OD6tltl达5时，每3小时分批补加3g/LD-葡萄糖作为5-氨基乙酰丙酸脱水酶抑制剂，共3次；
6)发酵培养初始采用20%体积分数的稀硫酸控制pH在5.8 ;培养6h后通过流加补料培养基控制PH为6. 3 ;
所述的补料培养基体积为800ml，且含有90 g琥珀酸和70 g甘氨酸；
7)在发酵至6h,进行30min厌氧发酵,也即6h停止搅拌,至6. 5h时恢复搅拌。米用Mauzerall和Granick的分析方法(参照MauzerallD, Granick S. J. Bio.Chem.，1956，219:435-442)测定ALA的浓度。通过一次短暂厌氧发酵操作，胞外ALA的最高浓度可达到7.2 g/L。 实施例3
用短暂厌氧发酵调节重组大肠杆菌代谢的方法，包括以下步骤
1)用接种针从保藏编号为CGMCCNo. 1939的工程菌Rosetta (DE3)-pET28a_A. R. hemA的甘油管中蘸取菌液，在含有40 u g/ml卡那霉素和50 u g/ml氯霉素的LB培养基平板上划线后，在37 °C下过夜培养；
2)将平板上的单克隆接种于含50mlLB培养基的250ml摇瓶中，转速为200rpm，在37°C下过夜培养，得到一级种子；
3)取Iml—级种子接种于多个含100ml LB培养基的500ml的摇瓶中培养3 h，得到二级种子；
4)将200ml二级种子接种于含9 L发酵培养基的15 L发酵罐中进行发酵培养，发酵罐搅拌转速为400 rpm,空气流量为7 L/min,起始培养温度为37°C，2h后降至27°C，再用终浓度为0.05 mmol/L异丙基-P-D-硫代半乳糖苷诱导；其中发酵培养基是由质量体积比分别为1%蛋白胨、0. 5%酵母粉、0. 3%琥珀酸、0. 2%甘氨酸和0. 2%葡萄糖组成，用氢氧化钠调节PH值为6. I ;
5)在菌体密度OD6tltl达5时，每3小时分批补加5g/LD-葡萄糖作为5-氨基乙酰丙酸脱水酶抑制剂，共3次；
6)发酵培养初始采用20%体积分数的稀硫酸控制pH在5.9 ;培养6h后通过流加补料培养基控制PH为6. 2 ;
所述的补料培养基体积为1100ml，且含有75 g琥珀酸和70 g甘氨酸；
7)在发酵至5h,进行45min厌氧发酵,也即5h停止搅拌,至5. 75h时恢复搅拌。米用Mauzerall和Granick的分析方法(参照MauzerallD, Granick S. J. Bio.Chem. , 1956，219:435 — 442)测定ALA的浓度。由图2可见，通过一次短暂厌氧发酵操作，胞外ALA的最高浓度可达到8. 6 g/L。实施例4
1)用接种针从保藏编号为CGMCCNo. 1939的工程菌Rosetta (DE3)-pET28a_A. R. hemA的甘油管中蘸取菌液，在含有30 u g/ml卡那霉素和50 u g/ml氯霉素的LB培养基平板上划线后，在37 °C下过夜培养；
2)将平板上的单克隆接种于含50mlLB培养基的250ml摇瓶中，转速为200rpm，在37°C下过夜培养，得到一级种子；
3)取Iml—级种子接种于多个含IOOml LB培养基的500ml的摇瓶中培养3 h，得到二级种子；
4)将200ml二级种子接种于含9 L发酵培养基的15 L发酵罐中进行发酵培养，发酵罐搅拌转速为400 rpm,空气流量为7 L/min,起始培养温度为37°C，2h后降至28°C，再用终浓度为0.05 mmol/L异丙基-P-D-硫代 半乳糖苷诱导；其中发酵培养基是由质量体积比分别为1%蛋白胨、0. 5%酵母粉、0. 3%琥珀酸、0. 2%甘氨酸和0. 2%葡萄糖组成，用氢氧化钠调节PH值为6. I ;
5)在菌体密度0D_达4时，将D-葡萄糖与前体混合反馈流加至发酵发酵液中，控制发液的PH为6. 2 ;
6)发酵培养初始采用20%体积分数的稀硫酸控制pH在5.9 ;培养6h后通过流加D-葡萄糖与补料培养基的混合物控制PH为6. 2 ;
所述的D-葡萄糖的含量为145g，补料培养基体积为1100ml，且含有80 g琥珀酸和63g甘氨酸；
7)在发酵至5.5h,进行75 min厌氧发酵,也即5. 5h停止搅拌,至6. 45h时恢复搅拌。米用Mauzerall和Granick的分析方法(参照MauzerallD, Granick S. J. Bio.Chem. , 1956，219:435 — 442)测定ALA的浓度。通过一次短暂厌氧发酵操作，并利用D-葡萄糖与补料培养基混合反馈流加的方法，胞外ALA的最高浓度可达到8. 2 g/L。实施例5
1)用接种针从保藏编号为CGMCCNo. 1939的工程菌Rosetta (DE3)-pET28a_A. R. hemA的甘油管中蘸取菌液，在含有50 u g/ml卡那霉素和40 u g/ml氯霉素的LB培养基平板上划线后，在37 °C下过夜培养；
2)将平板上的单克隆接种于含40mlLB培养基的250ml摇瓶中，转速为210rpm，在37°C下过夜培养，得到一级种子；
3)取3ml—级种子接种于多个含50ml LB培养基的500ml的摇瓶中培养4 h，得到二级种子；
4)将IOOml二级种子接种于含8 L发酵培养基的15 L发酵罐中进行发酵培养，发酵罐搅拌转速为300 rpm,空气流量为10 L/min，起始培养温度为37°C，2. 5h后降至30°C，再用终浓度为0.02 mmol/L异丙基-P-D-硫代半乳糖苷诱导；其中发酵培养基是由质量体积比分别为0. 5%蛋白胨、1%酵母粉、0. 5%琥珀酸、0. 3%甘氨酸和0. 1%葡萄糖组成，用氢氧化钠调节PH值为6. 0 ;
5)在菌体密度0D_达6时，将D-葡萄糖与前体混合反馈流加至发酵发酵液中，控制发液的pH为6. I ;
6)发酵培养初始采用20%体积分数的稀硫酸控制pH在5.8 ;培养5h后通过流加D-葡萄糖与补料培养基的混合物控制PH为6. I ;
所述的D-葡萄糖的含量为145g，补料培养基体积为900ml，且含有70 g琥珀酸和50g甘氨酸；
7)在发酵至5h,进行45min厌氧发酵,也即5h停止搅拌,至5. 75h时恢复搅拌。米用Mauzerall和Granick的分析方法(参照MauzerallD, Granick S. J. Bio.Chem. , 1956，219:435 — 442)测定ALA的浓度。通过一次短暂厌氧发酵操作，并利用D-葡萄糖与补料培养基混合反馈流加的方法，胞外ALA的最高浓度可达到7. 6 g/L。实施例6
用短暂厌氧发酵调节重组大肠杆菌代谢的方法，包括以下步骤
1)用接种针从保藏编号为CGMCCNo. 1939的工程菌Rosetta (DE3)-pET28a_A. R. hemA的甘油管中蘸取菌液，在含有50 u g/ml卡那霉素和40 u g/ml氯霉素的LB培养基平板上划线后，在37 °C下过夜培养；
2)将平板上的单克隆接种于含50mlLB培养基的250ml摇瓶中，转速为200rpm，在37°C下过夜培养，得到一级种子；
3)取Iml—级种子接种于多个含100ml LB培养基的500ml的摇瓶中培养3 h，得到二级种子；
4)将200ml二级种子接种于含9 L发酵培养基的15 L发酵罐中进行发酵培养，发酵罐搅拌转速为400 rpm,空气流量为7 L/min,起始培养温度为37°C，2h后降至28°C，再用终浓度为0.05 mmol/L异丙基-P-D-硫代半乳糖苷诱导；其中发酵培养基是由质量体积比分别为1%蛋白胨、0. 5%酵母粉、0. 3%琥珀酸、0. 2%甘氨酸和0. 2%葡萄糖组成，用氢氧化钠调节PH值为6. I ;
5)在菌体密度0D_达4时，将D-葡萄糖与前体混合反馈流加至发酵发酵液中，控制发液的PH为6. 2 ;
6)发酵培养初始采用20%体积分数的稀硫酸控制pH在5.9 ;培养6h后通过流加D-葡萄糖与补料培养基的混合物控制PH为6. 2 ;
所述的D-葡萄糖的含量为145g，补料培养基体积为1100ml，且含有80 g琥珀酸和63g甘氨酸；
7)在发酵至5h,进行45min厌氧发酵,也即5h停止搅拌,至5. 75h时恢复搅拌。米用MauzeralI 和Granick 的分析方法(参照MauzeralI D, Granick S. J. Bio.Chem. , 1956，219:435 — 442)测定ALA的浓度。由图3可见，通过一次短暂厌氧发酵操作， 并利用D-葡萄糖与补料培养基混合反馈流加的方法，胞外ALA的最高浓度可达到9. 4 g/L0
权利要求
1.一种用短暂厌氧发酵调节重组大肠杆菌代谢的方法，其特征在于如下步骤 步骤(I).用接种针从保藏编号为CGMCC No. 1939的工程菌Rosetta (DE3)-pET28a-A. ^.heniA的甘油管中蘸取菌液后，在含有30~ 50u g/ml卡那霉素和30 ~ 50 u g/ml氯霉素的LB培养基平板上划线，并将划线后的LB培养基平板放置于37°C下过夜培养； 步骤(2).将LB培养基平板上的单克隆接种于含30 ~ 50ml LB培养基的250ml摇瓶中，并放置在转速为200 - 220rpm，温度为37°C的摇床中过夜培养，得到一级种子； 步骤(3).取I ~ 5ml 一级种子接种于含50 ~ 100ml LB培养基的500ml的摇瓶中，并放置在转速为200 ~ 220rpm，温度为37°C的摇床中培养3 ^ 4h，得到二级种子； 步骤(4).将100 ~ 300ml 二级种子接种于含7 ~ 9 L发酵培养基的15 L发酵罐中进行发酵培养，发酵罐的搅拌转速为300 500rpm,空气流量为5 ~ 10 L/min，起始培养温 度为37°C ;2 ~ 3h后培养温度降至2b ~ 30°C,并用0. OZ ~ 0. 2mmol/L异丙基-P -D-硫代半乳糖苷诱导； 所述的步骤(4)中的发酵培养基是由质量体积比分别为0.5 ~ 2%蛋白胨、0. 2o ~ 1%酵母粉、0.3 ~ 1%琥珀酸、0.2 0. 4%甘氨酸和0.1 ~ 0.5%葡萄糖组成，其pH值为6.0 ~.6.3 ;发酵培养基最开始用10 ~ 20%体积分数的稀硫酸，将pH控制在5. 8 ~ 6. 0 ； 步骤(5).当菌体生长至5 - 6小时后，将发酵罐的搅拌转速调为0，发酵液中溶氧值随之变为0，维持30 ~ 75min的厌氧发酵后恢复发酵罐的搅拌转速； 所述的发酵液，在二级种子接种4 - Sh后通过反馈流加补料培养基，将发酵液的pH调为 6. I ~ 6. 3 ； 所述的补料培养基体积为800 ~ 1100ml，且含有70 ~ 90 g琥珀酸和50 ~ 70 g甘氨酸； 步骤(6).当菌体密度OD6tltl达到3 ~ 10时，分批或者连续补加5-氨基乙酰丙酸脱水酶抑制剂； 所述的5-氨基乙酰丙酸脱水酶的抑制剂为3 5g/L D-葡萄糖； 所述的步骤(I)中的保藏编号为CGMCC No. 1939工程菌，分类命名中文名为大肠埃希氏菌，拉丁文学名为 Escherichia coli Rosetta (DE3) _pET28a_A. R. hemA。
全文摘要
本发明公开了一种用短暂厌氧发酵调节重组大肠杆菌代谢的方法。传统方法生产的5-氨基乙酰丙酸的产量不高。本发明在重组大肠杆菌培养的一定阶段进行短暂的厌氧发酵，从而改变重组大肠杆菌的代谢行为，具体的改进措施包括在保藏编号为CGMCC No.1939的工程菌Rosetta(DE3)-pET28a-A.R.hemA的培养过程的一定阶段，进行30～75分钟的厌氧发酵，从而改变细胞的生理状态，适当降低细胞的生长速率，促进产物5-氨基乙酰丙酸的积累。本发明在发明200710068169.0的基础上，进一步改进5-氨基乙酰丙酸的发酵生产技术，所得的胞外5-氨基乙酰丙酸产量高，适合于工业化应用，前景广阔。
文档编号C12P13/00GK102747114SQ20121001356
公开日2012年10月24日 申请日期2012年1月17日 优先权日2012年1月17日
发明者傅维琦, 岑沛霖, 朱力, 杨俊 , 林建平 申请人:浙江大学, 苏州益安生物科技有限公司