专利名称:一种初步筛选次生代谢产物产生菌的方法
技术领域：
本发明涉及一种初步筛选次生代谢产物产生菌的方法。
背景技术：
微生物产生的次生代谢产物在人类生活中得到了广泛应用。最典型的莫过于1929年A.Fleming博士发现青霉素，经历了半个多世纪，青霉素不但得到了广泛的应用，而且有了许多重要发展，经久不衰。目前筛选次生代谢产物产生菌的方法很多，但是大部分可归为两大类。一类是直接根据待筛化合物的理化性质建立筛选方法和流程，如用液相色谱、薄层层析等层析的方法进行菌种发酵液的初筛，然后对初筛得到的嫌疑菌株用包括质谱、紫外光谱、红外光谱和核磁共振等在内的方法进行进一步的筛选和鉴定，最终确定嫌疑菌株产生的是否为目标次生代谢产物。如果待筛选菌株产生的的目标化合物具有比较容易检测的生物活性，可以采用第二类筛选方法，即在第一类方法中整合进基于生物活性检测方法的筛选流程。
为了建立快速而有效的次生代谢产物产生菌筛选方法，或者称之为筛选流程，初筛方法的选择十分关键初筛速度和效率往往决定了整个筛选的速度和效率。这是因为，次生代谢产物产生菌的筛选往往基于一个小到几千，大到十几万菌种的菌种库，所以通过初筛手段快速准确的挑出嫌疑菌株，大大缩小筛选范围是提高筛选速率的关键。专利CN1258743A发明的是一种快速筛选产醇腈酶微生物的方法，专利US 4,568,638发明的是一种筛选葡萄糖-2-氧化酶产生菌的方法，这两种方法都采用了生物活性检测方法作为初筛的手段，其关键点也都是如何建立快速有效的生物活性筛选方法。随着分子生物学方法的普及和广泛应用，一些筛选方法开始采用分子生物学技术作为筛选手段。专利02125509.1(公开号CN 1398986A)介绍了一种通过检测待筛菌株中是否含有目标抗生素合成基因的方法，作为初筛手段，来筛选目标抗生素产生菌。
虽然以上方法大大提高了筛选速度和/或准确率，有些也明显降低了相对筛选成本。然而，以上介绍的所有类型的筛选方法的筛选速度，还是不够快，特别是当基于一个大的菌种库筛选多种次生代谢产物时。
当筛选得到目标次生代谢产物产生菌后，为了作进一步的研究开发，特别是做进一步的科学研究、菌种选育和发酵生产，一般需要进行产生菌的菌种鉴定，即鉴定该菌种在微生物分类学上的位置，一般来讲，大多是鉴定该菌株的属、种甚至亚种。传统的菌种鉴定方法从形态特征和生理生化特征上进行。然而，分子分类学方法在菌种分类学鉴定上得到了广泛的应用，目前已经成为相对独立的分类学鉴定方法。最常用的分子分类学方法是基于核糖体小亚基RNA基因(SmallSubunit Ribosomal RNA Gene，SSU rRNA基因)编码区进行序列比对，或者利用位于SSU rRNA基因编码区3’和下游邻近的核糖体大亚基RNA基因(Large SubunitRibosomal RNA Gene，LSU rRNA基因)编码区5’之间的序列进行序列比对。SSUrRNA基因，对于原核细胞来讲，就是16s rRNA基因，对于真核细胞来讲，就是18srRNA基因。SSU-LSU rRNA基因编码区间的序列，对于原核细胞而言，就是16S～23S rRNA基因编码区间序列；对于真核细胞而言，就是18S～28S rRNA基因编码区间的序列。为了方便起见，这里所说的SSU rRNA基因，不仅仅包括SSU rRNA基因编码区，而且包括下游紧挨的SSU-LSU rRNA基因编码区间的序列。基于核糖体RNA(rRNA)序列分析的分子分类学方法建立在如下基本事实上分类学上越相近的物种，其rRNA基因序列的相似性越强；分类学上相隔越远的物种，其rRNA序列相似性越差。目前已经有了成熟的，进行序列比对和同源性分析的成熟实用的软件。利用这类软件，将未知菌株的上述序列跟大量已知种属的菌株的对应序列进行比对，并利用专门的软件进行亲缘关系分析，就可以比较准确的确定未知菌株在分类学上的位置。目前这类软件非常多，如Mega和Phylip等，并且可以利用庞大的互联网基因数据库，如Genebank进行在线分析，十分方便。一般而言，基于SSU rRNA基因序列进行分子分类学分析，可以将未知菌株确定到属、种，甚至亚种和菌株的水平。
目前，基于SSU rRNA序列的分子生物学技术主要用于各种用途的鉴定工作，如在微生物制药领域用于菌种分类学鉴定，在疾病检测领域用于特殊致病菌的检测。美国专利申请20040110247介绍了一种基于rRNA和rRNA基因检测微生物的存在和存活状态的方法，通过检测rRNA基因，可以检测微生物是否在样品中存在过，而通过定量检测rRNA的量，则可以检测微生物的数量。
在多年的次生代谢产物产生菌筛选和随后的菌种鉴定工作中，人们早就发现，某种特定的次生代谢产物产生菌往往局限在少数几个属，或者某个属中的几个种内，即，某种特定次生代谢产物产生菌具有一定程度上的分类学特异性。分类学上相差较远的菌，产生相同抗生素的可能性较小(Giancarlo Lancini等编著 王以光主译，《抗生素—多学科研究入门》，1998年，人民卫生出版社)。如，到目前为止，发现的10,000种微生物来源的生理活性物中，三分之二来源于放线菌，其次是真菌，以及细菌中有限的几个属。放线菌产生的活性物质，其中的链霉菌又占了大部分(《微生物制药》，吴剑波主编，2002年12月第一版，化学工业出版社)。又如，发现的青霉素产生菌绝大多数是青霉属，少数是曲霉属；目前发现的灰黄霉素的产生菌则均为青霉属；已发现的埃博霉素(Epothilones)的产生菌目前仅限于黏细菌中的纤维堆囊菌(Sorangium Cellulosum)(《抗生素与微生物产生的生物活性物质》，张致平和姚天爵主编，2005年1月第一版，化学工业出版社)。也有一些次生代谢产物产生菌的属种分布非常广，如青霉素产生菌有青霉属下的20多个种和曲霉属下几个种，高产菌则往往集中于产黄青霉等青霉属下的少数几个种。
需要说明的是，次生代谢产物产生菌并没有非常严格的属种专一性，这种属种相对专一性分布是长期以来实践中的统计学分析结果(Giancarlo Lancini等编著 王以光主译，《抗生素—多学科研究入门》，1998年，人民卫生出版社)。尽管如此，这些统计学分析结果可以为实际筛选工作提供重要的指导如果已经知道某种次生代谢产物产生菌的分类学类别，先从库中初步筛选在分类学上属于同一类别，或者比较相近的菌株，然后进行进一步筛选，往往能够大大缩短筛选周期和提高筛选效率。
目前这种次生代谢产物产生菌的属种相对专一性特点也被人们用于指导实际筛选工作。如人们在筛选某种特定次生代谢产物前，有时会根据文献报导的产生菌的属种相对特异性从菌种库中挑出特定属或种的菌株，然后再根据目标产物的理化或者生物学活性进行筛选。这种挑选一般是基于形态特征观察，而且由于没有量化、准确和便于快速鉴别的指标，而且也缺乏效率，费时费力，不适合菌种库容量达到几万菌株的大规模筛选。目前，还没有一种方法，将这种菌种分类学上的信息用于高通量筛选已知的次生代谢产物产生菌。
综上所述，针对几千甚至几万菌种容量的大菌种库进行大规模筛选，需要高通量的筛选方法来进行高效筛选，才可能大大缩短筛选周期，节约筛选成本。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种快速、有效的初步筛选次生代谢产物产生菌的方法。
本发明所提供的初步筛选次生代谢产物产生菌的方法，包括以下步骤
1)测定待筛选的菌种库中的每个菌株的核糖体小亚基RNA基因片段(SSU rRNA基因片段)的序列；2)将目标次生代谢产物的已知产生菌，或在分子分类学上与所述目标次生代谢产物的已知产生菌是同一个分类阶元的菌株作为参照菌株；以所述参照菌株的核糖体小亚基RNA基因片段序列作为参照核糖体小亚基RNA基因片段序列；将所述参照核糖体小亚基RNA基因片段序列与步骤1)中的所述待筛选的菌种库中的菌株的核糖体小亚基RNA基因片段序列进行一对一的同源性比对，和所述参照核糖体小亚基RNA基因片段序列的同源性大于等于根据筛选通过率确定的同源性数值的菌株即为初筛的嫌疑菌株。
所述嫌疑菌株和所述参照核糖体小亚基RNA基因片段序列同源性的高低可以根据筛选通过率的需要进行调节。
初筛嫌疑菌株的进一步筛选和鉴定可采用传统方法进行，如采用，但不局限于，生物活性筛选方法、液相色谱、质谱等进行进一步筛选和分析嫌疑菌株发酵液，并最终用精确的方法分析鉴定嫌疑菌株产生的是否为目标次生代谢产物。如对于小分子化合物的最终结构鉴定，常常采用红外光谱，紫外光谱、质谱和核磁共振等进行最终的结构鉴定。
该方法中，步骤1)和2)中所述核糖体小亚基RNA基因片段为选自下述a)、b)或c)中的一段长度大于等于100个核苷酸或100个核苷酸对的连续的多核苷酸序列a)核糖体小亚基RNA基因编码区序列，b)SSU-LSUr RNA基因编码区间的序列，c)核糖体小亚基RNA基因编码区和SSU-LSUr RNA基因编码区间的序列；所述SSU-LSU rRNA基因编码区间的序列是指位于核糖体小亚基RNA基因编码区的3’末端、和下游邻近的核糖体大亚基RNA基因(LSU rRNA基因)编码区的5’末端之间的序列。
所述核糖体小亚基RNA基因编码区是指核糖体小亚基RNA基因中编码核糖体小亚基RNA的核苷酸序列。
所述核糖体小亚基RNA基因片段的长度优选为150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、1500、1700、1800、2100或2300个核苷酸或核苷酸对，其中每个片段中至少30个核苷酸或核苷酸对来自于核糖体小亚基RNA基因编码区和/或SSU-LSUr RNA基因编码区间的可变区。
所述核糖体小亚基RNA基因片段优选为整个SSU rRNA基因编码区。
所述SSU rRNA基因，对于原核细胞来讲，就是16s rRNA基因，对于真核细胞来讲，就是18s rRNA基因。
所述SSU-LSU rRNA基因编码区间的序列，对于原核细胞而言，就是位于16SrRNA基因编码区3’末端和下游邻近的23S rRNA基因编码区5’末端之间的序列；对于真核细胞而言，就是位于18S rRNA基因编码区的3’末端和下游邻近的28SrRNA基因编码区的5’末端之间的序列。
步骤2)中，所述产生菌是指产生某化合物的微生物，包括真菌、真细菌和古细菌。
本发明的方法较适合于所述已知产生菌的分类学名称确定到属或属以下的目标次生代谢产物的嫌疑菌株的筛选。
所述分类学名称是指用于鉴定或者区分某物种的名称，它可能仅含属的名称，也可能既有属的名称，也有种的名称，甚至进一步包含亚种的名称。
所述嫌疑菌株是在筛选中得到的，可能会产生目标次生代谢产物的菌株。嫌疑菌株并不一定产生目标次生代谢产物。
所述参照菌株可为一株或多株。
当所述参照菌株为多株时，所述参照菌株可来自于同一分类阶元，也可来自不同分类阶元。
步骤2)中，所述参照菌株优选为目标次生代谢产物的已知产生菌，尤其优选为目标次生代谢产物的已知产生菌中最低分类阶元的菌株。
步骤2)中，所述参照核糖体小亚基RNA基因片段序列可与步骤1)中的所述待筛选的菌种库中的所有菌株或者部分菌株的核糖体小亚基RNA基因片段序列进行一对一的同源性比对。
步骤2)中，所述参照SSU rRNA基因片段是指采用SSU rRNA基因片段序列比对方法进行菌株筛选时，用于跟待筛选的菌种库中的所有菌株或者部分菌株的的SSU rRNA基因片段进行相似性比较的一条或者几条核酸序列，其对应的菌株称为“参照菌株”。与参照SSU rRNA基因片段同源性越高，越有可能被挑选出来作为初筛得到的嫌疑菌株。参照菌株可以是目标次生代谢产物产生菌，也可以是在分子分类学上与目标次生代谢产物产生菌非常相近的菌株，即与之同属、种甚至亚种的菌株。
步骤2)中，所述参照SSU rRNA基因片段序列可以是一条或多条序列。
本发明将SSU rRNA基因片段序列相似性比对的分子分类学技术用于筛选某种已知次生代谢产物的产生菌。该方法通过计算机软件在记载有各个待筛菌种SSUrRNA基因片段序列的数据库中进行序列比对，从而将原本耗时耗力的“实际筛选”工作转变成了速度很快效率极高的计算机数据分析和检索，从而成千倍的缩短了初筛时间。本发明的方法在大的菌种库中，如5,000菌株以上，筛选多种次生代谢产物时，能更加明显的显示快速有效的特点。
图1为提取的菌种基因组DNA凝胶电泳图谱图2为PCR产物凝胶电泳结果图3为用待筛菌种和参照菌株在内的6条SSU rRNA基因片段序列，采用“Neighbor-Joining”法构建的分子进化树图4为用待筛菌种和参照菌株在内的5条SSU rRNA基因片段序列，采用“Neighbor-Joining”法构建的分子进化树图5为土霉素标准样的液相色谱和正负离子流图谱图6为土霉素标准样在保留时间5.7min处的ES+和ES-质谱图图7为土霉素标准样在保留时间5.7min处的光吸收图谱图8为菌种11005发酵液提取物的液相色谱和正负离子流图谱图9为菌种11005发酵液提取物在保留时间5.7min处的质谱图图10为土霉素标准样在保留时间5.7min处的光吸收图谱图11为菌种11002发酵液提取物的液相色谱和正负离子流图谱具体实施方式
定义本发明的“数据库”，具有存储菌种相关的信息的功能，其中至少包括菌种的编号和对应SSU rRNA基因片段的信息。
本发明中的“序列比对算法”是指比较核苷酸序列间相似性的算法。
除非特别说明，本发明中的“菌种”和“微生物”的含义相同，均包括真菌，真细菌和古细菌。本发明中的“细菌”，包括真细菌和古细菌。
本发明中的微生物“分类学特异性”往往用于指微生物在属，种，或者亚种上的特异性，但是严格来讲，它泛指微生物分类学上的，各个分类阶元上的特异性。
如前所述，一方面，自从分子分类学，特别是基于SSU rRNA基因片段序列分析的分类学建立以后，得益于全球相关科学家的无私共享，分类学名称已知的微生物及其完整或者部分SSU rRNA基因序列越来越多地登记到了互联网数据库中。如在著名的GeneBank数据库中，几乎登记有所有已知的微生物种类的SSU rRNA基因片段序列，其SSU rRNA基因片段序列总数已达10万以上，这些庞大而多样的数据为进行基于SSU rRNA基因片段序列相似性比对，进而分析菌种间的分类和进化关系提供了可能。一般而言，分类学上越相近的微生物，其SSU rRNA基因片段的序列相似性，即同源性越强。基于SSU rRNA基因片段序列相似性比对的分子分类学技术已经相当成熟并且在微生物分类学上得到了广泛应用。另一方面，某种特定次生代谢产物产生菌具有一定程度上的分类学特异性，分类学上相差较远的菌，产生相同抗生素的可能性较小。这些统计学分析结果可以应用到实际筛选工作中，为从庞大的菌种库中快速高通量的筛选目标化合物的产生菌提供重要的指导。建立在以上两个重要的基础上，可以以SSU rRNA基因片段序列相似性比对作为辅助手段，从庞大的菌种库中快速筛选某种已知次生代谢产物产生菌。该方法的大致过程为(1)测定待筛选的菌种库中的每个菌株的SSU rRNA基因片段的序列；(2)确定要筛选的，微生物来源的目标次生代谢产物的产生菌，该目标产物产生菌要求在筛选前已经在学术界有报导；(3)从各种途径，如相关文献、GenBank等相关数据库，以及筛选者自己掌握的已知数据中，寻找到该类微生物的SSU rRNA基因片段序列，称之为参照SSU rRNA基因片段序列；(4)将参照SSU rRNA基因片段序列跟菌种库中的所有菌株或者部分菌株的SSU rRNA基因片段序列进行一对一同源比对，根据同源性分析结果，挑选跟参照序列同源性高的，一定数量的菌株作为初筛合格菌株，即初筛的嫌疑菌株；(6)初筛嫌疑菌株的进一步筛选和鉴定采用传统方法进行。序列同源性分析方法很多，可以，但不局限于将参照序列与本地数据库中的所有菌株的序列进行一对一相似性比对，选取与参照序列取相似性分值较高的序列的对应菌株作为初筛的嫌疑菌株，也可以将参照序列与库中的部分或者所有序列一起，做多序列比对并根据比对结果分析进化关系(如建立进化树)，选取与参照序列进化关系较近的序列对应的一个，或者多个菌株作为初筛的嫌疑菌株。对于比较大的菌种数据库，可以先用参照序列与库中所有序列进行BLAST，然后根据相似性分值从高到低，从库中选取一定数量的序列，再将这些序列与参照序列一起进行分子进化关系的分析，如构建分子进化树，然后选择进化关系较近的菌株作为初筛的嫌疑菌株。控制初筛嫌疑菌株数量的方法也很多，可以但不局限于，通过设定一个相似性和同源性阈值来控制，也可以直接根据菌种库的大小设定一个合适的初筛通过数量，然后根据相似性或者同源性从高到低进行嫌疑菌选择。采用不同的同源性分析方法，从同样的菌种库中得到的嫌疑菌株结果可能会有所不同。但是，由于目前学术界的建立的同源性分析方法经过了理论和实践的长期检验，因此都具有比较严格的科学性，这就可以保证与参照菌株在分子分类学上同源性很高的菌株不会遗漏。
可以通过提取待筛选的菌种库中的每个菌株的基因组DNA，然后用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)来特异性扩增基因组中的SSU rRNA基因片段，最后对扩增并纯化的产物进行测序，就得到每个菌株的SSU rRNA基因片段序列。为了对SSU rRNA基因片段进行PCR扩增，扩增引物的设计非常关键。SSUrRNA基因总体上具有相对保守性，并且在每条SSU rRNA基因序列中，不同区域的保守性不同，如SSU rRNA基因编码区内就有几个保守性相对差的多变区，多变区之间间隔了保守性相对较强的保守区。而SSU-LSU rRNA基因编码区间的序列总体上比SSU rRNA基因编码区更加不保守，这个不保守区的序列可以用于在种，甚至亚种水平的分子分类。为了以后的SSU rRNA基因测序，并且让序列比对达到区分具有不同分类学位置的菌株的SSU rRNA基因的目的，可以采用，但不局限于，通用性较强的SSU rRNA基因片段PCR引物。目前，许多文献报导了在不同分类水平上的PCR扩增或者测序通用引物，采用某属、某科甚至某界等通用引物进行PCR扩增，可以扩增出几乎所有的该种、该属或该科菌株的SSU rRNA基因片段。通过在GeneBank等数据库中进行检索，研究者也可以自己设计这样的在一定分类水平上的通用引物。对于SSU rRNA基因片段扩增或者测序，目前学术界已经报导了多条非常实用的真细菌界，古细菌界和真核生物界的各自通用引物，这使测定微生物库中的真核或原核微生物的SSU rRNA基因片段序列变得很容易。在实际PCR扩增中，有时候因为不能确定某种菌的大致分类学位置，可以将多套特定的引物对混合，来进行扩增。如，在实际PCR扩增之前，一般会对菌种库中的每个菌种在真细菌界，古细菌界和真核微生物界上进行大致分类，但是也可以不作初步的分类，而将针对不同界的引物混合起来，做PCR扩增以得到该菌种的SSU rRNA基因片段。菌种SSU rRNA基因片段的扩增并不局限于PCR的方法，其他的替代方法也可以应用，如循环测序(cycle sequencing)技术(Murray V.，Nucl.Acid.Res.，1998，178889)等。
为了便于记录和管理每个菌株的SSU rRNA基因片段序列，以及便于用序列比对分析程序对这些序列做相似性比对和检索，可以，但不局限于，将菌种库中每个菌株的SSU rRNA基因片段序列记录在一个数据库里，该SSU rRNA基因片段序列数据库将每个菌株与其SSU rRNA基因片段序列建立了一一对应关系，该数据库可以是独立的库，也可以是整合在其他数据库中，如整合在记录整个菌种库的数据库中。记录菌种库中每个菌株的SSU rRNA基因片段序列的记录也可以是其他形式，如可以是一个简单的FASTA格式的文件，这对于记录很小的菌种库非常方便。记录有多条序列信息的FASTA文件对多种序列比对软件兼容，可以方便的进行序列比对。总之，无论采用哪种文件形式来记录，应该能让分析软件快速对其中的每个SSU rRNA基因片段序列进行同源性分析。
微生物来源的，已经报导的某种次生代谢产物的产生菌分类学名称一般比较容易得到，如通过学术文献，专利文献，技术书籍，以及专业数据库等。已经报导的微生物来源的次生代谢产物产生菌，往往会确定到种或者属，但少数情况下也没有确定到属的，有些甚至仅仅确定到属以上(不包括属)的分类阶元。如果没有确定到属，则在SSU rRNA序列比对这个初筛阶段，检索的范围将变大，初筛特异性会有明显的降低，筛选效率也会有一定的下降。本发明的方法更适合于筛选那些产生菌分类学名称确定到属或者属以下的次生代谢产物。对于没有任何分类学信息的次生代谢产物产生菌，本方法不适用，如果某种次生代谢产物产生菌的分类学名称仅仅确定到界，如仅仅知道为原核微生物，基于该方法进行的筛选实际上没有明显的优点。
确定了某种次生代谢产物产生菌分类学名称以后，接下来就是确定“参照SSUrRNA基因片段序列”。如果目标次生代谢产物产生菌的分类学名称已经确定到一定分类阶元，如已经确定到属或属以下，一般倾向于采用对应于最低分类阶元的SSU rRNA基因片段序列作为参照序列，也即倾向于采用属于该最低阶元的菌株作为参照菌，特别是倾向于直接采用该次生代谢产物产生菌的SSU rRNA基因片段序列作参照。但参照菌株和参照SSU rRNA基因片段序列的选择并不局限于此即使产生菌的SSU rRNA基因片段序列可以得到，也可以不直接选择产生菌，而是选择其他的，属于该最低阶元的菌作为参照菌株。如果已报道的某种次生代谢产物产生菌并没有严格的分类学专一性，特别是并不专一于某一特定的种，对于筛选这样的次生代谢产物产生菌，分类学上不同类别的多个菌株的SSU rRNA基因片段序列均可作为参照序列，因此参照菌株及其SSU rRNA基因片段，即参照片段的选择策略变得很多样，可以采用，但并不局限于这两种方法(1)从分类学上不同类别的产生菌中选取其中一类菌作为参照菌株，如青霉素的高产菌为产黄青霉菌的概率很大，则可选取产黄青霉菌作为参照菌株筛选青霉素产生菌；(2)从分类学上不同类别的产生菌中选取其中几个或者所有的类别，分别作为参照菌株来进行筛选。如果手头有待筛选的次生代谢产物产生菌，可以将其SSU rRNA基因片段进行测序，然后作为参照序列，特别是当从其他途径找不到合适的参照序列时，这种方法是很有效的。多数情况下，不管采用哪种策略选择参照SSU rRNA基因片段序列，符合条件的参照序列不止一条，选择任何一条序列，或者选择多条序列同时作为参照序列都是可行的。
确定了参照SSU rRNA基因片段序列后，便可以将菌种库中的每个菌株的SSUrRNA基因片段序列与参照序列进行同源性分析。筛选时需要设定一个筛选的标准，将符合标准的菌株作为嫌疑菌株。可以采用多种方法进行同源性分析，这些方法基本类似，但是不完全相同。可以采用，但不局限于以下三种方法进行同源性分析(1)利用常用的算法，将库中的每个菌株的SSU rRNA基因片段序列与参照序列进行一对一比对并得到序列相似性分析结果。根据分析结果，设定一个相似性阈值，与参照序列的相似性高于阈值的SSU rRNA基因片段序列对应的菌株，即是嫌疑菌株。阈值的高低可以根据筛选者的需要进行调节，以此达到控制筛选通过率的目的。目前已经有许多程序可以进行一对一核酸序列比对，如BLAST程序等。(2)将参照序列与多条待筛选的菌株的SSU rRNA基因片段序列放在一起，建立分子进化树，按照优先选择跟参照序列距离较近的SSU rRNA基因片段序列的原则，选择一定数量的SSU rRNA基因片段序列，即选择这些序列对应的菌株作为嫌疑菌。(3)先按照方法(1)进行序列相似性比对，然后按相似性从高到低选择一定数量的SSU rRNA基因序列，再按方法(2)将参照序列跟这些所选择的这些序列放在一起建立进化树进行分析，选择一定数量的嫌疑菌株。所有这些分析程序，可以是目前已经商业化的程序，包括免费程序，也可以是自己定制的专用程序。
初筛嫌疑菌株的进一步筛选和化合物结构鉴定则采用合适的传统方法进行，如采用，但不局限于，生物活性筛选方法、液相色谱、质谱等进行进一步筛选和分析嫌疑菌株发酵液，并最终用精确的方法分析鉴定嫌疑菌株产生的是否为目标次生代谢产物。如对于小分子化合物的最终结构鉴定，常常采用红外光谱，紫外光谱、质谱和核磁共振等进行最终的结构鉴定。
由于本发明是用来筛选结构、功能已经在科学界被研究和报道的，并且建立了完整的结构鉴定和功能检测方法的微生物次生代谢产物，因此初筛嫌疑菌株的进一步筛选和化合物结构鉴定可以采用这些已经报道的成熟方法进行，这里不再赘述。
以下举几个例子以更好的说明本发明，但是本发明并不局限于这些例子。
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1、初步筛选土霉素产生菌的嫌疑菌株1、微生物基因组DNA的提取菌种10073，10025(中国工业微生物菌种保藏管理中心)均为枯草芽孢杆菌；菌种11005(中国工业微生物菌种保藏管理中心)为龟裂链霉菌，产土霉素；菌种11002(中国工业微生物菌种保藏管理中心)为灰色链霉菌，产链霉素。菌种A-1为从土壤中分离的一株菌，疑为真菌，具体种属未知。所有菌种采用无菌LB培养液(1％胰化蛋白胨，0.5％酵母膏，1％NaCl，蒸馏水配，pH7.0)复苏和培养，培养于装有5ml对应培养液的试管中，A-1的试管中还加入1g直径4mm的无菌玻璃珠。所有菌种于220转/分钟，30℃振荡培养至OD600值为0.6后，取1.5ml菌液，采用Easy-DNA试剂盒(Invitrogen)，按照试剂盒说明书提取基因组DNA，并最终将提取得到的每种菌的DNA溶于100μl TE缓冲液中。提取的基因组DNA样品各取5μl，采用0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳，EB显色进行检测，结果见图1所示，表明成功的提取了各个菌种的基因组DNA，各个基因组DNA片段大小均在10kb以上。图1中，泳道1为GenRuler 1kb DNA Ladder(Fermentas)，其最大的条带为10kb。泳道2、3、4、5、6依次为10073基因组DNA，10025基因组DNA，11005基因组DNA，11002基因组DNA，A-1基因组DNA。
2、微生物SSU rRNA基因片段的扩增、测序和记录采用PCR方法分别对步骤1中提取得到的各个菌种基因组DNA片段中的SSUrRNA基因片段进行扩增。每个菌种单独一个反应体系。引物BSF8/20(5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’)和BSR1541/20(5’AAGGAGGTGATCCAGCCGCA3’)用于扩增真细菌(10073，10025，11005和11002)SSU rRNA基因片段，引物NSF4/18(5’CTGGTTGATYCTGCCAGT3’)和NSR1787/18(5’CYGCAGGTTCACCTACRG3’)用于扩增真核生物A-1 SSU rRNA基因片段，其中NSF4/18和NSR1787/18均为简并引物，“Y”代表C/T简并(http://www.psb.ugent.be/rRNA/ssu/index.html)。每条引物(简并引物作为一条看待)均配成20μM。反应体系中加入0.25μl ExTaq(5U/μl，Takara)，5μl 10×Ex Taq Buffer(Mg2+ Plus，Takara)，4μldNTP混合物(各2.5mM，Takara)，1μl菌种基因组DNA，引物BSF8/20、BSR1541/20、NSF4/18和NSR1787/18各1μl，最后加入ddH2O补充到总体积50μl。反应条件为94℃预热5min；然后94℃解链1min，52℃退火1min，72℃延伸2min，扩增30个循环后72℃额外延伸5min，最后4℃保温。PCR产物各取20μl，采用0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳，EB显色进行检测，结果如图2所示，表明除了A-1的PCR产物大小约为1.8kb，其他的均约为1.5kb。图2中，泳道1为GenRuler 1Kb DNALadder(Fermentas)，泳道2、3、4、5、6依次为10073，10025，11005，11002，A-1的PCR产物。
为了进一步测序，切下凝胶中10025，10073，11005和11002的PCR产物在1.5kb附近的条带，切下A-1的PCR产物在1.8kb附近的条带，均采用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(Sangon)进行回收。其中10025，10073，11005的胶回收产物直接送Invitrogen上海(原上海博亚公司)测序。11002的胶回收产物进一步连接到克隆载体pGEM-T-easy(Promega)上并转化入大肠杆菌DH5α中，通过蓝白斑筛选和PCR的方法挑选重组质粒，然后将重组质粒送Sangon进行测序；A-1的胶回收产物也如11002的产物连接到克隆载体pGEM-T上，最后将挑选出的重组质粒送Invitrogen上海进行测序。测序结果如序列表中序列1至5所示，10025具有序列表中序列1的核苷酸序列，由1445个核苷酸组成；10073具有序列表中序列2的核苷酸序列，由1444个核苷酸组成；11005具有序列表中序列3的核苷酸序列，由1413个核苷酸组成；A-1具有序列表中序列4的核苷酸序列，由1778个核苷酸组成；11002具有序列表中序列5的核苷酸序列，由1519个核苷酸组成。所有这些序列都通过在Genbank上进行同源比对，确认为对应菌株的SSU rRNA基因片段的正义链。
3、以SSU rRNA基因片段序列比对方法初步筛选土霉素产生菌的嫌疑菌株将以上测出的5个菌种的SSU rRNA基因片段序列分别用DNAStar软件中的Editseq程序处理，并分别保存为“.Seq”格式的文件。为了便于后面的数据分析，将这五个文件用Editseq程序同时打开，并输出为一个记录了这五条序列信息的FASTA格式的文件。具体操作为，用Editseq打开这五个文件以后，点击“File”菜单下的“Export all as one”命令，保存为FASTA格式的文件“Local_database.Fas”。
土霉素产生菌的分类学位置可以通过多种途径了解到，本实施例中参考了《抗生素与微生物产生的生物活性物质》(张致平和姚天爵主编，2005年1月第一版，化学工业出版社)、Pubmed信息和ATCC在线数据库，通过信息检索了解到有些高产菌属于streptomyces riosus这个种。在GenBank的Nucleotide数据库中按“riosus”和“rRNA”关键词进行检索，得到多个属于streptomyces riosus种的菌株的SSU rRNA基因片段序列信息，通过初步的同源性比对，选取其中具有代表性的，一条名称为“Streptomyces rimosus subsp.rimosus”的菌株作为“参照SSU rRNA基因片段序列”(GenBank AcessionAB045883；GI10038685)，其序列信息见序列表中序列6。
然后将菌株10025，10073，11005、11002和A-1的SSU rRNA基因片段序列与“参照SSU rRNA基因片段序列”做同源性比对，将同源性较高的序列对应的菌株作为土霉素嫌疑产生菌。步骤如下1)用BioEdit 6.0.7软件将记载有5个待筛菌株SSU rRNA基因片段信息的文件“Local_database.Fas”设置为本地数据库，然后用参照SSU rRNA基因片段序列与该数据库进行本地BLAST(Local BLAST)，结果见表1。
2)选取BLAST分值显著高于其他菌株的11005和11002作为土霉素嫌疑产生菌，以作进一步的筛选检测。其中11002分值为2936，11005为2795。
表1.参照SSU rRNA基因片段序列在本地SSU rRNA基因片段数据库中的BLAST简要结果BLASTN 2.2.2[Dec-14-2001]ReferenceAltschul，Stephen F.，Thomas L.Madden，Alejandro A.Schaffer，Jinghui Zhang，Zheng Zhang，Webb Miller，and David J.Lipman(1997)，″Gapped BLAST and PSI-BLASTa new generation of protein database searchprograms″，Nucleic Acids Res.253389-3402.
Query＝Streptomyces_rimosus_subsp._rimosus.seq(1485 letters)Databased/PROGRA～1/bioedit/database/Local_database.fas5 sequences；7599 total lettersSequences producing significant alignments Score(bits) E Value11002.seq 2936 0.011005.seq 2795 0.0
10025.seq 228 2e-06210073.seq 210 4e-057A-1.seq 40 9e-006作为一种替代方法，也可以通过做多序列比和分子进化树来进行初筛。做法如下1)用Mega3.0软件，将10025，10073，11005、11002和A-1的SSU rRNA基因片段序列，以及“参照SSU rRNA基因片段序列”，采用Clustal W方法进行多序列比对，基于多序列比对结果，采用“Neighbor-Joining”方法构建进化树，进化树结果见图3。
2)选取与参照菌株进化关系明显比其他菌株近的两株菌，即11002和11005作为土霉素嫌疑产生菌，以作进一步筛选检测。
另外，可以将以上两种方法综合起来进行嫌疑菌株的初步筛选。如通过LocalBLAST筛选排除分值仅为40的A-1，然后对10025，10073，11005、11002和参照序列构建进化树，结果见图4，明显可以看出，11002和11005与参照菌株形成一个相对紧密的群，与10025和10073形成的群区别开来，因此从中筛选11002和11005作为土霉素嫌疑产生菌。
实施例2、初筛嫌疑菌株的进一步筛选——高效液相色谱-质谱联用仪检测嫌疑菌株的发酵液按照中国工业微生物菌种保藏管理中心产品目录中，菌种发酵培养基为花生饼2％，磷酸氢二钾0.01％，淀粉6％，NaCl 0.5％，玉米浆0.5％，碳酸钙0.8％，用盐酸调pH值为6.9。实施例1中用LB培养基培养的嫌疑菌株按1％(体积比)的接种量，接种于装有5ml灭菌的发酵培养基的试管中，30℃培养2天，然后按10％(体积比)接种量转接于装有50ml发酵培养基的摇瓶中，30℃培养4天。
用草酸将5ml发酵液pH调至2.0，室温下振荡20分钟，然后过滤除去菌体，得到澄清滤液。滤液用0.2M NaOH调至pH4.7，室温放置60min，经过过滤，干燥得固体，放入1.5ml聚丙烯离心管，管中加入200μl二甲亚砜(分析纯，Sigma)，40℃保温1小时，10,000g离心5min，收集上清液于一个新的1.5ml离心管，从而制成11002和11005的发酵液提取物。
采用高效液相色谱-质谱联用法检测嫌疑菌株11005和11002的发酵液提取物，进样量为土霉素游离碱标准样(Sigma)5μl，11002和11005的提取物各100μl。高效液相色谱检测条件为Waters 2690高效液相色谱仪(Waters)，Waters996全波长检测器(Waters)全波长扫描，Angilent公司C18色谱柱，流动相A为10mM乙酸铵，流动相B为5％-95％乙腈梯度，梯度变化时间0-10min。质谱检测条件为Waters ZMD质谱仪(Waters)，电喷雾电离源，电喷雾电压3.0V，电喷雾接口干燥器流速250L/hr，脱溶剂温度250℃，碰撞诱导解离电压30V，离子源温度120℃。高效液相色谱-质谱联用法检测结果如图5-11所示。图5表明土霉素的液相色谱保留时间为5.7min左右，该处出现单一的光吸收峰和离子流峰，从上到下依次为液相色谱图、负离子流图谱和正离子流图谱。图6为土霉素标准样在5.7min处的质谱图，其中ES+图谱(图6中上侧图谱)中的461.5峰为土霉素的特征峰(土霉素游离碱分子量为460.4)，而483.4峰为加Na+的峰，亦为土霉素特征峰；ES-图谱(图6中下侧图谱)中的459.4为特征峰。图7为保留时间5.7min处土霉素标准样品的光吸收图谱，其中274nm和356nm附近为土霉素的两个特征吸收峰。图8是11005发酵液提取物的液相色谱和正负离子流图谱(上到下依次为液相色谱图、负离子流图谱和正离子流图谱)，在土霉素的保留时间5.7min处出现了光吸收峰和离子流峰，说明该发酵液提取物可能含有土霉素。图9是11005样品在5.7min处的质谱图，出现了土霉素标准样在ES+图谱(图9的上侧图谱)中的两个特征峰461.4和483.4，以及在ES-(图9的下侧图谱)中的特征峰459.4。图10进一步显示了11005样品在5.7min附近的光吸收图谱，其光吸收图谱不仅在274.6nm和356.6nm出现了土霉素标准样的两个特征吸收峰，而且整个光图谱与土霉素标准样一致。图10中274.6和356.6为土霉素特征吸收峰。综合这几个检测结果，可以初步判定11005发酵液含有土霉素。
图11是11002发酵液提取物的液相色谱图，可以看出，11002样品在土霉素的保留时间5.7min附近没有明显的光吸收峰和离子流峰出现。可以初步判定嫌疑菌株11002不产土霉素。图11中从上到下依次为液相色谱图、负离子流图谱和正离子流图谱。
因此，在SSU rRNA基因片段序列比对方法的辅助下，采用液相色谱-质谱联用方法成功的从五株菌中筛选得到一株土霉素产生菌11005，并成功的将初筛得到的土霉素嫌疑产生菌11002排除掉。该筛选结果与购买时菌种提供方提供的菌种信息也是吻合的，说明该筛选方法有效。
需要说明的是，基于大的菌种库，如5,000菌株以上，筛选多种次生代谢产物时，本发明展示的方法能更加明显的显示快速有效的特点，这些特点是跟该发明的这固有特点分不开的即在初筛时，将原本繁琐的实际筛选工作，变成利用计算机软件直接对“海量的”菌种的SSU rRNA进行高速的数据分析和检索，从而成千倍的缩短了初筛时间。虽然以上实施例并不是基于一个大的菌种库进行，但是任何从事活性次生代谢产物产生菌筛选，以及生命科学和信息科学领域的技术人员，都能很容易的通过这些实施例合理的推理并理解本发明的技术特点，即基于大菌种库进行多个品种的筛选的快速和有效性。
序列表<160>6<210>1<211>1445<212>DNA<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)<220>
<223>
<400>1tgcgagtcga gcggacagat gggagcttgc tccctgatgt tagcggcgga cgggtgagta 60acacgtgggt aacctgcctg taagactggg ataactccgg gaaaccgggg ctaataccgg 120atgcttgttt gaaccgcatg gttcagacat aaaaggtggc ttcggctacc acttacagat 180ggacccgcgg cgcattagct agttggtgag gtaacggctc accaaggcga cgatgcgtag 240ccgacctgag agggtgatcg gccaaactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga 300ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga cggagcaacg ccgcgtgagt 360gatgaaggtt ttcggatcgt aaagctctgt tgttagggaa gaacaagtgc cgttcaaata 420gggcggcacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc 480ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg aattattggg cgtaaagggc tcgcaggcgg 540tttcttaagt ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg agggtcattg gaaactgggg 600aacttgagtg cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag cggtgaaatg cgtagagatg 660tggaggaaca ccagtggcga aggcgactct ctggtctgta actgacgctg aggagcgaaa 720gcgtggggag cgaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgagtgcta 780agtgttaggg ggtttccgcc ccttagtgct gcagctaacg cattaagcac tccgcctggg 840gagtacggtc gcaagactga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag 900catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat cctctgacaa 960tcctagagat aggacgtccc cttcgggggc agagtgacag gtggtgcatg gttgtcgtca 1020gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg atcttagttg 1080ccagcattca gttgggcact ctaaggtgac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga 1140tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atgggcagaa 1200caaagggcag cgaaaccgcg aggttaagcc aatcccacaa atctgttctc agttcggatc 1260gcagtctgca actcgactgc gtgaagctgg aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg 1320cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccacgaga gtttgtaaca 1380cccgaagtcg gtgaggtaac ctttttggag ccagccgccg aaggtgggac agatgattgg 1440ggtga 1445<210>2<211>1444
<212>DNA<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)<220>
<223>
<400>2tgcgagtcga gcggacagat gggagcttgc tccctgatgt tagcggcgga cgggtgagta 60acacgtgggt aacctgcctg taagactggg ataactccgg gaaaccgggg ctaataccgg 120atggttgttt gaaccgcatg gttcaaacat aaaaggtggc ttcggctacc acttacagat 180ggacccgcgg cgcattagct agttggtgag gtaacggctc accaaggcga cgatgcgtag 240ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga 300ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga cggagcaacg ccgcgtgagt 360gatgaaggtt ttcggatcgt aaagctctgt tgttagggaa gaacaagtac cgttcgaata 420gggcggtacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc 480ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg aattattggg cgtaaagggc tcgcaggcgg 540tttcttaagt ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg agggtcattg gaaactgggg 600aacttgagtg cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag cggtgaaatg cgtagagatg 660tggaggaaca ccagtggcga aggcgactct ctggtctgta actgacgctg agagcgaaag 720cgtggggagc gaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgagtgctaa 780gtgttagggg tttccgcccc ttagtgctgc agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga 840gtacggtcgc aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca 900tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc tctgacaatc 960ctagagatag gacgtccctt tcgggggcag agtgacagct ggtgcatggt tgtcgtcagc 1020tcgtgtcctg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgat cttagttgcc 1080agcattcagt tgggcactat aaggtgaccg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatc 1140acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat ggacagaaca 1200aagggcagag aaaccgcgag gttaagccaa tcccacaaat ctgttctcag ttcggatcgc 1260agtctgcaac tcgactgcgt gaagctggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg 1320gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc 1380cgaagtcggt gaggtaacct tttaggagcc agccgccgaa ggtgggacag atgattgggg 1440tgaa 1444<210>3<211>1413<212>DNA<213>龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)<220>
<223>
<400>3gcgagtcgaa cgatgaagcc cttcggggtg gattagtggc gaacgggtga gtaacacgtg 60ggcaatctgc cctgcactct gggacaagcc ctggaaacgg ggtctaatac cggatatgac 120acacgaccgc atggtctgtg tgtggaaagc tccggcggtg caggatgagc ccgcggccta 180tcagcttgtt ggtggggtaa tggcctacca aggcgacgac gggtagccgg cctgagaggg 240cgaccggcca cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtgggga 300atattgcaca atgggcgcaa gcctgatgca gcgacgccgc gtgagggatg acggccttcg 360ggttgtaaac ctctttcagc agggaagaag cgcaagtgac ggtacctgca gaagaagcgc 420cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtagggc gcaagcgttg tccggaatta 480ttgggcgtaa agagctcgta ggcggcttgt cgcgtcggat gtgaaagccc ggggcttaac 540cccgggtctg cattcgatac gggcaggcta gagttcggta ggggagatcg gaattcctgg 600tgtagcggtg aaatgcgcag atatcaggag gaacaccggt ggcgaaggcg gatctctggg 660ccgatactga cgctgaggag cgaaagcgtg gggagcgaac aggattagat accctggtag 720tccacgccgt aaacgttggg aactaggtgt gggcgacatt ccacgtcgtc cgtgccgcag 780ctaacgcatt aagttccccg cctggggagt acggccgcaa ggctaaaact caaaggaatt 840gacgggggcc cgcacaagcg gcggagcatg tggcttaatt cgacgcaacg cgaagaacct 900taccaaggct tgacatacac cggaaacctc tggagacagg ggcccccttg tggtcggtgt 960acaggtggtg catggctgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac 1020gagcgcaacc cttgttctgt gttgccagca tgcctttcgg ggtgatgggg actcacagga 1080gactgccggg gtcaactcgg aggaaggtgg ggacgacgtc aagtcatcat gccccttatg 1140tcttgggctg cacacgtgct acaatggccg gtacaatgag ctgcgatacc gcgaggtgga 1200gcgaatctca aaaagccggt ctcagttcgg attggggtct gcaactcgac cccatgaagt 1260cggagtcgct agtaatcgca gatcagcatt gctgcggtga atacgttccc gggccttgta 1320cacaccgccc gtcacgtcac gaaagtcggt aacacccgaa gccggtggcc caaccccttg 1380tgggagggaa tcgtcgaagg tgggactggc gat 1413<210>4<211>1778<212>DNA<213>未知<220>
<223>
<400>4ctggttgatc ctgccagtag tcatatgctt gtctcaaaga ttaagccatg catgtctaag 60tataagcaat ctatactgtg aaactgcgaa tggctcatta aatcagttat cgtttatttg 120atagtacctt actacatgga tacctgtggt aattctagag ctaatacatg ctaaaaaccc 180cgacttcggg aggggtgtat ttattagata aaaaaccaat gcccctcggg gctccttggt 240
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<223>
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<223>
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权利要求
1.初步筛选次生代谢产物产生菌的方法，包括以下步骤1)测定待筛选的菌种库中的每个菌株的核糖体小亚基RNA基因片段的序列；2)将目标次生代谢产物的已知产生菌，或在分子分类学上与所述目标次生代谢产物的已知产生菌是同一个分类阶元的菌株作为参照菌株；以所述参照菌株的核糖体小亚基RNA基因片段序列作为参照核糖体小亚基RNA基因片段序列；将所述参照核糖体小亚基RNA基因片段序列与步骤1)中的所述待筛选的菌种库中的菌株的核糖体小亚基RNA基因片段序列进行一对一的同源性比对，和所述参照核糖体小亚基RNA基因片段序列的同源性大于等于根据筛选通过率确定的同源性数值的菌株即为初筛的嫌疑菌株。
2.根据权利要求
1所述的方法，其特征在于步骤1)和2)中所述核糖体小亚基RNA基因片段为选自下述a)、b)或c)中的一段长度大于等于100个核苷酸或100个核苷酸对的连续的多核苷酸序列a)核糖体小亚基RNA基因编码区序列，b)SSU-LSUr RNA基因编码区间的序列，c)核糖体小亚基RNA基因编码区和SSU-LSUr RNA基因编码区间的序列；所述SSU-LSU rRNA基因编码区间的序列是指位于核糖体小亚基RNA基因编码区的3’末端和下游邻近的核糖体大亚基RNA基因编码区5’末端之间的序列。
3.根据权利要求
2所述的方法，其特征在于所述核糖体小亚基RNA基因片段的长度为150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、1500、1700、1800、2100或2300个核苷酸或核苷酸对，其中每个片段中至少30个核苷酸或核苷酸对来自于核糖体小亚基RNA基因编码区和/或SSU-LSUr RNA基因编码区间的可变区。
4.根据权利要求
3所述的方法，其特征在于所述核糖体小亚基RNA基因片段为整个SSU rRNA基因编码区。
5.根据权利要求
1所述的方法，其特征在于所述已知产生菌的分类学名称确定到属或属以下。
6.根据权利要求
1至5中任一所述的方法，其特征在于步骤2)中，所述参照菌株为产生目标次生代谢产物的已知产生菌。
7.根据权利要求
6所述的方法，其特征在于所述参照菌株为目标次生代谢产物的已知产生菌中最低分类阶元的菌株。
8.根据权利要求
1至5中任一所述的方法，其特征在于所述参照菌株为一株或多株。
9.根据权利要求
8所述的方法，其特征在于所述参照菌株为多株；所述参照菌株来自于同一分类阶元或不同分类阶元。
10.根据权利要求
1至5中任一所述的方法，其特征在于所述参照核糖体小亚基RNA基因片段序列为一条或多条。
专利摘要
本发明公开了初步筛选次生代谢产物产生菌的方法。该方法包括以下步骤1)测定待筛选的菌种库中的每个菌株的核糖体小亚基RNA基因片段的序列；2)将目标次生代谢产物的已知产生菌，或在分子分类学上与所述目标次生代谢产物的已知产生菌是同一个分类阶元的菌株作为参照菌株；以所述参照菌株的核糖体小亚基RNA基因片段序列作为参照核糖体小亚基RNA基因片段序列；将所述参照核糖体小亚基RNA基因片段序列与步骤1)中的所述待筛选的菌种库中的菌株的核糖体小亚基RNA基因片段序列进行一对一的同源性比对，和所述参照核糖体小亚基RNA基因片段序列的同源性大于等于根据筛选通过率确定的同源性数值的菌株即为初筛的嫌疑菌株。
文档编号C12Q1/68GKCN1966717SQ200510114891
公开日2007年5月23日 申请日期2005年11月17日
发明者彭晶生 申请人:彭晶生导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan