使用细菌细胞色素p450从奥美拉唑制备代谢物的新方法和用于其的组合物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种使用细菌细胞色素P450从奥美拉唑制备代谢物的新方法和用于该新方法的组合物，更具体而言，涉及用于从奥美拉唑制备5'-羟基产物的组合物和试剂盒及其制备方法，所述组合物和试剂盒含有细菌细胞色素P450BM3(CYP102A1)或其突变形式。所述组合物、试剂盒和方法能够从奥美拉唑经济高效地大规模制备5'-羟基产物，因此会对使用奥美拉唑的代谢物的新型药物的开发作出显著贡献。
【专利说明】使用细菌细胞色素 P450从奥美拉唑制备代谢物的新方法 和用于其的组合物
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种使用细菌细胞色素 P450从奥美拉唑制备代谢物的新方法和用于 该新方法的组合物，更具体而言，涉及用于从奥美拉唑制备5' -羟基产物的组合物和试剂 盒及其制备方法，所述组合物和试剂盒含有细菌细胞色素 P450BM3 (CYP102A1)或其突变形 式。
【背景技术】
[0002] 奥美拉唑是质子泵抑制剂，已知其是消化不良、胃溃瘍、胃食管反流病和咽喉反流 病的治疗剂。奥美拉唑是外消旋体，含有比例为50:50的S和R对映异构体。在以上酸性 条件下，这两种对映异构体都转化成非手性化合物，并且与H+/K+ATP酶的半胱氨酸基团反 应，从而抑制胃壁细胞中的胃酸产生。奥美拉唑和对映异构体被存在于人肝脏中的细胞色 素 P450CYP2C19和CYP3A4代谢，其主要代谢物包括5' -0-脱甲基奥美拉唑、5' -和3' -羟 基奥美拉唑以及奥美拉唑讽（参见Renberg等，Drug Metab Dispos 17:69-76,1989; Andersson 等,Clin Pharmacokinet 40:411-426,2001 ;Li 等,J Pharmacol Exp Ther 315:777-787, 2005)。据报道，R对映异构体通常被CYP2C19代谢为5' -0-脱甲基奥美拉唑、 5' -羟基奥美拉唑，S对映异构体通常被CYP3A4代谢为奥美拉唑砜、3' -羟基奥美拉唑。
[0003] 细胞色素 P450(P450或CYP)酶是个大家族，该家族由多种酶组成，这些酶充当从 古细菌至细菌、真菌、植物、动物和人的整个自然界中的多种多样的氧化反应的催化剂。由 于催化功能的多样性以及其底物范围广，P450可大规模地用作制备精细化工品（包括药 物供应等）时的生物催化剂（参见 Guengerich，Nat Rev Drug Discovl:359_366,2〇〇2; Urlacher 等，Trends Biotechnol24:324-330, 2006 ;Yun CH 等，Trends Biotechnol 25:289-298, 2007 ;Lamb 等，Curr Opin Biotechnol 18:504-512, 2007)。但是，虽然哺乳动 物的细胞色素 P450酶在各种上述生物【技术领域】中具有潜在的可用性，但是P450的稳定性、 催化活性和可获得性较低，因此不适合作为生物催化剂。
[0004] 当在开发药物期间人利用P450将前药转化为生物"活性代谢物"时（参见Johnson 等，Breast Cancer Res. Treat85:151-159, 2004)，需要大量的纯代谢物来研究该药物的功 效、毒性和药代动力学等。此外，当代谢物自身具有生物活性时，体内直接施用所述代谢物 具有巨大裨益，因此大规模生产所述代谢物是重要的。
[0005] 当将奥美拉唑施用至人体中时，由于奥美拉唑被CYP2C19和CYP3A4代谢，代谢物 产生的速率会根据酶的表达程度而有所不同。另外，会出现药物与被所述酶代谢的其他药 物相互作用的问题。因此，当将奥美拉唑代谢物直接用作药物时，可以避免药物相互作用问 题。
[0006] 但是，由于在化学合成纯代谢物时存在各种问题，为了以替代代谢物化学合成的 方式产生药物代谢物或药物候选物，使用了 P450。已经报道了使用表达自大肠杆菌（参 见 Yun 等，Curr Drug Metab7:411_429, 2〇〇6)或昆虫细胞（参见 Rushmore 等，Metab Eng2:115-125, 2000 ;Vail 等，J Ind Microbiol Biotechnol32:67-74, 2005)的人 P450 来 生产所述代谢物。但是，由于稳定性有限和反应速率低等原因，这些体系具有诸如成本昂贵 和产生率低等问题（参见 Guengerich 等，Crit Rev Toxicol26:551_583，1996)。因此，已 经提出了使用具有所需催化活性的工程化细菌P450酶作为用于产生人体中的代谢物的替 代途径的方法（参见 Yun CH 等，Trends Biotechnol25:289-298, 2007)。
[0007] 同时，源自巨大芽抱杆菌（Bacillus megaterium)的 P450BM3 (CYP102A1) 的血红素结构域具有单加氧酶活性，其与CYP4A(脂肪酸羟化酶）家族的哺乳动物 成员极其相似。天然地，其由单个的多肽构成，其中，具有哺乳动物样二黄素还原酶 功能的CYP102A1还原酶结构域融合至P450血红素结构域的C末端。两种酶活性 的融合使得融合性CYP102A1成为期望的哺乳动物模型，特别是人P450酶的期望模 型。据报道，通过逻辑性设计或定向进化而遗传改造得到的突变CYP102A1可氧化 人P450的若干种底物，从而产生具有更高活性的代谢物（参见Kim等，Drug Metab Dispos36:2166-2170, 2008 ;Kim 等，Drug Metab Dispos37:932-936, 2009 ;Kim 等，J Mol Catal B:Enzym63:179-187, 2010 ;0tey 等，Biotechnol Bioeng93:494_499, 2006 ;Yun CH 等，Trends Biotechnol25: 289-298, 2007)。
[0008] 基于上述描述，已提出可以开发突变的CYP102A1作为用于药物的检测和合成的 生物催化剂。最近已报道，数种选出的突变形式可以允许CYP102A1酶产生人体中的代谢 物作为药物（参见 Kim 等，Drug Metab Dispos36:2166_2170, 2008 ;Kim 等，Drug Metab Dispos37:932-936, 2009)，但是，尚未报道过以生物学手段从奥美拉唑产生人体中的代谢 物的方法。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于提供一种在通过氧化奥美拉唑而产生5' -羟基产物的选择性 转化反应中能够更稳定更有效地发挥催化功能的酶。
[0010] 另外，本发明的另一目的在于提供一种用于从奥美拉唑制备5'-羟基产物的组合 物，所述组合物含有所述酶。
[0011] 此外，本发明的另一目的在于提供一种从奥美拉唑制备5'-羟基产物的方法，所 述方法包括使所述酶与奥美拉唑反应。
[0012] 另外，本发明的另一目的在于提供一种用于从奥美拉唑制备5'-羟基产物的试剂 盒，所述试剂盒含有所述酶和产生NADPH的体系。
[0013] [技术方案]
[0014] 在一个总体方面，本发明提供选自由野生型CYP102A1和突变的CYP102A1组成的 组的至少一种酶。
[0015] 所述酶可以在通过氧化奥美拉唑而产生5'-羟基产物的选择性转化反应中更稳 定更有效地发挥催化功能。
[0016] 在另一总体方面，本发明提供一种使用野生型CYP102A1和突变的CYP102A1从奥 美拉唑选择性地大规模制备人体中的代谢物、特别是5'-羟基产物的方法，以及用于该方 法的组合物和试剂盒，其中，CYP102A1是细菌P450酶。
[0017] 本发明的野生型CYP102A1和突变的CYP102A1可以用作以奥美拉唑作为底物的氧 化反应中的催化剂，已知奥美拉唑是人P450的底物；特别而言，使用人CYP2C19作为催化剂 时产生的奥美拉唑代谢物包括两种代谢物；而使用本发明的细菌CYP102A1或其突变形式 作为催化剂时，可以选择性地产生5' -羟基产物。
[0018] 在本发明的优选示例性实施方式中，本发明人确认了当细菌野生型CYP102A1和 其定点突变形式在大肠杆菌中大规模表达（参见表1和2)且使奥美拉唑与产生NADPH的 体系反应时，通过HPLC(参见图3、4和5)和LC-MS谱（参见图6)确认奥美拉唑转化成了 人体中的代谢物。经确认，在使用人CYP2C19时，奥美拉唑被氧化产生两种主要代谢物，即 3' -羟基奥美拉唑和5' -羟基奥美拉唑；但在使用细菌野生型CYP102A1及其突变形式时， 选择性地产生了一种主要产物，即5' -羟基奥美拉唑。
[0019] 在产物的产生方面，野生型CYP102A1、17种突变形式和6种突变嵌合形式具有范 围很宽的分子催化活性（转换数）（参见图5)。经确认，对于在总分子催化活性方面显示出 高活性的突变#10,在以ImM浓度（A)的奥美拉唑反应2?4小时（B)的反应中显示出了最 高活性；同时，对于野生型CYP102A1酶，几乎不显示对于奥美拉唑的活性（参见图7)。
[0020] 基于上述检验结果，在另一总体方面，本发明提供一种用于从奥美拉唑制备 5' -羟基产物的组合物，所述组合物含有选自由野生型CYP102A1和突变的CYP102A1组成的 组的至少一种酶，
[0021] 其中，所述突变的CYP102A1具有由氨基酸序列SEQ ID N0:16表示的野生型 CYP102A1被修饰后的序列，所述修饰为选自由以下替换组成的组的至少一种：第48位氨基 酸精氨酸（R)被选自由丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和 色氨酸组成的组的氨基酸替换；第52位氨基酸酪氨酸（Y)被选自由丙氨酸、缬氨酸、异亮 氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸组成的组的氨基酸替换；第65位氨基酸谷氨酸 (E)被选自由甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺组成的组的 氨基酸替换；第75位氨基酸丙氨酸（A)被选自由甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨 酸、天冬酰胺和谷氨酰胺组成的组的氨基酸替换；第82位氨基酸苯丙氨酸（F)被选自由丙 氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸和色氨酸组成的组的氨基酸替换；第87 位氨基酸亮氨酸（L)被选自由丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色 氨酸组成的组的氨基酸替换；第88位氨基酸苯丙氨酸（F)被选自由丙氨酸、缬氨酸、亮氨 酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸和色氨酸组成的组的氨基酸替换；第144位氨基酸谷氨酸 (E)被选自由甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺组成的组的 氨基酸替换；第189位氨基酸亮氨酸（L)被选自由甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨 酸、天冬酰胺和谷氨酰胺组成的组的氨基酸替换；和第268位氨基酸谷氨酸（E)被选自由丙 氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸组成的组的氨基酸 替换。
[0022] 所述奥美拉唑可以是含有作为对映异构体的S-或R-奥美拉唑的外消旋体，或是 比例为50:50的S-和R-奥美拉唑的对映异构体，但是本发明不限于此。
[0023] 在另一总体方面，本发明提供一种从奥美拉唑制备5' -羟基产物的方法，所述方 法包括使奥美拉唑与选自由野生型CYP102A1和突变的CYP102A1组成的组的至少一种酶反 应。
[0024] 在所述制备5'-羟基产物的方法中，所述突变的CYP102A1可以优选具有由氨基酸 序列SEQ ID NO: 16表示的野生型CYP102A1被修饰后的序列，所述修饰选自由以下替换组 成的组的至少一种：第48位氨基酸精氨酸（R)被选自由丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、 脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸组成的组的氨基酸替换；第52位氨基酸酪氨酸（Y)被 选自由丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸组成的组的氨基酸 替换；第65位氨基酸谷氨酸（E)被选自由甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬 酰胺和谷氨酰胺组成的组的氨基酸替换；第75位氨基酸丙氨酸（A)被选自由甘氨酸、丝氨 酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺组成的组的氨基酸替换；第82位氨基 酸苯丙氨酸（F)被选自由丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸和色氨酸组 成的组的氨基酸替换；第87位氨基酸亮氨酸（L)被选自由丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、脯氨 酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸组成的组的氨基酸替换；第88位氨基酸苯丙氨酸（F)被 选自由丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸和色氨酸组成的组的氨基酸替 换；第144位氨基酸谷氨酸（E)被选自由甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰 胺和谷氨酰胺组成的组的氨基酸替换；第189位氨基酸亮氨酸（L)被选自由甘氨酸、丝氨 酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺组成的组的氨基酸替换；和第268位氨 基酸谷氨酸（E)被选自由丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸 和色氨酸组成的组的氨基酸替换。
[0025] 在本发明中，突变的CYP102A1可以通过本领域已知的任何已知突变方法来制造， 例如缺失突变法（参见Kowalski D.等，J. Biochem.，15, 4457)、PCT法、Kunkel法、定点突 变法、DNA改组、交错延伸法（StEP)和易错PCR等。
[0026] 在本发明的突变的CYP102A1中，由SEQIDN0:16表示的野生型CYP102A1蛋白的 氨基酸序列通过天然或人工的替换、缺失、添加和/或插入而被修饰。优选的是，按照以下 分类，所换上的氨基酸可以具有与待替换的氨基酸相似的性质。例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨 酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸都被分类成非极性氨基酸，并且彼此具 有相似的性质。不带电氨基酸的实例可以包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、 天冬酰胺和谷氨酰胺等，酸性氨基酸的实例可以包括天冬氨酸和谷氨酸，碱性氨基酸的实 例可以包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸。
[0027] 本发明的突变的CYP102A1包括含有与由SEQ ID勵:16表示的0￥?102八1蛋白序 列具有至少50%同一'丨生、优选至少75%同一'丨生、更优选至少90%同一'丨生的氨基酸序列的多 肽。
[0028] 野生型CYP102A1的期望突变形式可以包括对SEQ ID N0:16所表示的野生型 CYP102A1进行的选自由以下替换组成的组的至少一种替换：第48位氨基酸精氨酸（R)被 亮氨酸（L)替换；第52位氨基酸酪氨酸（Y)被苯丙氨酸（F)替换；第65位氨基酸谷氨酸 (E)被甘氨酸（G)替换；第75位氨基酸丙氨酸（A)被甘氨酸（G)替换；第82位氨基酸苯丙 氨酸（F)被异亮氨酸（I)替换；第87位氨基酸亮氨酸（L)被异亮氨酸（I)替换；第88位氨 基酸苯丙氨酸（F)被缬氨酸（V)替换；第144位氨基酸谷氨酸（E)被甘氨酸（G)替换；第 189位氨基酸亮氨酸（L)被谷氨酰胺（Q)替换；和第268位氨基酸谷氨酸（E)被缬氨酸（V) 替换。
[0029] 在最优选的突变CYP102A1中，由SEQ ID勵：16表示的野生型0￥?102八1氨基酸中 的替换位置和替换氨基酸可以选自由以下组成的组：F88A、R48L/Y52F、A75G/F88V/L189Q、 R48L/L87I/L189Q、R48L/F88V/L189Q、R48L/F88V/L189Q/E268V、R48L/L87I/L189Q/E268V、 R48L/L87I/F88V/L189Q、R48L/F88V/E144G/L189Q/E268V、R48L/E65G/F88V/E144G/L189Q/ E268V、 R48L/F82I/F88V/E144G/L189Q/E268V 和 R48L/E65G/F82I/F88V/E144G/L189Q/ E268V。
[0030] 本发明的蛋白质可以通过本领域公知的方法产生，例如使用基因工程技术的肽合 成法（Merrifield，J. Am. Chem. Soc.，85:2149-2154, 1963 文献）、固相技术或利用合适的肽 酶切割本发明的蛋白的方法。本发明的蛋白质可以作为天然蛋白产生，或者可以通过培养 经转化而具有编码CYP102A1或其突变形式的DNA的细胞、并回收所转化的细胞的重组方法 产生。本发明的蛋白质可以通过下述过程产生：将编码本发明的蛋白质的核酸分子插入合 适的表达载体中，培养通过将该载体递送至合适的细胞而产生的转化体，并对转化体所表 达的蛋白质进行纯化。
[0031] 载体可以具有例如质粒、粘粒、病毒颗粒或噬菌体形式。克隆或表达载体中的 DNA的宿主细胞的实例可以包括原核细胞、酵母和高级真核细胞。本领域技术人员可以对 诸如培养基、温度和pH等培养条件进行合适地选择而无需过多的实验。通常，可以参考 Mammalian Cell Biotechnology:a Practical Approach, M. Butler编·（IRL Press, 1991) 而利用使细胞培养的生产率最大化的技术。
[0032] 表达和克隆载体通常可以含有与编码CYP102A1或其突变形式的核酸序列可操作 地连接的诱导mRNA合成的启动子。被宿主细胞识别的各种启动子是已知的。适用于原核细 胞宿主的启动子的实例包括β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸启动子 系统和杂合启动子，例如tac启动子。此外，用于细菌系统的启动子可以含有与编码SISP-1 的DNA可操作地连接的Shine-Dalgarno(S. D.)序列。适用于酵母宿主的启动子序列的实 例可以包括3-磷酸甘油酸酯激酶或其他糖解酶。
[0033] 从奥美拉唑产生5' -羟基产物的方法可以进一步包括：添加产生NADPH的体系。
[0034] 在另一总体方面，本发明提供一种用于从奥美拉唑制备5' -羟基产物的试剂盒， 所述试剂盒包含：产生NADPH的体系，和选自由野生型CYP102A1和突变的CYP102A1组成的 组的至少一种酶。
[0035] 在突变的CYP102A1中，由SEQ ID N0:16表示的野生型CYP102A1氨基酸中的替 换位置和替换氨基酸可以优选是选自由以下组成的组的至少一种：F88A、R48L/Y52F、A75G/ F88V/L189Q、R48L/L87I/L189Q、R48L/F88V/L189Q、R48L/F88V/L189Q/E268V、R48L/L87I/ L189Q/E268V、R48L/L87I/F88V/L189Q、R48L/F88V/E144G/L189Q/E268V、R48L/E65G/F88V/ E144G/L189Q/E268V、R48L/F82I/F88V/E144G/L189Q/E268V 和 R48L/E65G/F82I/F88V/ E144G/L189Q/E268V，但是本发明不限于此。此外，所述试剂盒还可以含有进行所述反应所 需的试剂。
[0036] 产生NADPH的体系可以含有6-磷酸葡萄糖、NADP+和酵母6-磷酸葡萄糖脱氢酶， 但是本发明不限于此。
[0037] CYP102A1及其突变形式是在通过氧化奥美拉唑而产生5' -羟基产物的选择性转 化反应中能够稳定有效地发挥催化功能的细菌酶（奥美拉唑已知是人P450的底物），因此 可有效地用于以生物学手段从奥美拉唑产生人体中的代谢物。
[0038] [有益效果]
[0039] 本发明的细菌野生型CYP102A1及其突变形式可以在将奥美拉唑转化成5' -羟基 产物的转化反应中更稳定更有效地发挥催化功能，从而能够环保地、选择性地大规模制备 5' -羟基产物。本发明的产生5' -羟基产物的组合物、试剂盒和方法可以包括所述细菌野生 型CYP102A1及其突变形式，从而能够经济高效地从奥美拉唑大规模制备5' -羟基产物，因 此显著地有助于开发使用奥美拉唑代谢物的新型药物。
【专利附图】
【附图说明】
[0040] 以下将结合附图对优选实施方式进行描述，由此会使本发明的上述和其他目的、 特征和优点变得显而易见，附图中：
[0041] 图1显示本发明的野生型CYP102A1(SEQ ID N0:16)的氨基酸序列。
[0042] 图2显示本发明的野生型CYP102A1 (SEQ ID N0:17)的碱基序列。
[0043] 图3显示由本发明的野生型CYP102A1及其突变形式产生的奥美拉唑代谢物的 HPLC色谱（在302nm测得的UV吸光度）（峰：通过由人CYP2C19产生的代谢物的峰的保留 时间来确认；箭头：指示底物和作为主要产物的5' -羟基产物）。
[0044] 图4显示由本发明的野生型CYP102A1的突变形式（#10)产生的奥美拉唑代谢物 衍生物的HPLC色谱（A :外消旋体；B :R对映异构体；C :S对映异构体）。
[0045] 图5显示了本发明的野生型CYP102A1及其突变形式产生奥美拉唑氧化物的产生 速率。
[0046] 图6显示由人CYP2C19和本发明的突变CYP102A1(#10)产生的奥美拉唑和其代谢 物的 LC-MS 洗脱图（A :突变 CYP102A1#10 ;B :人 CYP2C19)。
[0047] 图7显示了本发明的突变CYP102A1 (#10)产生5' -羟基产物的总分子催化活性随 奥美拉唑的浓度（A)和处理时间（B)的变化。
[0048] 图8显示通过核磁共振（NMR)图谱观察到的由本发明的突变CYP102A1 (#10)产生 的奥美拉唑代谢物的结构。
【具体实施方式】
[0049] 以下将参照附图来详细描述本发明的实施方式。
[0050] 但是，该详细描述是为了帮助具体理解本发明，本发明的保护范围不限于以下实 施例。
[0051] 〈实施例1>通过定点诱变来构建突变的P450BM3
[0052] 按照 Kim 等（参见 Drug Metab Dispos 第 35 卷，第 2166-2170 页，2008)所述 的方法产生CYP102A1的17种定点突变形式。用于引入BamHI/SacI的识别位点的引物 和用于进行诱变的PCR引物示于以下表1中。对应于氨基酸替换的密码子以斜体加下划 线表示。PCR引物购自Genotech Company(Daejeon，Korea)。使用设计用来促进表达载 体 pCWori (获自 Dr. F. W. Dahlquist, University of California, Santa Barbara, CA)或 pSE420(Invitrogen)克隆的引物，通过PCR法从pCWBM3扩增编码突变的CYP102A1的基因。
[0053] 使用下表1所示的14种设计的引物组来实施寡核苷酸组装。将扩增的基 因克隆至PCWBM3BamHI/SacI载体的BamHI/SacI识别位点。使用经质粒转化的大肠 杆菌DH5 a F' -IQ(Invitrogen)来表达CYP102A1突变蛋白。诱变后，通过Genotech Company (Daejeon)的DNA测序来确认是否出现了所需的突变。
[0054] [表 1]
[0055] 用于突变的引物
[0056]
【权利要求】
1. 选自由氨基酸序列SEQ ID勵：16所表示的野生型0￥?10241和突变的0￥?102八1组 成的组的至少一种酶， 其中，所述突变的CYP102A1具有野生型CYP102A1被修饰后的序列，所述修饰为选自由 以下替换组成的组的至少一种：第48位氨基酸精氨酸（R)被选自由丙氨酸、缬氨酸、亮氨 酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸组成的组的一种氨基酸替换；第52位 氨基酸酪氨酸（Y)被选自由丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨 酸组成的组的一种氨基酸替换；第65位氨基酸谷氨酸（E)被选自由甘氨酸、丝氨酸、苏氨 酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺组成的组的一种氨基酸替换；第75位氨基酸丙 氨酸（A)被选自由甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺组成的 组的一种氨基酸替换；第82位氨基酸苯丙氨酸（F)被选自由丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮 氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸和色氨酸组成的组的一种氨基酸替换；第87位氨基酸亮氨酸（L)被 选自由丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸组成的组的一种氨 基酸替换；第88位氨基酸苯丙氨酸（F)被选自由丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨 酸、甲硫氨酸和色氨酸组成的组的一种氨基酸替换；第144位氨基酸谷氨酸（E)被选自由 甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺组成的组的一种氨基酸替 换；第189位氨基酸亮氨酸（L)被选自由甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰 胺和谷氨酰胺组成的组的一种氨基酸替换；和第268位氨基酸谷氨酸（E)被选自由丙氨酸、 缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸组成的组的一种氨基酸替 换。
2. 如权利要求1所述的酶，其中，所述突变的CYP102A1具有野生型CYP102A1被修饰后 的序列，所述修饰为选自由以下替换组成的组的至少一种：第48位氨基酸精氨酸（R)被亮 氨酸（L)替换；第52位氨基酸酪氨酸（Y)被苯丙氨酸（F)替换；第65位氨基酸谷氨酸（E) 被甘氨酸（G)替换；第75位氨基酸丙氨酸（A)被甘氨酸（G)替换；第82位氨基酸苯丙氨酸 (F)被异亮氨酸（I)替换；第87位氨基酸亮氨酸（L)被异亮氨酸（I)替换；第88位氨基酸 苯丙氨酸（F)被缬氨酸（V)替换；第144位氨基酸谷氨酸（E)被甘氨酸（G)替换；第189位 氨基酸亮氨酸（L)被谷氨酰胺（Q)替换；和第268位氨基酸谷氨酸（E)被缬氨酸（V)替换。
3. 如权利要求2所述的酶，其中，在所述突变的CYP102A1中，野生型CYP102A1氨基酸 中的替换位置和替换氨基酸是选自由以下组成的组的至少一种：F88A、R48L/Y52F、A75G/ F88V/L189Q、R48L/L87I/L189Q、R48L/F88V/L189Q、R48L/F88V/L189Q/E268V、R48L/L87I/ L189Q/E268V、48L/L87I/F88V/L189Q、R48L/F88V/E144G/L189Q/E268V、48L/E65G/F88V/ E144G/L189Q/E268V、R48L/F82I/F88V/E144G/L189Q/E268V 和 R48L/E65G/F82I/F88V/ E144G/L189Q/E268V。
4. 一种用于从奥美拉唑制备5' -羟基产物的组合物，所述组合物含有选自由氨基酸序 列SEQ ID NO: 16所表示的野生型CYP102A1和突变的CYP102A1组成的组的至少一种酶， 其中，所述突变的CYP102A1具有野生型CYP102A1被修饰后的序列，所述修饰为选自由 以下替换组成的组的至少一种：第48位氨基酸精氨酸（R)被选自由丙氨酸、缬氨酸、亮氨 酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸组成的组的一种氨基酸替换；第52位 氨基酸酪氨酸（Y)被选自由丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨 酸组成的组的一种氨基酸替换；第65位氨基酸谷氨酸（E)被选自由甘氨酸、丝氨酸、苏氨 酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺组成的组的一种氨基酸替换；第75位氨基酸丙 氨酸（A)被选自由甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺组成的 组的一种氨基酸替换；第82位氨基酸苯丙氨酸（F)被选自由丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮 氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸和色氨酸组成的组的一种氨基酸替换；第87位氨基酸亮氨酸（L)被 选自由丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸组成的组的一种氨 基酸替换；第88位氨基酸苯丙氨酸（F)被选自由丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨 酸、甲硫氨酸和色氨酸组成的组的一种氨基酸替换；第144位氨基酸谷氨酸（E)被选自由 甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺组成的组的一种氨基酸替 换；第189位氨基酸亮氨酸（L)被选自由甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰 胺和谷氨酰胺组成的组的一种氨基酸替换；和第268位氨基酸谷氨酸（E)被选自由丙氨酸、 缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸组成的组的一种氨基酸替 换。
5. 如权利要求4所述的组合物，其中，所述突变的CYP102A1具有野生型CYP102A1被修 饰后的序列，所述修饰为选自由以下替换组成的组的至少一种：第48位氨基酸精氨酸（R) 被亮氨酸（L)替换；第52位氨基酸酪氨酸（Y)被苯丙氨酸（F)替换；第65位氨基酸谷氨 酸（E)被甘氨酸（G)替换；第75位氨基酸丙氨酸（A)被甘氨酸（G)替换；第82位氨基酸 苯丙氨酸（F)被异亮氨酸（I)替换；第87位氨基酸亮氨酸（L)被异亮氨酸（I)替换；第88 位氨基酸苯丙氨酸（F)被缬氨酸（V)替换；第144位氨基酸谷氨酸（E)被甘氨酸（G)替换； 第189位氨基酸亮氨酸（L)被谷氨酰胺（Q)替换；和第268位氨基酸谷氨酸（E)被缬氨酸 (V)替换。
6. 如权利要求5所述的组合物，其中，在所述突变的CYP102A1中，野生型CYP102A1 氨基酸中的替换位置和替换氨基酸是选自由以下组成的组的至少一种：F88A、R48L/Y52F、 A75G/F88V/L189Q、R48L/L87I/L189Q、R48L/F88V/L189Q、R48L/F88V/L189Q/E268V、R48L/ L87I/L189Q/E268V、48L/L87I/F88V/L189Q、R48L/F88V/E144G/L189Q/E268V、48L/E65G/ F88V/E144G/L189Q/E268V、R48L/F82I/F88V/E144G/L189Q/E268V 和 R48L/E65G/F82I/ F88V/E144G/L189Q/E268V。
7. 如权利要求4所述的组合物，其中，所述奥美拉唑是含有作为对映异构体的S-奥美 拉唑或R-奥美拉唑的外消旋体，或是比例为50:50的S-奥美拉唑和R-奥美拉唑的对映异 构体。
8. -种从奥美拉唑制备5' -羟基产物的方法，所述方法包括使奥美拉唑与选自由氨基 酸序列SEQ ID NO: 16所表示的野生型CYP102A1和突变的CYP102A1组成的组的至少一种 酶反应， 其中，所述突变的CYP102A1具有野生型CYP102A1被修饰后的序列，所述修饰为选自由 以下替换组成的组的至少一种：第48位氨基酸精氨酸（R)被选自由丙氨酸、缬氨酸、亮氨 酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸组成的组的一种氨基酸替换；第52位 氨基酸酪氨酸（Y)被选自由丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨 酸组成的组的一种氨基酸替换；第65位氨基酸谷氨酸（E)被选自由甘氨酸、丝氨酸、苏氨 酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺组成的组的一种氨基酸替换；第75位氨基酸丙 氨酸（A)被选自由甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺组成的 组的一种氨基酸替换；第82位氨基酸苯丙氨酸（F)被选自由丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮 氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸和色氨酸组成的组的一种氨基酸替换；第87位氨基酸亮氨酸（L)被 选自由丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸组成的组的一种氨 基酸替换；第88位氨基酸苯丙氨酸（F)被选自由丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨 酸、甲硫氨酸和色氨酸组成的组的一种氨基酸替换；第144位氨基酸谷氨酸（E)被选自由 甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺组成的组的一种氨基酸替 换；第189位氨基酸亮氨酸（L)被选自由甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰 胺和谷氨酰胺组成的组的一种氨基酸替换；和第268位氨基酸谷氨酸（E)被选自由丙氨酸、 缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸组成的组的一种氨基酸替 换。
9. 如权利要求8所述的方法，其中，所述突变的CYP102A1具有野生型CYP102A1被修 饰后的序列，所述修饰为选自由以下替换组成的组的至少一种：第48位氨基酸精氨酸（R) 被亮氨酸（L)替换；第52位氨基酸酪氨酸（Y)被苯丙氨酸（F)替换；第65位氨基酸谷氨 酸（E)被甘氨酸（G)替换；第75位氨基酸丙氨酸（A)被甘氨酸（G)替换；第82位氨基酸 苯丙氨酸（F)被异亮氨酸（I)替换；第87位氨基酸亮氨酸（L)被异亮氨酸（I)替换；第88 位氨基酸苯丙氨酸（F)被缬氨酸（V)替换；第144位氨基酸谷氨酸（E)被甘氨酸（G)替换； 第189位氨基酸亮氨酸（L)被谷氨酰胺（Q)替换；和第268位氨基酸谷氨酸（E)被缬氨酸 (V)替换。
10. 如权利要求9所述的方法，其中，在所述突变的CYP102A1中，野生型CYP102A1氨基 酸中的替换位置和替换氨基酸是选自由以下组成的组的至少一种：F88A、R48L/Y52F、A75G/ F88V/L189Q、R48L/L87I/L189Q、R48L/F88V/L189Q、R48L/F88V/L189Q/E268V、R48L/L87I/ L189Q/E268V、R48L/L87I/F88V/L189Q、R48L/F88V/E144G/L189Q/E268V、R48L/E65G/F88V/ E144G/L189Q/E268V、R48L/F82I/F88V/E144G/L189Q/E268V 和 R48L/E65G/F82I/F88V/ E144G/L189Q/E268V。
11. 如权利要求8所述的方法，所述方法还包括：添加产生NADPH的体系。
12. -种用于从奥美拉唑制备5' -羟基产物的试剂盒，所述试剂盒包含：产生NADPH的 体系，和选自由氨基酸序列SEQ ID勵:16所表示的野生型0￥?10241和突变的0￥?102八1组 成的组的至少一种酶， 其中，在所述突变的CYP102A1中，野生型CYP102A1氨基酸中的替换位置和替换氨基 酸是选自由以下组成的组的至少一种：F88A、R48L/Y52F、A75G/F88V/L189Q、R48L/L87I/ L189Q、R48L/F88V/L189Q、R48L/F88V/L189Q/E268V、R48L/L87I/L189Q/E268V、R48L/L87I/ F88V/L189Q、R48L/F88V/E144G/L189Q/E268V、R48L/E65G/F88V/E144G/L189Q/E268V、R48L/ F82I/F88V/E144G/L189Q/E268V 和 R48L/E65G/F82I/F88V/E144G/L189Q/E268V。
13. 如权利要求12所述的试剂盒，其中，所述产生NADPH的体系含有6-磷酸葡萄糖、 NADP+和酵母6-磷酸葡萄糖脱氢酶。
【文档编号】C12N9/00GK104105794SQ201280068693
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2012年12月21日 优先权日:2012年1月31日
【发明者】尹喆湖, 柳相勋, 姜馨植 申请人:尹喆湖