一株高产次生代谢产物的尾孢属内生真菌新种及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物领域中一株高产次生代谢产物的尾孢属内生真菌新种及其应 用，所述次生代谢产物可为多糖、黄酮、三萜和总酚中的四种、三种、两种或一种。
【背景技术】
[0002] 植物的代谢产物可分为两类，即初生代谢产物和次生代谢产物。初生代谢产物是 指维持植物体正常生命活动所必需的物质和能量代谢，如脂类、氨基酸、核酸以及它们的多 聚体等，这些物质的分子量一般很大，又称为大分子化合物。次生代谢产物是由次生代谢产 生的一类细胞生命活动或植物生长发育正常运行的非必需的小分子有机化合物（习惯上 称为天然产物），其产生和分布通常有种属、器官、组织以及生长发育时期的特异性，次生代 谢产物可分为苯丙素类、醌类、黄酮类、单宁类、类萜、留体及其甙、生物碱七大类。在植物的 某个发育时期或某个器官中，次生代谢产物可能成为代谢库的主要成分，比如橡胶树产生 大量橡胶和甜菊叶中甜菊甙的含量可达干重的10%以上。
[0003] 植物中直接或间接的提取是目前人们获得天然产物的主要手段，但随着人口的增 多市场需求量的增加，直接从植物中提取次生代谢产物已经难以满足需求，所以发展新的 高效生产这些重要的次生代谢产物方法迫在眉睫。内生真菌是在宿主体内生存并完成生活 周期的真菌，长期寄生在某种植物上的内生真菌通常能与该宿主植物协同演化，宿主植物 与其内生真菌之间可能存在基因重组的现象，从而使得宿主植物上的内生真菌能产生与宿 主植物相同的代谢产物。近年来发现的天然产物中有51 %来自植物内生真菌，38%来自土 壤微生物，11 %来自植物和动物，显然内生真菌己成为天然产物的重要资源。
[0004] 野生碗豆生存环境原始、复杂，种群多样性高，其内生真菌的丰富度及多样性较其 它物种更为优越。通过对野生碗豆内生真菌的分离可得到一些较为原始及次生代谢产物多 样的内生真菌。尾孢属（Cercospora)真菌可导致草坪叶斑病，常见的有4种类型：引起翦股 颖叶斑病的翦股颖尾孢菌（C. agrostidis)、引起羊茅叶斑病的羊茅尾孢菌（C. festucae)、 引起野牛草和狗牙根叶斑病的C. seminalis和引起钝叶草叶斑病的C. fusimaculans.。也 有关于尾孢菌作为水萌芦生防菌的应用，但关于尾孢属内生真菌次生代谢产物分析报道甚 少。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是如何利用微生物生产次生代谢产物，所述次生代谢 产物为多糖、黄酮、总三萜和总酚中的四种、三种、两种或一种。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明提供了一株可以产生次生代谢产物的内生真菌，所 述次生代谢产物为多糖、黄酮、总三萜和总酚中的四种、三种、两种或一种。
[0007] 本发明提供的内生真菌是尾孢属（Cercospora sp. nov. )WDL2,该菌株已于2014 年10月27日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，地址为：中国武汉武汉大学）， 保藏编号为 CCTCC NO :M 2014518。
[0008] 本发明的另一个目的是提供一种菌剂，该菌剂的活性成分为所述的尾孢属 WDL2 (Cercospora sp. nov. WDL2)CCTCC NO ：M 2014518〇
[0009] 上述菌剂可为产生次生代谢产物多糖、黄酮、总三萜和总酚中的四种、三种、两种 或一种的菌剂。
[0010] 所述菌剂还可以包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。所述固体载体可 为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白 碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料可为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一 种；所述高分子化合物可为聚乙烯醇和/或聚二醇。所述液体载体可为有机溶剂、植物油、 矿物油或水；所述有机溶剂可为癸烷和/或十二烷。所述菌剂中，所述活性成分可以以被培 养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。所述 组合物的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒 剂。
[0011] 根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂（如吐温20、吐温80等）、粘合剂、稳 定剂（如抗氧化剂）、pH调节剂等。
[0012] 所述尾孢属 WDL2 (Cercospora sp. nov. WDL2)CCTCC NO :M 2014518 在生产次生代 谢产物多糖、黄酮、总三萜和总酚中的四种、三种、两种或一种的应用也属于本发明的保护 范围。
[0013] 所述以尾孢属 WDL2 (Cercospora sp. nov. WDL2)CCTCC NO :M 2014518 为活性成分 的菌剂在生产次生代谢产物多糖、黄酮、总三萜和总酚中的四种、三种、两种或一种的应用 也属于本发明的保护范围。
[0014] 本发明的再一个目的是提供一种培养尾孢属WDL2 (Cercospora sp. nov. WDL2) CCTCC NO :M 2014518 的方法。
[0015] 本发明所提供的培养尾孢属 WDL2 (Cercospora sp. nov. WDL2) CCTCC NO :M 2014518 的方法，包括将尾孢属 WDL2 (Cercospora sp. nov. WDL2) CCTCC NO :M 2014518 在用 于培养尾孢菌的培养基中培养的步骤。
[0016] 本发明的又一个目的是提供一种以尾孢属WDL2 (Cercospora sp. nov. WDL2) CCTCC NO :M 2014518为活性成分的菌剂的制备方法。
[0017] 本发明所提供上述菌剂的制备方法，包括如下步骤：将所述的尾孢属 WDL2 (Cercospora sp. nov. WDL2) CCTCC NO :M 2014518 作为活性成分，得到所述菌剂。
[0018] 对中国黑龙江省阿城区林场采集野生豌豆叶片内生真菌的分离，可能得到一些较 为原始以及次生代谢产物功能多样的内生真菌。本发明分离筛选得到产生次生代谢产物的 尾孢属 WDL2 (Cercospora sp. nov. WDL2) CCTCC NO :M 2014518。
[0019] 实验证明，尾孢属 WDL2 (Cercospora sp. nov. WDL2) CCTCC NO :M 2014518 菌丝体 (干重）生长速率为〇.22g/d，其菌丝体（干重）中多糖、黄酮、总三萜和总酚的含量分别为 74. 452mg/g、l. 250mg/g、4. 395mg/g和3. 343mg/g，在最适摇瓶发酵条件下发酵培养10天其 发酵液中黄酮、总三萜和总酚的含量分别为〇. 668mg/L、0. 633mg/L和2. 124mg/L。这表明该 菌株能产生多糖、黄酮、总三萜和总酚，在生产次生代谢产物方面具有重要应用。
[0020] 保藏说明
[0021] 菌种名称：尾孢属
[0022] 拉丁名：Cercospora sp. nov.
[0023] 菌株编号：WDL2
[0024] 保藏机构：中国典型培养物保藏中心
[0025] 保藏机构简称：CCTCC
[0026] 地址：中国武汉武汉大学
[0027] 保藏日期：2014年10月27日
[0028] 保藏中心登记入册编号：CCTCC NO :M 2014518
【附图说明】
[0029] 图1为生长4天的尾孢属（Cercospora sp. nov. ) WDL2在10倍光学显微镜下的菌 丝形态。
[0030] 图2为生长7天的尾孢属（Cercospora sp. nov. )WDL2在40倍光学显微镜下的菌 丝形态。
[0031] 图3为生长15天的尾孢属（Cercospora sp. nov. )WDL2的菌落形态。
【具体实施方式】
[0032] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0033] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0034] 实施例 1、尾孢属 WDL2 (Cercospora sp. nov. WDL2)CCTCC NO :M 2014518 的分离、 鉴定与保藏
[0035] 1、内生真菌WDL2的分离
[0036] 将野生豌豆叶片（采自中国黑龙江省阿城区亚沟林场）进行消毒。将氯霉素加入 2%麦芽粉琼脂培养基使其含量为50mg/L，得到麦芽粉氯霉素平板；用PDA固体培养基制成 PDA固体平板。将上述消毒后的野生豌豆叶片切成0.5cm 2的小块放在麦芽粉氯霉素平板上， 25°C黑暗培养5天。将从野生豌豆叶片组织切口边缘处长出的内生真菌菌丝逐个用接种环 接至PDA固体平板上进行菌种纯化。将筛选到的其中一株内生真菌命名为内生真菌WDL2。
[0037] 2、内生真菌WDL2的鉴定
[0038] 从以下几个方面鉴定步骤一分离并纯化得到的内生真菌WDL2 :
[0039]2. 1、形态学鉴定
[0040] 将处于对数生长期且菌落大小稳定，上述步骤一分离并纯化得到的内生真菌WDL2 进行单菌落状态观察，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、菌落表面状态（是否平坦、突 起、褶皱、凹陷等）、菌落边缘特征（是否整齐、不规则、放射状等），产孢时间等。菌落外观 形态特征采集使用佳能60D相机（18-200mm IS，日本），技术参数为：APS-C规格数码单反； 1800万有效像素；10倍光学变焦。
[0041] 对处于对数生长期的所述内生真菌WDL2，经涂片染色后采用光学显微镜观察菌丝 的形态，包括菌丝的表面状态、菌丝的显微结构（如子座、分生孢子梗、分生孢子等）。菌落 显微观察使用正立生物显微镜Axioskop2plusFL(蔡司，德国），技术参数：消色差一消球差 多功能聚光镜；照明系统为100W卤素灯，柯勒照明；五档荧光分光器；HB050, HB0103光源。 采用Axioplan 2imaging MOT软件进行图像采集与分析。
[0042] 结果表明（图1、图2和图3)，上述步骤一分离并纯化得到的内生真菌WDL2具有 如下形态特征：菌落凸起，正面白色，背面黑褐色，表面光滑，边缘有褶皱，培养基变成黄色， 菌落厚2-3mm，用PDA固体培养基培养时生长较为缓慢，培养16天菌落直径为4厘米。显 微结构观察显示，具较大子座，子座近球形，直径80 y m~160 y m。分生孢子梗单生或多根 密集簇生在子座上