一种红曲菌代谢产物的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域。涉及天然活性产物的制备。
【背景技术】
[0002]红曲是我国的传统发酵产品，在我国一直被认为具有药用和食用双重功效，不仅是祖国宝贵的科学文化遗产，而且在世界微生物史上具有重要意义。20世纪30年代，自红曲流传到了欧美以后，世界各国都开始研宄红曲菌的分类与鉴定、红曲色素的提取工艺优化及其在生产中的应用，并对红曲发菌酵组分的分离纯化、结构表征及代谢机理等方面进行了一些研宄，但进展较慢。最近几十年，随着微生物学的发展、分析方法的进步和分析仪器的更加精确，国内外的学者对红曲菌的发酵进行了大量广泛而深入的研宄，在红曲色素分离、结构鉴定、菌种改良、液态发酵工艺优化、代谢产物基因调控、功能性及安全性等理论和应用方面的研宄都卓有成效，不断拓展着红曲色素的应用领域。近年来，随着对红曲中生物活性物质研宄不断发展，各国学者对其进行深入而广泛研宄，发现红曲能产生许多令人瞩目次级代谢产物，如红曲色素、胆固醇抑制剂、及具有降血压、抗菌、降血氨、抗肿瘤、降血糖等生理活性成分，使传统红曲增添新的内涵。一种天然物质能同时具有多项生物活性实属罕见，因此开发红曲新功能现已成为各国研宄热点之一。
[0003]红曲菌两种代谢产物Monascopyridine A(MCA)和 Monascopyridine B(MCB)是由德国科学家 Wild 等(Wild D, et al.New Monascus metabolites with a pyridinestructure in red fermented rice.J Agric Food Chem, 2003, 51, 5493 - 5496)首次在红曲米或以红曲米粉为发酵培养基进行液态发酵得到的，并对其结构进行了表征，然而，对MCA和MCB的分离方法和生物活性未做具体研宄。目前，我们发现橙色红曲菌AS3.4384在敲除 pksCT 基因后得到的 PHDS26 菌株(Fu G, Xu Y, et al.Construct1n of a replacementvector to disrupt pksCT gene for the mycotoxin citrinin b1synthesis inMonascus aurantiacus and maintain food red pigment product1n.Asia Pac J ClinNutr, 2007, 16 (SI)，137-142 ;付桂明；橙色红曲菌pksCT gene的敲除和长同源臂置换型打靶载体的构建[D];南昌大学；2007年)，MCA和MCB的产量大大提高，且原始菌株AS3.4384几乎不产MCA和MCB。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供红曲菌代谢产物MCA和MCB的制备方法。本发明提供橙色红曲菌AS3.4384几乎不产MCA和MCB，然而在敲除pksCT基因后，MCA和MCB的产量大大提高，分别达到2.07和1.96g/kgo
[0005]本发明所述的红曲菌代谢产物MCA和MCB的制备方法，包括如下步骤:
[0006](I)红曲菌孢子悬液的制备。
[0007]将橙色红曲菌株AS3.4384和其pksCT基因缺失株PHDS26分别接种到MPPY液体培养基中(4%葡萄糖，0.2%酵母浸膏，0.3% NaNO3,0.05% KC1，pH 6.8)，恒温摇床培养2?4d，120?250r/min，28?35°C ;用移液枪吸取ImL培养液接种在MES固体培养基上28?30°C培养10?12d ;长出大量孢子后，用孢子洗液洗脱孢子；500目的双层尼龙布过滤后得到均一的孢子悬液。
[0008](2)菌丝和发酵液的收集。
[0009]对菌株AS3.4384和PHDS26的孢子悬液进行适当的稀释后分别接种到50mL YES液体培养基(I?10%酵母浸膏，2?30%蔗糖)，摇匀，培养基中的孢子终浓度为(I?10) X 13个/mL，30°C静置培养16?26d。发酵结束后，取出三角瓶，用滤纸将菌体和发酵液过滤，收集发酵液，将湿菌体在60°C下烘干后研碎，收集干燥的菌体，研磨成粉后备用。
[0010](3) MCA和MCB的提取与初分离。
[0011]菌丝体粉末用超声波辅助提取，提取条件:60?100%甲醇、30?60°C、10?30min、固液比1:25 (w/v, kg/L)，两者提取液皆8000r/min离心20min，收集提取液，提取液在60°C下旋转蒸发，浓缩至干，残渣用乙酸乙酯复溶得到初提液，作硅胶柱分离用。采用硅胶柱层析法对样品进行初步分离，称取一定量的200-300目的硅胶，加入正己烷:乙酸乙酯(7:3，v/v，L/L)用玻璃棒充分搅拌，装柱；沉降完成后，将一定量的初提液上样，用正己烷:乙酸乙酯(7:3，v/v, L/L)洗涤，收集洗脱液，60°C浓缩至干，加入乙醇复溶，用本发明的技术效果中的HPLC方法检测，以确定含有目标产物的溶液，待收集到一定量后，旋转浓缩至干，用无水乙醇复溶，0.22 μ m微孔滤膜过滤，备用。
[0012](4) MCA 和 MCB 的纯化。
[0013]采用半制备高效液相色谱法对MCA和MCB进行纯化，半制备型HPLC条件为:色谱柱:Zorbax SB-C18 (9.4X 150mm, 5 μ m);流动相:乙腈 / 水(75:25, v/v,mL/mL);检测波长:300nm ;温度:室温(25°C );样量:200 μ I。分别收集两种目标产物洗脱液，并将两者的洗脱溶液于60°C下旋转蒸发浓缩至干，得到纯度大于95%的MCA和MCB。
[0014]本发明MCA和MCB的生物活性测定。
[0015]采用MTT法检测了 MCA和MCB对H印G2细胞增殖抑制的影响，结果显示，MCA和MCB能明显抑制H印G2细胞的增殖，MCA和MCB对H印G2细胞抑制的IC5tl值分别为40.0和20.0 μ g/mL0
[0016]发酵液用同体积的甲醇萃取，菌丝用超声波辅助提提取，提取条件:60?100%甲醇、30?60。。、10?30min、固液比1:25，两者提取液皆8000r/min离心20min，0.22 μπι微孔滤膜过滤后用HPLC检测两种代谢产物。
[0017]HPLC测定条件经过优化如下:
[0018]色谱柱:Hypersil0DS-2 (5 μ m，250 X 4.6mm，Thermo 公司)；流动相:乙腈-水(60:40，v/v);检测波长:300nm ;柱温:25°C ;流速:0.8mL/min ;进样量:20yLo
[0019]本发明的技术效果:目前文献报道(Wild D, et al.New Monascusmetabolites with a pyridine structure in red fermented rice.J Agric FoodChem, 2003, 51，5493 - 5496.)中采用大米或大米粉发酵得到该红曲菌代谢产物，通过本发明的方法采用红曲菌PHDS26液态发酵获得的菌丝体，使得MCA和MCB的产量分别达到2.07和1.96g/kg。本发明采用超声波辅助提取，优化后的提取条件:90%甲醇、40°C、20min、固液比1:25 (w/v, kg/L)，比上述文献报道的提取方法(采用乙腈作为提取剂)提取率提高了约50%。另外，本发明采用的HPLC分析方法不需要进行梯度洗脱，样品提取过程中不需要添加0.25M的磷酸，操作较上述文献简便，且MCA和MCB的保留时间较文献中保留时间短。
【具体实施方式】
[0020]本发明将通过以下实施例作进一步说明。
[0021]实施例1。橙色红曲菌AS3.4384及其pksCT基因缺失株PHDS26MCA和MCB产量的比较。
[0022]1.1按照上述红曲菌代谢产物MCA和MCB的制备方法分别制备橙色红曲菌AS3.4384及其pksCT基因缺失株PHDS26的菌丝体，然后采用HPLC方法对不同菌丝样品中MCA和MCB含量进行测定。
[0023]1.2色谱条件。
[0024]采用色谱柱Hypersil ODS-2 (5 μ m，250 X 4.6mm)为检测用色谱柱，乙腈-水(60:40，v/v)为流动相，柱温为25°C，流速为0.8mL/min，检测波长为300nm。
[0025]1.3结果分析。
[0026]对于橙色红曲菌AS3.4384，菌丝和发酵液中均未检测出MCA和MCB ;在基因缺失株PHDS26的发酵液中也未检测到MCA和MCB，但在其菌丝中却检出较多的MCA和MCB，结果显示，在发酵到16天时，基因缺失株PHDS26的菌丝粉中MCA和MCB的产量达到最大值，分别为 2.07g/kg 和 1.96g/kg，
[0027]实施例2。MCA和MCB超声波辅助提取条件的优化。
[0028]1.1对影响超声波提取效果的溶剂浓度、超声波频率、提取时间