羊口疮病毒毒力基因vir 缺失突变株及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程用于兽医生物技术领域，具体涉及一种羊口疮病毒弱毒疫苗 及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 羊口疮亦称羊传染性脓疱（Contagious Ecthyma，CE)、接触传染性脓疱皮炎 (Contagious pustular dermatitis，CPD)、羊传染性胺疮（Ecthyma Contagiosum)等，是由 羊口疮病毒（〇rf virus，0RFV)所引起的一种绵羊和山羊的接触性传染病，在临床上以口 唇、舌、鼻、乳房等皮肤和黏膜形成红斑、丘瘆、结节、水疱、脓疱、溃疡和疣状厚痂为特征。该 病通过直接接触传染，以3~6月龄的羔羊最易感，常呈群发性流行；鹿、骆驼、麝牛、人也可 感染。该病在在养羊集中的国家和地区广泛流行，给养羊业造成了较严重的经济损失。
[0003] 疫苗接种是防控该病的主要手段，常规的ORF灭活苗和弱毒苗在预防该病的发生 和流行过程中起到一定作用，它能在一定程度上降低疾病的感染率，但现有的常规疫苗也 存在一定的缺陷。ORF灭活苗是用物理的或化学的方法将ORFV灭活，使其丧失感染性和繁 殖能力，这种疫苗虽然安全性高、稳定性强，但由于在灭活过程中病毒的抗原性发生的一定 的改变，免疫期较短，免疫效果不够理想，且主要诱导机体的体液免疫应答，不能诱导特异 性的细胞免疫。
[0004] 弱毒疫苗是将ORFV强毒株通过细胞连续传代进行人工驯化获得减毒毒株， 其优点是免疫原性强，可诱导机体产生坚强的体液和细胞免疫，免疫力较为持久。如 CN201110452835. 7公开了一种山羊口疮病毒毒力弱化方法，利用犊牛睾丸细胞系，通过羊 口疮病毒的连续传代培养，致使羊口疮病毒毒力致弱，为羊口疮病毒弱毒疫苗制备生产提 供了稳定可靠的方法，用以获得大量的稳定的疫苗。但其缺点是研发周期长，驯化难度高， 很难在短时间得到免疫原性理想的减毒毒株。近年来，随着ORFV病毒变异株的出现，现有 ORF疫苗使其不能提供完全保护，从而导致羊传染性脓疱病的频繁暴发。因此有必要借助具 有突出优势的技术手段研宄快速降低ORFV毒力的方法，为ORF疫苗的研发提供技术支撑。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是针对现有人工驯化羊口疮病毒弱毒株周期长、免疫原性易发生 改变等缺点，采用基因工程方法通过对羊口疮病毒毒力基因 VIRQnterferon resistance gene，干扰素抗性因子）进行缺失以实现其毒力快速降低，提供一种制备毒力显著降低但 仍保持良好的免疫原性的弱毒疫苗制备方法。
[0006] 本发明的目的是通过如下技术方案来实施的：
[0007] -种羊口疮病毒毒力基因 VIR缺失突变株的制备方法，具体步骤如下：
[0008] A、采用PCR方法克隆包含0RFV-SHZ1株VIR毒力基因及侧翼序列的基因片段，用 酶切方法缺失掉VIR毒力基因，在缺失位点插入带有痘苗病毒晚期启动子Pll和LacZ报告 基因的表达盒，构建以LacZ基因为筛选标记的重组穿梭载体；
[0009] B、将重组穿梭载体转染到ORFV感染的Vero细胞中进行同源重组，经蚀斑筛选纯 化获得VIR毒力基因缺失的重组病毒ORFV- Δ VIR-LacZ。
[0010] 所述0RFV-SHZ1株VIR毒力基因的序列如SED ID NO. 1所示。
[0011] 步骤A所述的包含0RFV-SHZ1株VIR毒力基因及侧翼序列的基因片段，制取时优 选方法用病毒提取试剂盒提取0RFV-SHZ1株基因组DNA，用P1-P2引物扩增出含VIR毒力基 因及上下臂的序列，回收PCR扩增产物，将其与pMD18-T-simple载体连接，获得pVIR重组 质粒，其中：
[0012] Pl 的序列为：5' -ATCGTGAACACCAAGACCT-3'，
[0013] P2 的序列为：5' -TTGTGCACGCTGCGCGC-3'。
[0014] 所述引物Pl序列如SED ID NO. 2所示、引物P2序列如SED ID NO. 2所示。
[0015] 所述VIR基因上下同源臂的基因序列如SED ID NO. 4所示。
[0016] 所述步骤A中酶切方法缺失掉VIR毒力基因的优选操作为：用Sph I和 BglII (629-827bp)双酶切pVIR重组质粒，对VIR基因进行缺失突变。
[0017] 所述步骤A中带有痘苗病毒晚期启动子Pll和LacZ报告基因的表达盒采用限制 性内切酶XbaI从pSC-ΙΙ穿梭载体上切下含有痘苗病毒晚期启动子Pll和报告基因 IacZ 的基因片段。
[0018] 步骤B中的蚀斑筛选纯化采用DMEM原液对同源重组毒稀释，接种Vero细胞，逐 日观察转染细胞，待出现细胞病变（CPE)和蓝斑后，优选待发现明显的细胞病变和蓝斑后， 无菌挖取蓝斑，反复冻融，重新接种Vero细胞，待出现细胞病变（CPE)和蓝斑后，连续接种 Vero细胞，得到纯化的重组病毒ORFV- Δ VIR-LacZ。
[0019] 反复冻融一般进行2~6次为宜。
[0020] 一种羊口疮病毒毒力基因 VIR缺失突变株，其TCID5tl为IX 10 _3 5/mL。
[0021] 本发明采用基因工程方法通过对羊传染性脓疱病毒VIR毒力基因进行缺失以实 现其毒力快速降低，为制备毒力显著降低但仍保持良好的免疫原性的弱毒疫苗提供一种快 速可靠的制备方法。而且生产周期短、不需要驯化即可得到免疫原性理想的减毒毒株。即 使ORFV病毒变异，也可以迅速弱化毒力，治愈羊传染性脓疱病。
【附图说明】
[0022] 图1为重组ORFV- Δ VIR-LacZ产生的蓝蚀斑无菌挖出纯化结果图；
[0023] 图2为重组病毒毒在Vero细胞上产生的CPE及蓝蚀斑；
[0024] 图 3 为 ORFV-Δ VIR-LacZ 和 0RFV-SHZ1 株的生长曲线。
【具体实施方式】
[0025] 本发明提供一种制备羊口疮病毒VIR毒力基因缺失株的构建方法，用于制备毒力 显著降低但仍保持良好免疫原性的弱毒疫苗候选株，包括以下几个方面内容：
[0026] UORFV的细胞培养
[0027] 用Vero细胞培养ORFV SHZl流行株，生长液用含8%犊牛血清的DMEM液，维持液 用含2%犊牛血清的DMEM液。在细胞生长成单层时接毒，待80%细胞出现典型的CPE时收 毒。反复冻融三次，5000rpm离心10min，取上清作为提取总DNA的材料。
[0028] 2、ORFV基因组DNA的提取
[0029] 分别取200 μ L ORFV SHZl株病毒液，加入I. 5mL离心管中；然后向离心管中加入 200 μ L的Solution A，剧烈震荡混匀后，室温放置5min ;再加入75 μ L的Solution B，混合 均勾后，12000rpm离心5min ;将上清液转移到新的Collection Tube (2mL，试剂盒中提供） 中，加250 yL异丙醇（1 %冰乙酸），上下颠倒混匀；将试剂盒中的Spin Column安置于另 一新的Collection Tube(2mL，试剂盒中提供）上，将上述上清液转移至Spin Column中， 12000rpm离心lmin，弃滤液；将500 μ L的Rinse A加入至Spin Column中，室温静置lmin， 12000rpm 离心 lmin，弃滤液；将 800 μ L 的 Rinse B 加入至 Spin Column 中，12000rpm 离心 lmin，弃滤液；再次进行12000rpm离心Imin ;将Spin Column安置于新的I. 5mL的离心管 上，在Spin Column膜中央处加入50 μ L的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置Imin; 12000rpm离心Imin洗脱病毒DNA，收集到的DNA用于下一步操作或-20°C保存。
[0030] 3、VIR毒力基因和上下臂的PCR扩增与克隆
[0031] 根据GenBank中公布的0RFVSA00株基因组序列（AY386264)，引物 Pl (5' -ATCGTGAACACCAAGACCT-3'）和引物 P2 (5' -TTGTGCACGCTGCGCGC-3'），用扩增出含 VIR毒力基因及上下臂的PCR扩增产物，由北京华大基因公司合成。将合成的引物进行低温 瞬时离心，加入灭菌双蒸水配成100pmol/uL 〇
[0032] 用病毒提取试剂盒提取0RFV-SHZ1株基因组DNA，以此为模板进行PCR扩 增反应。PCR反应条件如下：反应体系为：10Xbuffer(含MgC12)2.0yL，2.5mmol/L (1阶1 30.6 41^，20_〇1/1上下游引物各0.5 41^，0嫩模板141^，了390嫩(2.5"1^)聚合酶 0. 5yL，用灭菌蒸馏水补足体积至20yL。反应条件为：95°C预变性5min，94°C变性50s， 61°C/62°C /60°C /59°C /54°C 退火 40s，72°C 延伸 120s，共 35 个循环，最后 72°C 延伸 10min。 获得片段大小为1550bp的扩增产物，与预期的DNA片段长度相符。回收PCR扩增产物，将 其克隆入pMD18-T-simple载体得到pVIR重组质粒。将pVIR测序，证实已经成功克隆得到 VIR毒力基因和上下臂片段。
[0033] 4、穿梭载体p Δ VIR-LacZ的构建和鉴定
[0034] 4. IplI-LacZ基因片段的获得
[0035] 用限制性内切酶XbaI从pSCll穿梭载体上切下含有痘苗病毒晚期启动子Pll和 报告基因 IacZ的基因片段，进行凝胶电泳回收目的片段（3845bp)，并对两端黏性末端进行 补平。
[0036] 4. 2穿梭载体p Δ VIR-LacZ的构建
[0037] 用Sph I和BglII (629-827bp)双酶切pVIR重组质粒，对VIR基因进行缺失突变， 回收大片段，并进行两端黏性末端补平。将含有Pll启动子和LacZ的基因片段与pVIR大 片段连接，获得重组穿梭载体P Δ VIR-LacZ。通过PCR和测序p Δ VIR-LacZ进行验证。
[0038] 4. 3穿梭载体p Δ VIR-LacZ的分子鉴定
[0039] 构建好的穿梭载体p Λ VIR-LacZ单酶切可得到7835bp的片段，与预期大小完成相 符。用LacZ引物可以扩增出2400bp的产物，表明穿梭载体p AVIR-LacZ构建正确。
[0040] 5、穿梭载体p AVIR-LacZ转染
[0041] 5. IVero单层细胞培养
[0042] Vero细胞传到六孔板中，每孔2mL，待细胞70% -80 %铺于板底时备用。
[0043] 5. 2Vero细胞接种痘苗病毒
[0044] 按ORFV病毒液：细胞培养液=1:10体积比将ORFV接种6孔板Vero细胞，每孔 200 μ L。37°C吸附2h，然后吸弃病毒液，加入含2%犊牛血清DMEM培养液，37°C，5% 0)2培 养箱培养4-6h。再用Invitrogen公司的脂质体转染Vero细胞。
[0045] 5. 3脂质体介导重组质粒转染Vero细胞
[0046] 制备A液和B液。A液是DMEM原液加4 μ L脂质体，B液是DMEM原液加1. 6 μ g重 组质粒。A液、B液各制备130 μ L，室温放置5min钟后，将A液逐滴加入B液，轻轻混合均 匀，制成转染液，共260 μ L，室温放置30min以上。转染液逐滴接种细胞，每孔接250 μ L，共 接5孔，第六孔做阴性对照。然后在37°C，5% CO2培养箱中培养4-6h，之后吸弃上清，加入 含2%犊牛血清DMEM培养液，在37°C，5% CO2培养箱中培养，逐日观察转染细胞，待出现细 胞病变（CPE)和篮板后，反复冻融3次，收取培养物，离心去掉细胞碎片，保存上清作为重组 痘苗