一种脂类化合物siRNA转染试剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种脂类化合物siRNA转染试剂，属于小干扰核酸（siRNA, small interfering RNA)转染试剂的技术领域。
【背景技术】
[0002] 抑制细胞内特定基因表达是一种非常重要的研宄基因功能和寻找新的核酸药物 的方法。常用的抑制细胞内基因表达的方法是将一段人工合成的siRNA转染至细胞内，弓丨 发核酸干扰（RNAi)，即双链RAN(dsRAN)在细胞内特异性诱导同源互补mRNA降鮮的现象， 从而封闭细胞内与之同源的目标基因的表达。由于siRNA是一种带强负电荷的分子，不能 自己进入细胞，因此需要特殊的载体帮助才能进入细胞。利用载体将siRNA导入细胞内的 方法叫转染，将siRNA导入细胞内的载体叫转染试剂。目前的转染试剂有许多材料，包括脂 类物质、多肽、聚乙烯亚胺（PEI)，均可将siRNA传输至细胞内，但最常用的是脂类物质，且 有多个以脂类物质为材料的siRNA转染试剂在科研用市场上销售。然而，这些转染试剂绝 大多数是单纯用阳离子脂质化合物配制的，存在如下问题：（1)细胞转染效率低，普通细胞 株转染阳性率一般在60%以内；（2)基因抑制效果差，抑制效率一般在65%以内；（3)细胞 毒性大，转染细胞死亡率一般在30% -50%以上。由于细胞转染死亡率较高，转染阳性率又 很低，siRNA转染实验无法获得准确的结果，尤其是细胞对转染试剂的毒性引起一系列的反 应，从而导致基因表达的变化，往往引起对基因功能研宄的误判。
【发明内容】
[0003] 鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种新型脂类化合物siRNA转染试 剂，以解决常规阳离子脂质化合物转染试剂的转染效率不高、毒性大的问题。
[0004] 为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验研宄并不懈探索，最终获得了如下 技术方案：
[0005] -种脂类化合物siRNA转染试剂，其包含有如下化合物：脂多胺、磷脂和阳离子脂 质。
[0006] 对上述脂类化合物siRNA转染试剂的各组分用量进行优选后，其中的脂多胺、磷 脂和阳离子脂质的重量比范围是（〇. 05~0. 5) : (0. 1~0. 5) : (0. 1~0. 8)。
[0007] 本发明术语"磷脂"意指由脂肪酸，磷酸和含氮碱基组成的各种化合物，包括但 不限于磷脂酰乙醇胺、卵磷脂、磷脂酰肌醇和心肌磷脂，可以选自如下的任何一种或多种： 1，2-二月桂酰基-顺-甘油酯（DLG) ; 1，2-二肉豆蔻酰基-顺-甘油酯（DMG) ; 1，2-二棕榈 酰基-顺-甘油酯（DPG) ; 1，2-二硬酯酰基-顺-甘油酯（DSG) ; 1，2-二月桂酰基-顺-甘 油-3-磷酯酸（钠盐；DLPA) ;1，2-二肉豆蔻酰基-顺-甘油-3-磷酯酸（钠盐；DMPA); 1，2-二棕榈酰基-顺-甘油-3-磷酯酸（钠盐；DPPA) ; 1，2-二硬酯酰基-顺-甘油-3-磷 酯酸（钠盐；DSPA) ;1，2-二花生四烯酰基-顺-甘油-3-磷酯酸（DAPC) ;1，2-二月桂酰 基-顺-甘油-3-磷酸胆碱（DLPC) ; 1，2-二肉豆蔻酰基-顺-甘油-3-磷酸胆碱（DMPC); 1，2-二棕榈酰基-顺-甘油-ο-乙基3-磷酸胆碱（氯离子或三氟甲磺酸根离子；DPePC); 1，2-二棕榈酰基-顺-甘油-3-磷酸胆碱（DPPC) ;1，2-二硬酯酰基-顺-甘油-3-磷 酸胆碱（DSPC) ;1，2-二月桂酰基-顺-甘油-3-乙醇氨磷酸酯（DLPE) ;1，2-二肉豆蔻酰 基-顺-甘油-3-乙醇氨磷酸酯（DMPE) ; 1，2-二棕榈酰基-顺-甘油-3-乙醇氨磷酸酯 (DPPE) ; 1，2-二硬酯酰基-顺-甘油-3-乙醇氨磷酸酯（DSPE) ; 1，2-二月桂酰基-顺-甘 油-3-甘油磷酸（钠盐；DLPG) ;1，2-二肉豆蔻酰基-顺-甘油-3-甘油磷酸（钠盐；DMPG); 1，2-二肉豆蔻酰基-顺-甘油-3-磷酸-顺-1-甘油（铵盐；DMP-sn-1-G) ; 1，2-二棕榈酰 基-顺-甘油-3-甘油磷酸（钠盐；DPPG) ;1，2-二硬酯酰基-顺-甘油-3-甘油磷酸（钠 盐；DSPG) ;1，2_二硬酯酰基-顺-甘油-3-磷酸-顺-1-甘油（钠盐；DSP-sn-1-G) ;1，2_二 棕榈酰基-顺-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸（钠盐；DPPS) ; 1-棕榈酰基-2-亚油酰基-顺-甘 油-3-磷酸胆碱（PLinoPC) ; 1-棕榈酰基-2-油酰基-顺-甘油-3-磷酸胆碱（POPC) ; 1-棕 榈酰基-2-油酰基-顺-甘油-3-甘油磷酸（钠盐；POPG) ; 1-棕榈酰基-2-油酰基-顺-甘 油-3-甘油磷酸（铵盐；P0PG) ;1_棕榈酰基-2-lyso-顺-甘油-3-磷酸胆碱（P-Iyso-PC); 1，2_ 二油酰 _sn_ 甘油基 _3_ 磷酸乙醇胺（1，2-dioleoyl-sn-glycero_3-phosphoethanola mine，DOPE) ;1-硬醋酰基-2-lyso-顺-甘油-3-磷酸胆碱（S-Iyso-PC) ; 1,2-二二十六碳 六烯酰基-顺-甘油-3-乙醇氨磷酸酯（22: 6PE) ; 1，2-二花生四烯酰基-顺-甘油-3-乙 醇氨磷酸酯（20:4PE) ;1，2_二亚麻酰基-顺-甘油-3-乙醇氨磷酸酯（18:3PE) ;1，2_二 亚麻酰基-顺-甘油-3-乙醇氨磷酸酯（DlinPE) ;1，2-二棕榈酰基-顺-甘油-3-乙醇 氨磷酸酯（DPPE) ;1，2-二棕榈酰基-顺-甘油-3-乙醇氨磷酸酯（DPPE) ;1，2-二硬酯酰 基-顺-甘油-3-乙醇氨磷酸酯（DSPE) ; 1，2-二肉豆蔻酰基-顺-甘油-3-乙醇氨磷酸酯 (DMPE)〇
[0008] 上述的磷脂中，一些含有磷酯酸或者磷酸基团的，在市售产品中一般是其钠盐的 形式，例如：1，2-二月桂酰基-顺-甘油-3-磷酯酸；在本发明中提供的转染试剂组合物中， 既可以采用其钠盐形式，也可以采用其游离酸形式。
[0009] 本发明中术语"阳离子脂质"意指任何一种带有阳离子的脂类化合物，大部分阳 离子脂质的特点是带有游离的順 2或NH基团。本发明中阳离子脂质化合物优选为N，N-二 油烯基 _N, N-二甲基氯化按（N，N_di oleyl-N，N-dimethylammonium chloride，D0DAC); N- (I- (2, 3-二油烯基氧基）丙基）-N，N，N-三甲基氯化铵（N- (I- (2, 3-dioleyloxy) propyl)-N, N，N-trimethylammonium chloride，DOTMA) ;N, N-二甲基- (2,3-二油稀 基氧基）丙胺（N，N-dimethyl-(2,3-dioleyloxy)propylamine，DODMA) ;N,N_ 二硬脂 基-N, N-二甲基溴化按（N,N-distearyl-N，N-dimethylammonium bromide，DDAB); N- (I- (2, 3-二油酰基氧基）丙基）-N，N，N-三甲基氯化铵（N- (I- (2, 3-di oleoyl oxy)propyl)-N，N，N-trimethylammonium chloride，D0TAP) ;3-(N_(N，，N，-二甲基氨 基乙烧）-氨基甲酰基）胆固醇（3-(N_(N，，Ν' -dimethylaminoethane)_carbamoyl) cholesterol，DC-Cho I); N-(I，2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基）-N，N-二甲基-N-羟乙基 溴化按(N-(l, 2-dimyristyloxyprop-3-yl)-N, N-dimethyl-N-hydroxyethyl ammonium bromide，DMRIE) ; I, 3-二油酰氧基-2- (6-羧基 SPERMYL) PROPYLAMID (I, 3-DI-0LE0YL0X Y-2-(6-CARB0XY-SPERMYL)-PR0PYLAMID，D0SPER) ;1，2-二亚油基氧基-N, N-二甲基氨基 丙烷（l，2-Dilinoleyloxy-N，N-dimethylaminopropane，DLinDMA);和 1，2_ 二亚麻基氧 基-N, N-二甲基氨基丙烷（1，2-Dilinolenyloxy-N, N-dimethylaminopropane，DLenDMA)、 双十八烷基二甲基按（dioctadecyldimethylammonium，DODMA)、双硬脂基二甲基按 (Distearyldimethylammonium，DSDMA)、1，2-二亚油基氧基-N, N-二甲基氨基丙烷（1，2_di linoleyloxy-N, N-dimethylaminopropane，DLinDMA)、1，2-二亚麻基氧基-N, N-二甲基氨 基丙烷（l，2-dilinolenyloxy-N，N-dimethylaminopropane，DLenDMA)、M-精胺胆固醇氨 基甲酸酯（GL-67)、N4-亚精胺胆固醇氨基甲酸酯（GL-53)、1-(N4-精胺）-2,3_二月桂基甘 油氨基甲酸酯（GL-89)中的任何一个或者任何至少两个以上的混合物。
[0010] 所述的脂类化合物siRNA转染试剂，其中的脂多胺中不含有游离氨基。
[0011] 优选地，如上所述的脂类化合物siRNA转染试剂中的脂多胺的结构中至少一个胺 基上连接有1个或2个如式（I)所示的基团：
[0012]
【主权项】
1. 一种脂类化合物SiRNA转染试剂，其特征在于，其包括如下化合物：脂多胺、磷脂和 阳离子脂质。
2. 根据权利要求1所述的脂类化合物SiRNA转染试剂，其特征在于：所述的脂多胺、磷 脂和阳离子脂质的重量比范围是（〇. 05~0. 5) : (0. 1~0. 5) : (0. 1~0. 8)。
3. 根据权利要求1或2所述的脂类化合物SiRNA转染试剂，其特征在于：所述的脂多 胺中不含有游离氨基。
4. 根据权利要求1所述的脂类化合物SiRNA转染试剂，其特征在于：所述的脂多胺结 构中的至少一个胺基上连接有1个或2个如式（I)所示的基团：
其中，R是含有3~18个碳原子的直链或者带有支链的烷基，η是0或者1。
5. 根据权利要求1所述的脂类化合物SiRNA转染试剂，其特征在于：所述的脂多胺是 由胺基化合物上的胺基与环氧化合物上的环氧基充分反应而得。
6. 根据权利要求5所述的脂类化合物SiRNA转染试剂，其特征在于：所述的胺基化合 物选自如下所示的结构：
--MU
ο
7.根据权利要求5所述的脂类化合物siRNA转染试剂，其特征在于：所述的环氧化合 物的结构如式（Π)所示：
其中，R是含有3~18个碳原子的直链或者带有支链的烷基，η是O或者1。
8. 根据权利要求7所述的脂类化合物SiRNA转染试剂，其特征在于：所述的环氧化合 物选自如下所示的结构：
;中m = 12~14之间的任意整数；
其中p = 8~10之间的任意整数；
9. 根据权利要求1或2所述的脂类化合物SiRNA转染试剂，其特征在于：所述的转染试 剂的组成选自如下的组合之一 ：（1)S1C2、DPPC 和 DODAC ; (2)B1C2、DOPE 和 DDAB ; (3)B2C2、 DOPE 和 DDAB ; (4)B2C3、DOPE 和 DDAB ; (5)B2C4、DOPE 和 DDAB ; (6)B2C5、DOPE 和 DDAB ; (7) B2C6、D0PE 和 DDAB。
10. 阳离子脂质与脂多胺或/和磷脂在制备siRNA转染试剂中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种脂类化合物siRNA转染试剂，属于小干扰核酸(siRNA,small interfering RNA)转染试剂的技术领域。本发明的脂类化合物siRNA转染试剂包括脂多胺、磷脂化合物和阳离子脂质化合物。与已有的siRNA转染试剂相比，本发明的siRNA转染试剂细胞毒性低，转染效率高，基因抑制效果更加明显，特别适合于细胞基因功能的研究和siRNA类药物的开发应用。
【IPC分类】C12N15-87
【公开号】CN104878044
【申请号】CN201510213174
【发明人】崔坤元, 梁东, 夏国庆
【申请人】常州百代生物科技有限公司
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2015年4月29日