一种Ficolin-3电化学免疫传感器及其制备与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医学检测领域，具体涉及一种FiC〇lin-3电化学免疫传感器及其 制备与应用。
【背景技术】
[0002] 近年来，糖尿病发病率逐年增加，已经成为全世界严重的公共健康问题。II型糖尿 病是代谢性疾病，多见于中、老年人，占糖尿病患者的90%以上。生物标志物是用来表达某 种生物学状态或过程的物质，能够反映机体内存在某种微生物或生物学过程，特殊疾病状 态，或者具有特殊DNA序列片段或特殊遗传信息。生物标志物可以是蛋白质，肽段，核酸，糖 化合物，脂类化合物及小分子物质等。临床上，生物标志物常常用于疾病筛查和诊断(包括 临床疗效判断）。
[0003] 分子诊断学是新发展的临床诊断方法，主要是对DNA、RNA和蛋白质的检测。分子诊 断学主要是利用分子生物学的技术和方法研究人体内源性或外源性生物大分子的存在、结 构或表达调控的变化，为疾病的预防、预测、诊断、治疗和转归提供信息和决策依据。分子诊 断技术的发展方向是特异性好、灵敏度高、针对性强、诊断快速。固然，到目前为止，分子杂 交、聚合酶链式反应(PCR)和DNA序列测定仍然是检测DNA和RNA的基本技术和主流技术，蛋 白质印迹(Western blot)、酶联免疫吸附法(ELISA)、蛋白截短测试和质谱法仍然是分析测 定蛋白质的主要手段。传统的检测生物标志物的方法有PCR、ELISA和电泳等，这些方法基本 上是医院检测的"金标准"，结果比较准确可靠，但是存在一些缺点，如检测灵敏度低、检测 时间长、需要贵重的仪器，不利于生物标志物含量低的疾病的早期检测。
[0004] 已有很多研究发现了很多与II糖尿病发生发展和早期诊断相关的生物标记物，其 中有蛋白质、DNA和microRNA等。Ficolin-3是一种补体系统模式识别蛋白，参与机体天然免 疫，激活补体凝集素途径，调理炎症，清除晚期凋亡细胞等。2008年发现Ficolin-3在II型糖 尿病人血清中表达异常，有望作为检测II型糖尿病的生物标记物，并应用大量的临床样本 证明了Ficolin-3可以作为II型糖尿病预测新标记物。Ficolin-3在糖尿病领域的重要发现 为糖尿病的早期发现、及时干预提供了必要手段，也为未来糖尿病的有效治疗提出进一步 探索的方向。
[0005] 目前针对血清Ficolins的检测方法有Western Blotting和ELISA，Western Blot 所需要的设备方便，使用灵活，但是缺点是定量结果不准确、操作复杂、重现性不理想，稳定 性差;ELISA法则操作步骤繁琐且成本高。因此，有必要寻找更好的Ficolins的检测方法。
【发明内容】
[0006] 为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种Ficolin-3电化 学免疫传感器及其制备与应用。
[0007] 为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
[0008] 本发明的第一方面，提供了一种Ficolin-3电化学免疫传感器，包括工作电极，所 示工作电极包括基底电极和捕获分子，所述基底电极选用玻碳电极，所述捕获分子选用 Ficol in_3单克隆抗体。
[0009] 优选地，所述捕获分子固定于所述基底电极上。
[0010] 进一步优选地，所述捕获分子通过静电引力吸附于所述基底电极上。
[0011 ] 优选地，所示基底电极上捕获分子的密度范围是56.62~106.16ng/mm2。
[0012] 更优选地，所示基底电极上捕获分子的密度范围是56.62~70.77ng/mm2。
[0013] 优选地，所述捕获分子选用鼠抗人Ficol in-3单克隆抗体。
[0014] 优选地，所示电化学免疫传感器中还含有参比电极和对电极。
[0015] 优选地，所示参比电极选用银/氯化银。所示对电极选用铂电极。
[0016] 本发明的第二方面，提供了前述电化学免疫传感器中工作电极的制备方法，包括 步骤:在基底电极表面添加捕获分子，孵育，获得工作电极。
[0017] 本发明的第三方面，提供了一种电化学免疫检测系统，包括前述电化学免疫传感 器。
[0018] 优选地，电化学免疫检测系统，还包括生物素标记Ficolin-3多克隆抗体、亲和素 修饰的辣根过氧化物酶(Avidin-HRP)、含有过氧化氢的TMB底物溶液。
[0019] 优选地，所述生物素标记Ficolin-3多克隆抗体为生物素标记羊抗人Ficolin-3多 克隆抗体。
[0020] 本发明的第四方面，提供了一种使用前述电化学免疫传感器检测Ficolin-3的方 法，包括步骤：
[0021] (1)封闭电化学免疫传感器中工作电极上的非特异性结合位点；
[0022] (2)在步骤(1)所得已经封闭其他非特异性结合位点的工作电极上添加待测样本， 孵育；
[0023] (3)再在步骤(2)所得工作电极上添加生物素标记Ficolin-3多克隆抗体，孵育；
[0024] (4)再在步骤（3)所得工作电极上添加亲和素修饰的辣根过氧化物酶(Avidin-HRP)；
[0025] (5)将步骤(4)所得工作电极放在含有过氧化氢的TMB底物溶液中，进行检测。
[0026] 优选地，所述方法为非疾病诊断目的的方法。
[0027] 优选地，步骤（1)中，采用BSA封闭电化学免疫传感器中工作电极上的非特异性结 合位点。
[0028] 优选地，步骤⑵中，孵育温度为4~25°C，孵育时间为45~75min。更优选地，孵育 时间为60min。
[0029] 优选地，步骤(3)中，所述生物素标记Ficolin-3多克隆抗体为生物素标记羊抗人 Ficol in_3多克隆抗体。
[0030] 优选地，步骤⑶中，孵育温度为4~25 °C，孵育时间为60~90miη。更优选地，孵育 时间为60min。
[0031] 优选地，步骤(3)中，生物素标记Ficolin-3多克隆抗体的浓度为25~30μg/ml。更 优选地，生物素标记Ficol in-3多克隆抗体的浓度为25μg/ml。
[0032]优选地，步骤(4)中，检测时采用三电极系统，除了工作电极以外，还包括对电极和 参比电极。
[0033] 优选地，采用铂电极为对电极，银/氯化银为参比电极。
[0034] 本发明第四方面提供了前述电化学免疫传感器在制备Ficolin-3检测产品中的用 途。
[0035] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0036] 与传统的Ficolin-3检测手段相比，本发明的电化学免疫传感器具有如下优点： (1)灵敏度高，检测限低至lOOng/mL; (2)检测时间缩短三分之一，准确性强；（3)本发明所构 建的电化学免疫传感器不需要对工作电极中的基底电极做修饰，制作及操作更简单，成本 低，应用前景广阔。
【附图说明】
[0037]图1:本发明电化学免疫传感器检测原理图。
[0038]图2:电化学阻抗图谱法的尼奎斯特图。
[0039]图3:(A)构建的电化学免疫传感器检测Oμg/ml(实线）、25μg/ml(长虚线）和50yg/ ml (短虚线）的Ficolin-3时响应的循环伏安曲线；（B)电化学免疫传感器对Oμg/ml(实线）、 25μg/ml (长虚线)和50μg/ml (短虚线)Ficolin-3响应的时间电流曲线。
[0040] 图4:电化学免疫传感器对Ficolin-3孵育时间的电流响应值的柱状分析图。
[0041] 图5:电化学免疫传感器对生物素标记羊抗人Ficolin-3多克隆抗体孵育时间的电 流响应值的柱状分析图。
[0042]图6:是电化学免疫传感器对生物素标记羊抗人Ficolin-3多克隆抗体孵育浓度的 电流响应值的柱状分析图。
[0043] 图7: (A)从上至下依次为Ficolin-3浓度为0μg/ml、0 · 2μg/ml、0.5μg/ml、lμg/ml、2 μg/ml、5μg/ml、1 Oμg/ml、25μg/ml和50μg/ml 的时间电流曲线；（B)从左至右依次为Oμg/ml、 0·2μg/ml、0·5μg/ml、lμg/ml、2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、25μg/ml和50μg/ml的Ficolin-3在 IT扫描第100s时电流值的柱状分析;右上角的插入图为Ficolin-3浓度为2yg到50yg线性曲 线。
[0044] 图8:电化学免疫传感器选择性分析。
[0045] 图9:电化学免疫传感器检测实际II型糖尿病临床血清样本中Ficolin-3。
【具体实施方式】
[0046] 在进一步描述本发明【具体实施方式】之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下 述特定的具体实施方案;还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体 实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法， 通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
[0047] 当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端 点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和 科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、 材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本 发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实 现本发明。
[0048] 除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领 域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及 相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可