一种用于指导肿瘤靶向药用药的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及多重免疫检测领域，具体地说是一种用于指导肿瘤靶向药用药的试剂 盒。
【背景技术】
[0002] 在过去的20年，靶向药逐渐成为肿瘤治疗中的支柱。体外与动物体内的实验显示， 这些针对靶点的靶向药可以引起细胞的凋亡，并通过补体介导的细胞毒性（complement-mediated cytotoxicity ，CMC) 以及抗体依赖细胞介导的细胞毒作用（antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC)杀死革El细胞。与传统化疗药物相比，革El向药可以高选择性杀 伤肿瘤细胞而减少对正常组织的损伤，具有低毒、高效的特点，并且可能从根本上抑制或消 灭肿瘤细胞。
[0003] -般而言，一个肿瘤细胞表面通常有多个可用的靶点，针对不同的靶点也会有不 同的靶向药。以乳腺癌为例，目前已有的靶向药所利用的靶点就有HER2、EGFR、mT0R等。比如 用于治疗乳腺癌的曲妥珠单抗(Trastuzumab)药物，就是针对祀点HER2的革E1向药。目前已有 多种靶向药被FDA批准用于临床治疗。
[0004] 然而，由于不同患者间的肿瘤细胞存在个体差异，肿瘤细胞的靶点蛋白的表达也 存在差异性，这使得同一种靶向药对于不同的患者而言治疗效果存在较大差异。因此，筛选 出合适的用药靶点，对于靶向药用药具有重要的指导意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的主要目的是针对上述【背景技术】存在的不足提供一种用于指导肿瘤靶向 药用药的试剂盒，该试剂盒通过对肿瘤细胞表明靶点抗原表达量的检测，筛选出合适的用 药靶点，对肿瘤靶向药提供用药指导。
[0006] 本发明是通过如下技术方案实现的：一种用于指导肿瘤靶向药用药的试剂盒，其 特征在于:它包括：
[0007] 所述肿瘤靶向药作用靶点对应的抗体与寡核苷酸偶联得到的抗体-寡核苷酸探 针；
[0008] 用于将抗体-寡核苷酸探针进行PCR扩增的扩增引物及缓冲液；
[0009] 还包括荧光探针。
[0010]进一步的，所述抗体-寡核苷酸探针包括寡核苷酸探针部分和抗体部分;所述寡核 苷酸探针部分是将寡核苷酸的5 '端进行醛基修饰后得到的，所述抗体部分是将抗体进行肼 基修饰后得到的；所述寡核苷酸探针部分和所述抗体部分经过偶联得到所述抗体-寡核苷 酸探针。
[0011]更进一步的，所述寡核苷酸探针部分是将5 '端带有氨基修饰的寡核苷酸，用摩尔 当量为5-20倍的SFB进行醛基修饰后得到的;所述抗体部分是将抗体用摩尔当量为10-50倍 的SANH进行肼基修饰后得到的。
[0012] 其中，上述的SFB是指4-甲酰苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯；上述的SANH是指4-(N-马来 酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯。
[0013] 所述抗体-寡核苷酸探针是将摩尔比为（7-10):1的寡核苷酸探针部分和抗体部 分，在室温条件下反应4-24小时后得到的。
[0014]优选的，所述寡核苷酸的长度为16-22nt，5'端为6-14nt长度的引物识别序列，3' 端用延伸引物进行延伸扩展。
[0015]进一步的，所述延伸引物的长度为50-80nt，它的3'端末端与寡核苷酸的3'端互补 配对，5'端可以形成发卡结构，且中间序列与荧光探针的序列互补。延伸引物的序列优选为 SEQ ID N0:14所示。
[0016]优选的，所述寡核苷酸的序列为SEQ ID NO: 1-13中所示的任一个。
[0017]所述扩增引物中包括一对用于将抗体-寡核苷酸探针进行PCR扩增的正向、反向引 物，所述正向引物的5 '端与寡核苷酸互补。
[0018] 优选的，所述靶点包括HER2、EGFR、VEGFR-2、BRAF、PD-1 /PD-L1中的一种或多种。
[0019]更优选的，所述肿瘤靶向药为单克隆抗体药和/或小分子抑制剂。
[0020]发明原理
[0021]目前已有多种针对肿瘤细胞的靶向药被Π )Α批准用于临床治疗，包括但不限于如 表1所示。
[0022]表1部分肿瘤靶向药及其靶点 I" λλοο?
[0024] 本发明具有如下有益效果：
[0025] 1.本发明所述的试剂盒通过将肿瘤细胞表面靶点对应的抗体与寡核苷酸偶联后 作为探针，可以通过PCR检测出该靶点抗原的表达量，从而筛选出更合适的靶点，指导靶向 抗体药的用药。
[0026] 2.本发明通过偶联醛基和肼基得到抗体-寡核苷酸的方式，可以制备得到多于一 种抗体分别各自与寡核苷酸偶联的多种探针，每种抗体-寡核苷酸探针的寡核苷酸都不相 同。从而可以通过寡核苷酸的PCR扩增，来实现多重检测，平行检测各抗体分别对应的抗原 含量。适用于对同一肿瘤细胞上多个靶点一次性筛选，效率更高。
[0027] 3.本发明先将不同的寡核苷酸与不同的抗体各自独立的进行定向修饰得到寡核 苷酸探针部分和抗体部分，从而可以避免抗体内部发生交联，使寡核苷酸探针部分和抗体 部分的偶联具有高度特异性，得到的腙键偶联物稳定性好。而且定向修饰及偶联的反应条 件温和，不需另外使用还原剂，抗体不易变性和失活。
[0028] 4.用延伸引物对寡核苷酸的3 '端扩增，可以保证寡核苷酸链过短时的PCR扩增要 求，并且延伸引物5'端的发卡结构可以增加碱基的堆砌力，从而增强探针敏感性，使通用型 抗体-寡核苷酸探针检测更加灵敏。
[0029] 5.由于寡核苷酸与延伸引物是在3'端互补配对的，因此延伸扩展的过程在PCR扩 增过程中可自行反应，延伸扩展之后再以延伸后的抗体-寡核苷酸为模板进行扩增，一步反 应即可，反应效率高。
[0030] 6.由于采用了PCR扩增的方式，比传统ELISA方法检测的敏感度提高了几个数量 级，即使待检测抗原浓度很低，也可以对微量抗原进行检测。
【具体实施方式】
[0031] 以下通过具体实施例来进一步说明本发明：下列实施例中未注明具体条件的实验 方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0032] 本发明要得到抗体-寡核苷酸探针，其是通过先将寡核苷酸与抗体分别进行醛基 和肼基的定向修饰得到寡核苷酸部分和抗体部分，再进行腙键偶联得到。优选的，所述寡核 苷酸探针部分是将5'端带有氨基修饰的寡核苷酸，用摩尔当量为5-20倍的SFB进行醛基修 饰后得到的，优选摩尔当量为10倍;所述抗体部分是将抗体用摩尔当量为10-50倍的SANH进 行肼基修饰后得到的，优选摩尔当量为25倍。其中，SFB为4-甲酰苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯， SANH为4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯。用SFB修饰寡核苷酸的5'端 上的氨基可以得到醛基活化的寡核苷酸，用SANH修饰抗体可以得到肼基活化的抗体蛋白。 这两个反应为公开技术可以得到的，如中国文献"基于核酸分子杂交的免疫芯片抗体固定 新方法"，《分析化学》，2013年第2期，沙莎等公开的。反应时间、反应温度等条件可根据文献 内容做出本领域技术人员公知的调整。本发明优选的技术方案为:将5'端带有氨基修饰的 寡核苷酸用pH值为7.4的PBS缓冲液溶解，然后与摩尔当量为寡核苷酸10倍的SFB溶液混合， 室温反应2.5小时，再纯化得到醛基修饰的寡核苷酸探针部分。将抗体用pH值为7.4的roS缓 冲液稀释后，与摩尔当量为抗体25倍的SANH溶液混合，室温反应2.5小时，再纯化得到肼基 修饰的抗体部分。最后将摩尔比为(7-10): 1的寡核苷酸探针部分和抗体部分在室温下偶联 反应得到所述抗体-寡核苷酸探针。
[0033] 以下通过实施例1来进行进一步说明，其余未说明的具体条件及实验方法，按照常 规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0034] 本实施例中所述的"室温"是指常规的室内温度，一般为15-30 °C。
[0035] 本实施例将序列为SEQ ID ^):(1-13)的01丨8〇简写为01丨8〇(1-13)，01丨8〇为寡核 苷酸。
[0036]本实施例中的PBS缓冲液为磷酸缓冲液，MES缓冲液为2-(N-吗啉代）乙磺酸缓冲 液。
[0037]本实施例中的QPCR为实时荧光定量PCR。
[0038] 本实施例中的Nanodrop为分光光度计。
[0039] 本实施例中的BCA法是指蛋白质浓度测定的定量方法。
[0040] 本实施例所用的缓冲液为:配置不同pH值的roS缓冲液，在本发明的【具体实施方式】 中，具体包括pH值为6.0的PBS