用于检测o型fmdv抗体的固相阻断elisa试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测FMDV抗体的试剂盒，特别涉及一种可用于检测0型FMDV抗体 的固相阻断ELISA试剂盒，属于生物制品检测技术领域。
【背景技术】
[0002] 口蹄疫（foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，FMDV)引起的急性、高度接触性传染病，主要侵害偶蹄动物，偶见于人和其 它动物。世界动物卫生组织(Office International des Epizooties，0IE)将其列为法定 申报的传染病，我国将其列一类动物疫病。FMDV在全世界有7个血清型，包括0、A、C、亚洲I (Asia 1)、南非I(SAT 1)、南非II(SAT 2)和南非III(SAT 3)，血清型之间无交叉免疫现象。 目前我国FMDV流行毒株主要为0型和A型，其中0型FMDV基因型众多，流行广泛，严重危害畜 牧养殖业发展。
[0003] 我国对FMD采取强制性免疫策略，疫苗免疫效果成为影响FMD防控的关键所在。疫 苗免疫效果的监测主要有两种方法，正向间接血凝试验（IHA)和酶联免疫吸附试验 (ELISA) <JHA简单易行，但其结果判断较为主观，且受血凝抗原影响较大，在国际上已不再 使用。ELISA方法操作自动化强，降低了主观因素干扰，适用于大量临床样本的抗体监测。常 用ELI SA方法包括VP1结构蛋白抗体间接ELI SA和液相阻断ELI SA。VP 1蛋白抗体间接ELI SA是 以FMDV的VP1蛋白作为包被抗原捕获血清特异性抗体，然后通过酶标二抗识别血清抗体，最 后经底物显色进行信号放大。间接ELISA操作简便，但该方法具有种属特异性，在临床上需 针对不同宿主制备试剂盒，应用繁琐。此外，间接ELISA受非特异性因素影响较大，而且只能 检测一种血清抗体，如IgG。
[0004] 液相阻断ELISA使用全病毒灭活抗原与血清抗体进行体外中和试验，然后通过双 抗体夹心法捕获过剩抗原，最后经酶标二抗进行底物显色与信号放大。液相阻断ELISA是 0ΙΕ推荐的检测FMDV抗体的标准方法，在世界范围内应用广泛。但是该方法也有缺点：（1)使 用全病毒灭活抗原，涉及病毒培养、灭活与浓缩纯化，对生产条件、生产人员素质和生产过 程要求比较严格，同时存在生物安全风险；（2)全病毒抗原的制备较为复杂，涉及细胞培养 以及病毒繁殖，生产周期长，产量也受限制；（3)全病毒抗原生产需要使用P3实验室、超速离 心机等高端仪器设施，不利于推广应用。
[0005] 随着免疫学的不断发展进步，基于FMDV中和表位的亚单位疫苗、多肽疫苗等新型 疫苗将凭借更高的纯度与免疫精准度逐步替代传统灭活疫苗。与此同时，针对FMDV抗体建 立安全、敏感、特异的检测方法对疫苗的免疫效果监测具有重要意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种用于检测0型FMDV抗体的间接固相阻断ELISA试剂盒， 利用基因工程技术表达的病毒蛋白作为包被抗原，可针对0型FMDV特异性抗体进行检测，且 不区分样品宿主来源。
[0007] 本发明试剂盒的检测原理是样品中抗FMDV抗体与包被抗原结合导致兔抗血清与 抗原的结合量减少，形成"包被抗原-兔抗血清-酶标抗体"复合物，最后加入底物进行显色 反应，显色深浅与样品中抗体含量成反比。
[0008] 本发明的试剂盒中含有酶标板、洗涤液、样品稀释液、兔抗血清、酶标二抗、底物A 液、底物B液、终止液、阳性对照血清、阴性对照血清，其中所述酶标板包被有0型FMDV基因工 程抗原。
[0009] 具体地，其中所述酶标板包被0型FMDV基因工程抗原的过程为：用包被缓冲液将抗 原稀释，以100uL/孔的量加入酶标板，4°C包被12h，用洗涤液洗涤3次;加入封闭液，200uL/ 孔，4°C封闭12h;甩去封闭液，洗板3次，置于37°C干燥，用铝箱真空密封。
[0010] 优选情况下，所述包被缓冲液为PH9.6的碳酸盐缓冲液。
[0011]优选情况下，所述封闭液为含10%胰蛋白胨的PBS缓冲液。
[0012]在本发明的一个优选实施例中，所述酶标二抗采用HRP标记的羊抗兔IgG抗体。 [0013]在本发明的一个具体实施例中，其中所述兔抗血清是由0型FMDV基因工程抗原免 疫兔子制备。血清抗体经辛酸-硫酸铵法和G蛋白柱法进行初步纯化，然后用0型FMDV基因工 程抗原和标签抗原进行亲和层析纯化，去除了非特异性抗体，抗体纯度高。与单克隆抗体相 比，所述血清抗体制备简单、成本低，具有多个抗原表位结合位点，与包被抗原结合能力更 强。
[0014] 本发明的积极效果是：
[0015] 1、本发明试剂盒所使用的包被抗原为基因工程表达，不涉及病毒培养。相比传统 液相阻断ELISA试剂盒，其生产与使用过程中生物安全性好。
[0016] 2、本发明试剂盒使用固相阻断法，与传统间接ELISA试剂盒比，降低了抗原非特异 性抗体的干扰，检测结果更准确。
[0017] 3、本发明试剂盒避免了使用样品宿主来源的酶标二抗，与传统间接ELI SA试剂盒 比，不受样品的宿主来源限制，可用于多种动物血清样品检测，使用方便。
[0018] 4、本发明试剂盒使用基因工程技术制备的蛋白和血清多抗进行试剂盒生产，操作 简单安全，成本低，有益于推广应用。
【具体实施方式】
[0019] 根据本发明的用于检测0型FMDV抗体的固相阻断ELISA试剂盒，试剂盒内设有洗涤 液、样品稀释液、酶标二抗、底物A液、底物B液、终止液、封板膜，还包括0型FMDV阴阳性对照 血清，包被了 〇型FMDV抗原蛋白的酶标板，以及能够与包被抗原特异性结合的兔抗血清。其 中兔抗血清与包被抗原具有很高的结合活性，是由0型FMDV抗原蛋白免疫兔子制备。
[0020] 下面具体介绍本发明试剂盒内各试剂的来源(或制备过程）、试剂盒的测试原理及 测试过程。
[0021] 下述实施例中的主要原材料的来源为:HRP标记羊抗兔IgG和0型FMDV基因工程抗 原购自洛阳佰奥通实验材料中心。0型FMDV液相阻断ELISA试剂盒购自中国农业科学院兰州 兽医研究所。其它试剂和材料均是来源于商业途径。所述的实验方法，若无特别说明，均为 常规实验方法。
[0022] -、试剂盒内各试剂的来源和制备过程
[0023] 1.1酶标板的制备
[0024] (1)酶标板的包被过程
[0025] 所述酶标板是以基因工程技术表达的0型FMDV基因工程抗原蛋白作为包被抗原， 用PH9.6的碳酸盐缓冲液将抗原进行稀释，以100uL/孔的量加入酶标板，4°C包被12h，用洗 涤液洗涤3次。加入封闭液，200uL/孔，4 °C封闭12h。甩去封闭液，洗板3次，置于37 °C干燥，用 铝箱真空密封。
[0026] (2)包被抗原最佳工作浓度的确定
[0027] 采用方阵滴定法确定抗原蛋白的最佳包被浓度。用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释抗 原蛋白，浓度分别为lug/mL、0 · 5ug/mL、0 · 25ug/mL、0 · 125ug/mL、0 · 0625ug/mL、0 · 03125ug/ mL，横向加入酶标板，4 °C包被12h。加10 %的胰蛋白胨，200uL/孔，37 °C封闭2h。阴阳性兔抗 血清同时做倍比稀释1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800，纵向加 入酶标板，组成方阵进行间接ELI SA。每孔加终止液50uL，测定0D450nm值。选择阳性0D值接 近1.0，阳性0D值/阴性0D值(P/N值)最大时的抗原包被浓度和抗体稀释度为最佳工作浓度。 确定的抗原最佳工作浓度为〇. 〇625ug/mL。
[0028] (3)封闭液和封闭时间的确定
[0029]用已确定的抗原最适工作浓度包被酶标板，分别用含3%明胶的PBS、含10%脱脂 奶粉的ros、含10 %胰蛋白胨的ros作为封闭液。37 °C分别封闭30min、lh、2h和3h。加底物显 色，读取0D450nm值。选择阳性0D值接近1.0，P/N值最大时的封闭液和封闭时间作为最适条 件。选择含1 〇 %胰蛋白胨的PBS作为最佳封闭液，封闭时间为2h。
[0030] 1.2酶标二抗的制备
[0031 ] Tris 2.42g，酶稳定剂0· 8g，氯化钠8 · 5g，红染料2g，新生牛血清100ml，Proclin 300 0.5ml，曲拉通X-100 1.5ml，加蒸馏水850ml，小心加入盐酸1.65ml，充分混勾，调节pH 值7.0，定容至1000ml，加入HRP标记的羊抗兔IgG抗体0.2ml，搅拌均匀，用0.22μπι的除菌滤 器过滤。无菌分装。
[0032] 1.3兔抗血清的制备
[0033]选用健康的成年大耳白兔，在免疫前取血收集非免疫血清作为对照。将0型FMDV基 因工程抗原与完全弗氏佐剂混匀乳化，进行兔背部皮下多点注射，每只兔子500yg。每隔2周 加强免疫1次，加强免疫时使用弗氏不完全佐剂，每只兔子250yg。三免后14天，采血进行效 价检测。效价达到1:1〇 4时，颈动脉放血处死动物，分离血清。血清使用辛酸-硫酸铵法和G蛋 白柱法进行初步纯化，然后用0型FMDV基因工程抗原和标签抗原进行亲和层析，以去除非特 异性抗体。纯化后血清置-20°C保存。
[0034] 1.4阴性对照血清的制备
[0035] 选用5周龄健康仔猪，经0型FMDV液相阻断E