一种基于免疫过氧化物酶细胞单层试验的gcrv病毒ⅱ型抗体检测试剂盒及其方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于免疫过氧化物酶细胞单层试验的草 鱼呼肠孤病毒π型抗体检测方法及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus，GCRV)隶属水生呼肠孤病毒属，为呼肠孤 病毒科一新成员，是中国大陆分离的第一株鱼类病毒。该病毒主要引起中国、越南、緬甸等 亚洲国家淡水养殖中的草鱼品种在鱼种阶段发生出血病，死亡率一般为30%-50%，最高可 达60%-90%，而且还能感染青鱼、麦穗鱼、布氏餐条鱼等，并能使这几种鱼发生出血病症状 而死亡，该病毒流行广、危害大、死亡率高、发病季节长，严重影响了广大养殖者的积极性和 我国淡水养殖业的健康发展。草鱼呼肠孤病毒具双层衣壳，病毒粒子平均直径为60 nm-70nm，二十面体对称，无囊膜，基因组由11条分节段的双链RNA组成。目前己经报道了20多个 分离株，包括6〇^854、6〇^861、6〇^873、6〇^875、6〇^876、6〇^991、!1962、2￥-8802、6〇^-854、GCRV HZ08、JX09-01、GCRV-104、GD10、HuNanl307、GZ1208等，不同分离株在基因组序 列、基因组带型、细胞病变、对草鱼的致病力等方面差异较大。草鱼呼肠孤病毒至今还没在 血清学或者基因型上对其进行系统分类。根据现有的分离株序列信息，进行核苷酸序列与 氨基酸序列比对以及构建系统进化树分析，所有毒株总体上可以分为3大类，分为3个基因 型，8卩60^1型（代表株为60^-873与60^-冗09-()1)、60^11型（代表株为60^-!1208与 GCRV-GD10)和GCRV ΙΠ 型(GCRV-104，GCRV-HB1007)。当前，全国各地分离到的流行株中，三 类亚型均有报道，有的单独感染，也有混合感染。通过我们2011年至2015年这5年的草鱼出 血病监测和流行病学调查分析表明，目前导致草鱼出血病流行和爆发的最主要为GCRV Π 型。因此，对GCRV Π 型病毒引起的草鱼出血病的特异性诊断具有重要意义。
[0003] 草鱼呼肠孤病毒的检测方法有多种，各具优势和缺陷，病毒分离、电镜观察、核酸 带型分析至今仍是检测草鱼呼肠孤病毒普遍采用的方法，但这些方法法费时费力、操作比 较复杂，不能对病毒进行快速诊断，不利于草鱼出血病的流行病学调查工作。全病毒诊断涉 及病毒培养、纯化及浓缩等过程，不仅制作过程复杂，耗时，成本较高，而且还潜在散毒危 险，因此不利于推广使用。当前，对于草鱼呼肠孤病毒的检测，最为常用的方法是基于PCR扩 增技术的各种分子生物学检测方法，包括常规的RT-PCR和荧光定量PCR等，具有较高的敏感 性和特异性。但这些分子生物学方法都是检测病毒的核酸存在与否，方法单一，经常导致假 阳性和假阴性结果，难于对该病做到确诊。因此，急需其它方法来弥补分子生物学检测方法 的不足，如各种免疫学(血清学)检测方法。
[0004] 目前，针对草鱼出血病的疫苗，无论是法规许可的细胞弱毒疫苗还是市场上流行 的土法疫苗，甚至一些细胞灭活疫，绝大部分都是针对GCRV Π 型的疫苗。而对这些疫苗免 疫效果的评价，只是根据免疫草鱼的死亡率来初步估计，一旦其它疫病的爆发导致免疫草 鱼死亡，就无法弄清是由于疫苗效果不好，草鱼出血病依然爆发导致而的死亡，还是由于其 它疫病的爆发而导致的死亡，更无法对疫苗免疫效果进行评价。因此，也急需要一种检测 GCRV特异性抗体的免疫学检测方法。临床和实验室试验证实草鱼出血病弱毒疫苗是预防控 制草鱼出血病的有效生物制剂，而对草鱼呼肠孤病毒特异性抗体的监测是评价鱼出血病疫 苗免疫效果及合理制定免疫程序的关键。对于草鱼呼肠孤病毒抗体的检测，目前还没有有 效可靠的方法，ELISA方法特异性好、灵敏度高、快速易行，可进行大量样品的检测，但存在 病毒抗原或重组蛋白抗原纯化条件苛刻、试剂保存条件要求高、检测需要酶标测定仪，只能 在具有一定条件的实验室使用等缺点。
[0005]
【发明内容】
[0006] 为了解决上述存在的问题，本发明建立的GCRV Π 免疫过氧化物酶单层细胞试验 (immunoperoxidase monolayer assay，IPMA)采用病毒感染细胞后固定作为检测抗原，试 验过程所需时间短、特异性好、敏感性高、操作方便、性能稳定、易于临床推广，并且观察时 只需普通的光学显微镜，适用于基层流行病学调查、临床检测和疫苗免疫后血清抗体的监 测 。
[0007] 本发明的目的是提供一种基于免疫过氧化物酶细胞单层试验的草鱼呼肠孤病毒 Π 型抗体检测试剂盒。
[0008] 本发明所采取的技术方案是： 一种基于免疫过氧化物酶细胞单层试验的草鱼呼肠孤病毒π型抗体检测试剂盒，该试 剂盒含有细胞内阳性抗原。
[0009] 进一步的，所述细胞内阳性抗原固定在细胞培养板上。
[0010] 进一步的，所述细胞内阳性抗原为感染了 Π 型草鱼呼肠孤病毒的细胞。
[0011] 进一步的，所述细胞为草鱼鳔细胞系GSB。
[0012] 进一步的，所述细胞内阳性抗原固定在细胞培养板上的具体操作为:将草鱼呼肠 孤病毒HZ08株接种到新消化的GSB细胞悬液中，混匀，加入到细胞板中，于27.5°028.5°C条 件下培养至形成单层细胞后取出，弃去细胞培养液，用PBS清洗后，用固定液固定12~17 min，干燥后即可。
[0013]进一步的，该试剂盒还含有抗草鱼IgM单克隆抗体，HRP标记的羊抗鼠单克隆抗体 IgG〇
[0014] 进一步的，该试剂盒还含有细胞内阴性抗原，阳性对照血清，阴性对照血清，样品 稀释液，磷酸盐缓冲液洗涤液，AEC显色液和血清稀释板。
[0015] 进一步的，所述细胞内阴性抗原为未感染草鱼呼肠孤病毒的细胞，固定在细胞板 中； 所述阳性对照血清为经草鱼呼肠孤病毒疫苗株892株病毒免疫后的血清，ELISA抗体效 价在1:400以上； 所述阴性对照血清为未经草鱼呼肠孤病毒免疫的血清； 所述样品稀释液由25mM DTT、100mM pH8.0的Tris缓冲液、2mM pH8.0的EDTA和200mM NaCl组成。
[0016] 进一步的，所述细胞为草鱼脑细胞系GSB。
[0017] -种基于免疫过氧化物酶细胞单层试验的草鱼呼肠孤病毒Π 型抗体检测方法，包 括如下步骤： 1) 将固定有细胞内阳性抗原和细胞内阴性抗原的细胞板，于室温预热25~35 min，PBS 洗1~2次； 2) 加入一抗:用PBS将待检血清进行系列稀释后，分别加入固定有细胞内阳性抗原或细 胞内阴性抗原的细胞板孔中，每孔80~130μΜ另外加入阳性对照血清、阴性对照血清分别 作为阳性对照和阴性对照； 3) 温育和洗涤:36.5~37.5 °C湿盒孵育45~75min，PBS洗涤； 4) 加入二抗:加入稀释如的抗草鱼IgM单克隆抗体，每孔80~130yL; 5) 温育和洗涤：同步骤3); 6) 显色：加入底物ACE，每孔80~12〇uL，室温显色15~45 min; 7) 去除底物液，每孔加入roS，用光学显微镜观察，判定结果。
[0018] 本发明的有益效果是： 1、 本发明的基于免疫过氧化物酶细胞单层试验的草鱼呼肠孤病毒Π 型抗体检测试剂 盒可以对无明显CPE(细胞病变）的Π 型草鱼呼肠孤病毒进行定量分析，测定病毒的浓度和 滴度； 2、 本发明的基于免疫过氧化物酶细胞单层试验的草鱼呼肠孤病毒Π 型抗体检测试剂 盒可以对草鱼呼肠孤病毒Π 型特异性抗体的进行定性检测，同时可以检测草鱼多份血清样 品并达到早期诊断的目的，对草鱼出血病的诊断、流行病学调查和病原监测具有较高的临 床使用及推广价值； 3、 本发明的基于免疫过氧化物酶细胞单层试验的草鱼呼肠孤病毒Π 型抗体检测试剂 盒能用于疫苗免疫注射后抗体的检测，进行疫苗免疫效果的评价，为草鱼出血病的预防控 制和免疫监测等提供科学的技术手段。通过该试剂盒的应用，将为我国控制并最终消灭草 鱼出血病提