LSIA试剂盒鉴定为0型FMDV抗体阴性 猪，经PCR方法鉴定为0型FMDV抗原阴性猪。颈动脉放血处死动物，分离血清，用辛酸-硫酸铵 沉淀法和G柱亲和层析法纯化血清。用阴性对照血清稀释液将纯化的血清作10倍稀释，充分 混匀，用0.22μπι滤膜过滤除菌，作为阴性对照血清，置-20°C保存。
[0036] 1.5阳性对照血清的制备
[0037] 选用5周龄健康仔猪，经0型FMDV液相阻断ELISA试剂盒鉴定为0型FMDV抗体阴性 猪，经PCR方法鉴定为0型FMDV抗原阴性猪。免疫0型FMDV灭活苗，用0型FMDV液相阻断ELISA 试剂盒进行效价测定。效价达到1:512时，颈动脉放血处死动物，分离纯化血清。用阳性对照 血清稀释液将纯化的血清作10倍稀释，充分混匀，用〇. 22μπι滤膜过滤除菌，作为阳性对照血 清，置-20°C保存。
[0038] 1.6样品稀释液的制备
[0039] 磷酸二氢钠1.28g，磷酸氢二钠0.41g，氯化钠20.09g，指示剂0.2g，新生牛血清 50ml，Procl in 300 0.5ml，加蒸馏水950ml，充分混勾，调节pH值6.0，定容至1000ml。然后分 装。
[0040] 1.7洗涤液的制备
[0041 ] 磷酸二氢钾4g，十二水磷酸氢二钠58g，氯化钠160g，Proclin 300 0.5ml，吐温-20 10ml，加蒸馏水定容至1000ml。然后分装。
[0042] 1.8底物A液和底物B液的制备
[0043]底物A液:柠檬酸2.10g，结晶乙酸钠12.25g，过氧化脲0.6g，加蒸馏水950ml，充分 混勾，调节pH值5.0，加蒸馏水定容至1000ml。分装。
[0044] 底物B液:柠檬酸2.10g，EDTA 0.3g，TMB-HCl 0.6g，加蒸馏水950ml，充分混匀，调 节pH值3.0，加蒸馏水定容至1000ml。分装。
[0045] 1.9终止液的制备
[0046] 取蒸馏水850ml，小心加入硫酸108.5ml，溶解完全，放凉后定容至1000ml。分装。
[0047] 二、测试过程和原理
[0048] 2.1测试过程
[0049] 步骤1:稀释待测样品，以100uL/孔的剂量加入酶标板，37°C孵育30min。甩干，洗板 3次，3min/次。
[0050] 步骤2:稀释兔抗血清，添加剂量100uL/孔，37 °C孵育30min。
[00511 步骤3:甩干，洗板，加酶标二抗，37 °C孵育30min。
[0052] 步骤4:甩干，洗板，加入底液A、B各50uL，37 °C显色10min。
[0053] 步骤5:每孔加终止液50uL，测定0D450nm值。
[0054] 2.2固相阻断ELISA最适反应条件的确定
[0055]用已确定的抗原最适工作浓度进行间接ELISA，采用方阵滴定法确定兔抗血清和 酶标二抗的最适工作浓度。封闭完成后，加入梯度稀释的兔抗血清（1:6000、1:8000、1: 10000、1:12000、16000、18000、20000、24000)和 HRP 酶标二抗（1:1000、1:2000、1:4000、1: 8000、1:16000、1: 32000、1:64000、1:128000)，37 °C孵育完成后显色，读取0D450nm值。选择 阳性0D值接近1.0，P/N值最大时的兔抗血清和HRP酶标二抗稀释度作为最适工作浓度。确定 兔抗血清最佳工作浓度为16000倍稀释，HRP酶标二抗为8000倍稀释。
[0056] 2.3固相阻断ELISA判定标准的确定
[0057] 取100份经0型FMDV液相阻断ELISA抗体检测试剂盒鉴定阳性的血清样品，按1: 32 稀释后进行间接阻断ELISA检测，读取0D450值。规定以100份血清的平均0D450值加上3倍标 准误差(SD)作为阴阳性的临界值，计算抑制率。结果显示，抑制率大于20%为阳性，抑制率 小于20%为阴性。阳性血清对照抑制率应在30% ± 1，阴性血清对照抑制率不得高于7%，否 则试验结果不成立。
[0058]抑制率计算公式：
[0059]
[0060] 2.4固相阻断ELISA敏感性试验
[0061 ] (1)对猪0型FMDV抗体阳性对照血清的灵敏度试验
[0062] 将猪0型FMDV阳性对照血清进行2倍梯度稀释，用本发明制备的固相阻断试剂盒进 行测定，确定该试剂盒对阳性对照血清的灵敏度，结果见表1。试剂盒检测梯度稀释的阳性 血清，检测效价达到1:128倍(抑制率大于20% )。
[0063] 表1对梯度稀释的阳性对照血清的灵敏度试验
[0064]
[0065] (2)对已知阳性血清样品的敏感性试验
[0066]使用0型FMDV液相阻断ELISA试剂盒鉴定获得120份阳性样品。使用本发明的固相 阻断ELISA试剂盒对样品进行检测。本发明的ELISA试剂盒检出阳性样品116份，有4份未检 出。结果表明本试剂盒对120份阳性样品的敏感性为96.7 %。
[0067] 2.5固相阻断ELISA特异性试验
[0068] (1)对猪0型FMDV抗体阴性质控血清的特异性试验
[0069]用本发明的固相阻断ELISA试剂盒检测7份0型FMDV抗体阴性质控血清，结果见表 2,本发明的阻断ELISA试剂盒与这些病毒抗体无交叉反应，特别是与A型FMDV以及亚洲I型 FMDV抗体也没有交叉反应。其中N1为A型FMDV抗体阳性血清，N2为亚洲I型FMDV抗体阳性血 清，N3为猪瘟病毒抗体阳性血清，N4为猪蓝耳病病毒抗体阳性血清，N5为猪细小病毒抗体阳 性血清，N6为猪伪狂犬病病毒抗体阳性血清，N7为猪流感病毒抗体阳性血清。
[0070] 表2对已知阳性血清样品的灵敏度试验
[0071]
[0072] (2)对已知阴性血清样品的特异性试验
[0073]使用0型FMDV液相阻断ELISA试剂盒鉴定获得120份阴性样品。使用本发明的液相 阻断ELISA试剂盒对样品进行检测。本发明的ELISA试剂盒检出阴性样品115份，有5份未检 出。结果表明本试剂盒对120份阴性样品的特异性为95.8%。
[0074] 2.6固相阻断ELISA重复性试验
[0075]使用3个不同批次的酶标板，在一块板上进行批内重复实验，在不同板上进行批间 重复试验，测定0D450值，计算变异系数。变异系数<10%，说明试剂盒重复性和稳定性好。3 个不同批次的酶标板，批内和批间检测结果一致，变异系数均<6%，说明试剂盒重复性很 好。
[0076]变异系数(C · V)计算公式：
[0077]
[0078] 三、固相阻断ELISA试剂盒的组装
[0079] 将各试剂组装成试剂盒，按表3取各组份分别进行密封，粘贴内包装标签，组装试 剂盒。
[0080] 表3试剂盒组份
[0081]
[0082]将组装好的试剂盒置于4°C保存，间隔2个月测定其敏感性和特异性，以确定试剂 盒的保存期。本发明的试剂盒4°C避光保存，保存期为6个月。
【主权项】
1. 一种用于检测0型FMDV抗体的固相阻断ELI SA试剂盒，该试剂盒中含有酶标板、洗涤 液、样品稀释液、兔抗血清、酶标二抗、底物A液、底物B液、终止液、阳性对照血清、阴性对照 血清，其中所述酶标板包被有〇型FMDV基因工程抗原。2. 根据权利要求1所述的用于检测0型FMDV抗体的固相阻断ELISA试剂盒，其中所述酶 标板包被〇型FMDV基因工程抗原的过程为:用包被缓冲液将抗原稀释，以lOOuL/孔的量加入 酶标板，4°C包被12h，用洗涤液洗涤3次;加入封闭液，200uL/孔，4°C封闭12h;甩去封闭液， 洗板3次，置于37°C干燥，用铝箱真空密封。3. 根据权利要求2所述的用于检测0型FMDV抗体的固相阻断ELI SA试剂盒，所述包被缓 冲液为PH9.6的碳酸盐缓冲液。4. 根据权利要求2所述的用于检测0型FMDV抗体的固相阻断ELISA试剂盒，所述封闭液 为含1 〇 %胰蛋白胨的PBS缓冲液。5. 根据权利要求1所述的用于检测0型FMDV抗体的固相阻断ELISA试剂盒，所述酶标二 抗采用HRP标记的羊抗兔I gG抗体。6. 根据权利要求1所述的用于检测0型FMDV抗体的固相阻断ELISA试剂盒，其中所述兔 抗血清是由〇型FMDV基因工程抗原免疫兔子制备，其与包被抗原具有很高的结合活性。
【专利摘要】一种用于检测O型FMDV抗体的固相阻断ELISA试剂盒，该试剂盒中含有酶标板、洗涤液、样品稀释液、兔抗血清、酶标二抗、底物A液、底物B液、终止液、阳性对照血清、阴性对照血清，其中所述酶标板包被有O型FMDV基因工程抗原。本发明试剂盒使用固相阻断法，与传统间接ELISA试剂盒比，降低了非特异性抗体干扰，检测结果更准确，且不区分样品宿主来源。本发明试剂盒使用基因工程技术制备的蛋白和血清多抗进行试剂盒生产，简单安全，成本低，可广泛应用于O型FMD疫苗免疫效果监测与疫情监测。
【IPC分类】G01N33/569
【公开号】CN105675866
【申请号】CN201610212417
【发明人】张 杰, 王盼, 苗银萍, 王军, 鲁龙, 任宝红, 余清卫, 赵林萍
【申请人】郑州中道生物技术有限公司
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年4月7日