家用智能检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及妇科生殖炎症检测技术，具体为一种可在家中使用的，常见妇科感染病源小型化自动分析诊断设备。本试剂盒可鉴别诊断出生殖道感染的三种常见病原体:支原体，淋病奈瑟氏菌、白色念球菌。
【背景技术】
[0002]生殖炎症是最常见的女性生殖器官炎症，为妇科门诊常见的疾病。各个年龄阶段都可发病。
[0003]主要由支原体，细菌、霉菌等所引起。正常健康妇女，由于解剖学及生物化学特点，阴道对病原体的侵入有自然防御功能；当阴道的自然防御功能遭到破坏，则病原体易于侵入，导致炎症如不即使治疗会近一步造成身体伤害。
[0004]感染生殖道病原体主要分为细菌、霉菌、支原体、病毒四大类。则目前治疗药物有中药、化药、抗生素等。
[0005]不同的病原体引起的感染需要对症药物治疗，才可以有效杀灭病原菌，保护生殖系统的生理环境，如长期滥用药物则会使病原体易产生耐药性，造成久治不愈甚至更加严重的后果。
[0006]鉴于妇科感染的常发性与病患的隐私性因此，需要开发出一种适合家用的操作简便、高便携性、无需要采血，高度智能化的鉴别诊断设备来指导用药。
【发明内容】
[0007]本发明解决的技术问题是:提供一种家用智能检测试剂盒，是一种小型化家用智能检测设备，可在短时间内诊断出患者所感染病原体。
[0008]本发明的技术方案是:家用智能检测试剂盒，是由电子读取分析部分与单克隆抗体检测试剂两大部分构成，所述电子读取分析部分包括单片机系统、光电检测系统、电池、开关K、液晶显示器、复合金标检测探针和试纸;所述复合金标检测探针、电池、开关K、单片机系统密封在机壳内，液晶显示器安装于机壳窗口处;所述单克隆抗体检测试剂包括特异性识别生殖道支原体的单克隆抗体、淋病奈瑟氏菌单克隆抗体、白色念球菌单克隆抗体、羊抗鼠IgG抗体、复合金标检测探针；
[0009]所述试纸包括金标垫、硝酸纤维素膜、样品垫、吸水垫；
[0010]所述复合金标检测探针包被在金标垫上，所述复合金标检测探针是由胶体金标记的特异性识别生殖道支原体的单克隆抗体、淋病奈瑟氏菌单克隆抗体、白色念球菌单克隆抗体的复合胶体金-抗体结合物；
[0011]所述硝酸纤维素膜上设有检测线1、检测线2、检测线3和对照线4，所述检测线I上包被特异性识别生殖道支原体的单克隆抗体，所述检测线2上包被淋病奈瑟氏菌单克隆抗体，所述检测线3上包被淋白色念球菌单克隆抗体，所述对照线4上包被羊抗鼠IgG抗体；
[0012]进一步地，在上述方案中，所述复合金标检测探针的制备方法为:
[0013](I)单克隆抗体的制备:分别用人型支原体和解尿支原体作免疫原产生腹水型支原体单克隆抗体，用淋病奈瑟氏菌作免疫原产生淋病奈瑟氏菌单克隆抗体，用白色念珠菌作免疫原产生白色念球菌单克隆抗体；
[0014](2)胶体金的制备:先将10mL的0.01%HAuC14溶液加热至沸腾，一次性迅速加入1.4mL的I %柠檬酸三钠水溶液，继续加热至溶液由淡黄色转变为蓝黑色最终变为酒红色，颜色稳定后继续加热5min，室温冷却，加三蒸水定容至10mL，即得到胶体金溶液;制备的胶体金溶液用透射电镜镜检，确保胶体金颗粒大小一致、均匀，否则重新制备；
[0015](3)复合金标检测探针的制备:用0.1moVLK2CO3调节上述胶体金溶液的pH为9.0，向10mL胶体金溶液中缓慢加入1.2?3.0mg/ml特异性识别生殖道支原体的单克隆抗体、I.2?3.0mg/ml淋病奈瑟氏菌单克隆抗体、1.2?3.0mg/ml白色念球菌单克隆抗体，磁力搅拌器缓慢搅拌Ih使其结合，加牛血清白蛋白(BSA)作为稳定剂，使得终浓度为I %，2000?4000r/min离心6?10分钟，弃上清液，沉淀用PH5?7檬酸磷酸盐缓冲液稀释至50m，制成抗体金；取抗体金I?20ml加PH5?7檬酸磷酸盐缓冲液稀释到30?60ml，加入微孔板中，-40?-60 V冻干，制成复合胶体金-抗体结合物，即为复合金标检测探针。
[0016]进一步地，在上述方案中，所述试纸的制备方法为:
[0017](I)硝酸纤维素膜上检测线的制备:将特异性识别生殖道支原体的单克隆抗体、淋病奈瑟氏菌单克隆抗体、白色念球菌单克隆抗体分别以0.1?3mg/ml的浓度在硝酸纤维素膜上按从左至右的顺序划线，分别为检测线1、检测线2和检测线3，相邻两膜线间的距离为5?6mm，粗细均匀，喷完检测好的膜需立即放入30?40 °C烘干10?12小时；
[00?8] (2)硝酸纤维素膜上质控线的制备:将羊抗鼠IgG抗体按0.1?lmg/ml的浓度在硝酸纤维素膜上划线，该膜线为质控线，位于检测线3的右侧，距离检测线3的距离为5?6mm，粗细均匀，喷完检测好的膜需立即放入30?45°C的烘干10?12小时；
[0019](3)金标垫的制备:用复合金标检测探针溶液喷涂经预处理的金标垫，制得包含复合胶体金-抗体结合物的金标垫;将金标垫在20?40 °C下干燥0.5?I小时；
[0020](4)将吸水垫粘贴在所述纤维素膜的远离检测线的一端，将金标垫粘贴在纤维素膜的靠近检测线的一端，将样品垫粘贴于金标垫上与所述纤维素膜相对的一端，即制成试纸。
[0021]进一步地，在上述方案中，所述的一种家用智能检测试剂盒的检测方法为:
[0022](I)取样:使用专用阴道棉拭子完成阴道分泌物取样后，混合稀释液后加注于智能检测试剂盒；
[0023](2)拔出隔片，合闭开关K，接通电池回路，通过液晶显示器显示电源接通;开关K由可插拔隔片把电池回路断开，平时不使用时减少电池待机损耗；
[0024](3)将样本加入加注口，当单片机系统检测到复合金标检测探针碰到试剂后，自动唤醒单片机程序，程序点亮发光二极管，发光二极管的光经试纸反射到光电检测系统，光电检测系统把光转换成相应的电信号送给单片机，单片机通过内部程序对数据进行分析比较，得出测试结果，然后显示到液晶显示器屏幕上。
[0025]进一步地，当接通电池电源，将样本加入加注口，单片机接收到需要测试的指令，开始工作。当检测到检测指令，延时片刻，首先自检本仪器内的检测试纸是否有效？当试纸有效后，按设定程序逐条检测试纸标定检测条。如发生变化即按不同变化，得出各自的检验结果。最终显示在显示器屏幕上。当测试到试纸无效后直接跳过检测环节，显示本测试仪无效。
[0026]本发明的有益效果是:本发明家用智能检测试剂盒的是基于单克隆抗体技术，直接检测感染病原体，具有特异性强、无需采血、早期诊断、速度快捷等诸多优点，由于采用单片机组成的自动检测功能，免除人为因素的干扰，直观的显示检测结果，为自动检测开辟了一个新的途径。另外，本发明操作简便、结果直观，体积小，成本低，携带方便。
【附图说明】
?0027]图1是本发明硬件构成示意图；
[0028]图2是本发明软件构成示意图；
【具体实施方式】
[0029]实施例1:
[0030]1、腹水型支原体单克隆抗体的制备
[0031]菌种:人型支原体、解尿支原体由美国ATCC公司提供，以上菌株用作免疫原产生单克隆抗体。
[0032]细胞株:SP20小鼠骨髓瘤细胞株由第四军医大学细胞工程研究中心提供，作细胞融合用。
[0033]方法:
[0034]免疫原支原体菌株的制备和灭活:分别将人型支原体、解尿支原体液体培养基Iml加到人型支原体、解尿支原体标准菌株冻干粉中，溶解后，分别用移液器吸取支原体菌液分别加到10瓶肺炎支原体液体培养基、10瓶人型支原体液体培养基、10瓶解尿支原体液体培养基，每瓶分别加ΙΟΟμΙ，经培养成阳性反应后，每种将9瓶置一 25 °0冰箱作种子保存，一瓶用作二级扩增培养，每瓶扩增成10瓶，呈阳性反应后收获，于4°C冰箱保存，以备用作免疫原菌液。
[0035 ] Ba I b/C小鼠的免疫:8周龄的Ba I b/C小鼠20只，分成2组，每组1只，将种作免疫原的支原体菌株的浓度调到105/ml，置50°C恒温箱30分钟灭活，和等量完全佐剂混合后，以每只0.2ml的量，腹腔注射分别免疫Balb/C小鼠。于第一次免疫后第7、14、28天分别追加免疫一次，第31天取脾细胞进行细胞融合。
[0036]细胞融合:
[0037](I)免疫脾细胞的制备:
[0038]①取免疫小鼠脾脏，放入盛有5ml不完全培养液的平皿中，置于200目的不锈钢网上。用注射器内芯研磨脾脏，并用平皿内不完全培养液轻轻洗钢网，使脾细胞全部通过网孔挤压到溶液中。
[0039]②将脾细胞悬液转入50ml离心管中，加不完全培养液到30ml，混匀后，经100rpm离心5分钟，弃去上清。
[0040]③用不完全培养液将沉淀细胞再离心、洗涤一次(重复步骤②)，将沉淀的细胞垂悬至10ml，混匀，用细胞计数版计数。总细胞数调为I X 108。
[0041 ] (2)sp20骨髓瘤细胞悬液的制备
[0042]①将sp20骨髓瘤细胞进行扩增培养。
[0043]②将4瓶扩增培养的骨髓瘤细胞收集到50ml的离心管内。
[0044]③100rpm离心5分钟，弃去上清。
[0045]④加入30ml不完全培养液，重复步骤③，再离心洗涤一次，然后将细胞垂悬至1ml，混勾，计数。总细胞数调为2 X 170
[0046](3)细胞融合
[0047]①分别吸取含IX 18个脾细胞悬液和2 X 17个骨髓瘤细胞悬液，加入50ml离心管中，补加不完全培养液至30ml，充分摇勾。
[0048]②100rpm离心7分钟，弃去上清。
[0049]③加50%的融合剂聚乙二醇(PEG)0.7ml。
[0050]④加入25ml不完全培养液，使PEG稀释而失去促融作用。
[0051 ] ⑤800rpm离心7分钟，弃去上清。
[0052]⑥加入20ml含次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶的选择性培养液(HAT培养液)，轻轻吹吸沉淀细胞，使其垂悬并混匀。
[0053]⑦将细胞悬液加入辅有饲养细胞的96孔培养板中，每孔0.1ml，在37°C含5%⑶2的孵箱中培养。
[0054](4)抗体阳性孔检测一间接ELI SA法
[0055]①用已知支原体抗原菌液包被
[0056]②加有克隆生长的孔中的培养上清ΙΟΟμΙ。
[0057]③加酶标抗鼠IgG抗体ΙΟΟμΙ。
[0058]④加底物液ΙΟΟμΙ，室温避光显色10分钟。
[0059]⑤判定结果:在酶联免疫检测仪492波长下测定OD值，空白对照调零。若待测控OD值大于或等于阴性对照孔OD值2.1倍，则可判定为阳性孔，孔内生长有阳性克隆。
[0060](5)克隆化一有限稀释法
[0061 ]将96孔板中培养上清被检测为抗体阳性的孔标记出来。用加样器将孔内的杂交瘤细胞反复吹打均匀后计数，然后用有限稀释法进行逐级稀释，再加到96孔板进行培养。观察克隆生长，记录单克隆孔，并及时进行阳性检测。将阳性克隆的细胞转到24孔板培养，待其增殖到一定数量后再转入细胞瓶中扩大培养。
[0062](6)杂交瘤细胞的冻存
[0063]将呈对数生长的杂交瘤细胞收集于离心管，100rpm离心10分钟，弃去上清，加入Iml冻存液混匀，然后加到冻存管，在一 70°C低温冰箱过夜后转入液氮罐长期保存。
[0064](7)腹水型单克隆抗体制备
[0065]将冻存的杂交