检测水貂、狐狸、貉犬瘟热病毒阻断elisa抗体的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种检测水貂、狐狸、貉犬瘟热病毒阻断ELISA抗体的试剂盒，其特征在于：包括ELISA板条、阻断抗体、酶标抗体、底物显色液、终止液、阳性对照、阴性对照，ELISA包被抗原；其中所述的ELISA包被抗原采用保藏号为CGMCCNO.4858犬瘟热病毒；通过酶联免疫技术研制一种检测犬瘟热病毒抗体的阻断ELISA试剂盒，其是一种准确、快速、安全性好、能够进行大量筛查犬瘟热病毒抗体检测的方法。
【专利说明】检测水貂、狐狸、貉犬瘟热病毒阻断ELISA抗体的试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种检测水貂、狐狸、貉犬瘟热病毒(CDV)抗体检测试剂盒，具体而言，本发明特别是涉及一种动物检疫中检测抗体的ELISA试剂盒及其用途，是一种检测水貂、狐、貉犬瘟热病毒阻断ELISA方法，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]犬痕热病毒(Canine distemper virus, CDV)属于副粘病毒科(Paramyxoviridae),副粘病毒亚科(Paramyxovirinae),麻疫病毒属(Morbillivirus),由该病毒感染引起的犬痕热(Canine distemper,⑶)是一种急性、高度接触性传染病,可引起大批犬、狐、貉和貂等易感动物发病，死亡率30-80%，雪貂高达100%。构成CDV病毒粒子囊膜主要成分的血凝蛋白(H蛋白)，为机体抗感染免疫针对的主要靶蛋白，由其诱导机体产生的中和抗体在抗CDV感染的机制中发挥重要作用。目前，世界各国家检测⑶V抗体多采用血清中和试验(serum neutralization, SN),和间接酶联免疫吸附试验(Enzyme-LinkedImmunosorbent Assay, ELISA)。血清中和试验需要时间长,一般需要3_4天,不适合大规模血清学调查；而间接酶联免疫吸附试验，对动物种属有着严格的要求，不适合多种属兽群的检测。阻断ELISA检测方法不仅能够继承ELISA方法快速，大容量检测的优点，而且没有检测动物种属的限制，特别适应检测水貂、狐狸、貉等毛皮动物犬瘟热病毒血清。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种检测水貂、狐狸、貉犬瘟热病毒阻断ELISA抗体的试剂盒，是以原核表达的重组蛋白为阻断抗体，通过酶联免疫技术研制一种检测犬瘟热病毒抗体的阻断ELISA试剂盒，其是一种准确、快速、安全性好、能够进行大量筛查犬瘟热病毒抗体检测的方法。
[0004]为了解决上述技术问题，本发明的技术方案是这样实现的:一种检测水貂、狐狸、貉犬瘟热病毒阻断ELISA抗体的试剂盒，其特征在于:包括ELISA板条、阻断抗体、酶标抗体、底物显色液、终止液、阳性对照、阴性对照，ELISA包被抗原；其中所述的ELISA包被抗原采用保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日期:2011年5月16日，保藏编号为CGMCC N0.4858，分类命名:犬瘟热病毒；
所述的ELISA板条:每个试剂盒装有I块，每块ELISA板条为能自行拆卸的已包被抗原的ELISA微孔板，包被抗原为保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日期:2011年5月16日，保藏编号为CGMCC N0.4858，分类命名:犬瘟热病毒；
所述的特异阻断抗体:由重组犬瘟热病毒囊膜抗原免疫新西兰大白兔所得血清纯化而来，20ml ；
所述的酶标抗体:辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG，20ml ；所述的显示液，即用型TMB显色液，20ml ；
所述的洗涤液为20倍浓缩，使用时稀释成I倍工作浓度即可；
所述的阴性和阳性对照，为犬瘟热抗体阳性血清和阴性血清；
所述的阻断ELISA试剂盒在检测水貂犬瘟热病毒抗体中的应用。
[0005]一种检测水貂、狐狸、貉犬瘟热病毒阻断ELISA抗体的试剂盒的制备方法，其特征在于具体步骤如下:将保藏号为CGMCC N0.4858犬瘟热病毒以碳酸盐缓冲液(pH9.6，0.05mol/L)稀释后，IOOPL/孔，4°C包被过夜，PBST洗板机洗涤3次；用2% BSA封闭，200μ?7孔，37°C封闭2h，PBST洗板机洗涤3次；将待检水貂血清用PBST稀释后，50μ?7孔，37°C孵育30min ;将兔抗犬瘟热H血清按工作浓度稀释后，50μ?7孔，37°C孵育lh，PBST洗板机洗涤3次；羊抗兔酶标抗体经PBST稀释后，ΙΟΟμ?/孔，37°C孵育lh，PBST洗板机洗涤3次；最后加TMB显色液，IOOPL/孔，室温作用10 min ；2M浓硫酸终止显色，50ul/孔，测定D450nm值，计算抑制率。
[0006]本发明的积极效果是:建立一种准确、快速、安全性好、能够进行大量筛查犬瘟热病毒抗体检测的方法，并且该试剂盒所用包被抗原为犬瘟热病毒，能够大量、稳定生产，为动物检验检疫部门提供了一套实用性强、效果可靠的诊断试剂盒产品。
【专利附图】
【附图说明】
[0007]图1犬痕热病毒系统发育树及⑶V-PS所属亚型。
[0008]图2犬瘟热病毒重组囊膜蛋白SDS-PAGE图。
【具体实施方式】
.[0009]下面结合附图和实施例对本发明做进一步的描述:如图1、2所示，本发明的技术方案是通过以下步骤实现的:
1、犬瘟热病毒CDV-PS株(CGMCC N0.4858)介绍
病毒的分离如下:取发病动物的内脏器官加入灭菌生理盐水研磨成匀浆，反复冻融3次，8000转/分钟(rPm)离心10分钟，弃去上层脂肪，吸取中间的液体，加入青霉素和链霉素4°C处理I小时后，再次8000转/分钟离心10分钟，取上清接种长满单层的Vero细胞，
0.2ml/孔，置37度CO2培养箱中培养72小时，每天观察两次，弃除24小时内的污染细胞。
[0010]病毒的鉴定方法如下:
培养孔中显示出明显的犬瘟热细胞病变为疑似犬瘟热病毒分离株，将其进行特异性RT-PCR检测，在琼脂糖凝胶电泳中显示特异条带，则确定为犬瘟热病毒，并命名为CDV-PS株。
[0011]Q)V_PS株的分子特征:
提取CDV-PS株RNA，反转录成为CDNA并进行其H基因的序列测定，测定结果显示CDV-PS株与其他犬瘟热病毒H基因核酸相似率达到98%以上，构建系统发育树证实其位于我国主要的犬瘟热病毒流行基因群Asis-1 (如图1)，具有较好的抗原性。
[0012]2、竞争抗体制备过程
从犬瘟热野毒株⑶V-PS株提取总RNA，经RT-PCR扩增得到388 bp的基因片段，将目的基因与原核表达载体pET28a(+)连接构建了 pET28a-⑶V-H5重组质粒，在大肠杆菌中成功的表达，经N1-NTA洗脱纯化后，r⑶V-H5蛋白被成功纯化(见图2)。
[0013]将重组蛋白免疫新西兰大白兔,2个月内免疫3次后采血30_50ml，使用蛋白A/G纯化总抗体后，最终获得竞争抗体2mg。
[0014]3、阻断ELISA的操作过程
将保藏号为CGMCC N0.4858犬瘟热病毒以碳酸盐缓冲液(pH9.6，0.05 mol/L)稀释后，ΙΟΟμ?ν孔，4°C包被过夜，PBST洗板机洗涤3次；用2% BSA封闭，200μ?7孔，37°C封闭2h，PBST洗板机洗涤3次；将待检水貂血清用PBST稀释后，50μ?7孔，37°C孵育30min ;将兔抗犬瘟热H血清按工作浓度稀释后，50μ?7孔，37°C孵育lh，PBST洗板机洗涤3次；羊抗兔酶标抗体经PBST稀释后，ΙΟΟμ?/孔，37°C孵育lh，PBST洗板机洗涤3次；最后加TMB显色液，IOOPL/孔，室温作用10 min ；2M浓硫酸终止显色，50ul/孔，测定D450nm值，计算抑制率。每次均设⑶V阳性血清对照(未阻断)。
[0015]4、判断结果确定
抑制率(%)=(阻断抗体D450 nm -样本D450 nm) /阻断抗体D450 nm *100%
用已经优化好的间接阻断ELISA反应条件，对水貂10份CDV未疫苗免疫血清样本进行检测。根据公式计算临界值，临界值=阴性样品平均抑制率+2倍标准偏差。
[0016]对未免疫血清样本的检测结果显示，水貂的平均抑制率为29%，标准偏差为4%。根据临界值公式计算出水貂阻断ELISA抗体的临界值为37%。
[0017]实施例1
犬瘟热病毒抗体的阻断ELISA试剂盒最佳使用条件的确定
1、抗原包被浓度和阻断抗体稀释度的确定
犬瘟热病毒以38.4mg/L包被，阻断抗体做1:100、1:200、1:400、1:800稀释，进行间接ELISA，结果表明，确定的抗原工作浓度为9.6mg/L，阻断抗体的稀释度为1:400(见表I)。
【权利要求】
1.一种检测水貂、狐狸、貉犬瘟热病毒阻断ELISA抗体的试剂盒，其特征在于:包括ELISA板条、阻断抗体、酶标抗体、底物显色液、终止液、阳性对照、阴性对照，ELISA包被抗原；其中所述的ELISA包被抗原采用保藏号为CGMCCN0.4858犬瘟热病毒； 所述的ELISA板条:每个试剂盒装有I块ELISA微孔板，每块ELISA板条为能自行拆卸已包被抗原的ELISA微孔板，包被抗原为由保藏号为CGMCC N0.4858犬瘟热病毒⑶V-PS株; 所述的特异阻断抗体:由重组犬瘟热病毒囊膜抗原免疫新西兰大白兔所得血清纯化而来，20ml ； 所述的酶标抗体:辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG，20ml ； 所述的显示液，即用型TMB显色液，20ml ； 所述的洗涤液为20倍浓缩，使用时稀释即可； 阴性和阳性对照，为犬瘟热抗体阳性血清和阴性血清。
2.根据权利要求1所述的一种检测水貂、狐狸、貉犬瘟热病毒阻断ELISA抗体的试剂盒的制备方法，其特征在于具体步骤如下:将保藏号为CGMCC N0.4858犬瘟热病毒以碳酸盐缓冲液(pH9.6,0.05 mol/L)稀释后，100μ?7孔，4°C包被过夜，PBST洗板机洗涤3次；用2% BSA封闭，200μ?7孔，37°C封闭2h，PBST洗板机洗涤3次；将待检水貂血清用PBST稀释后，50μ?7孔，37°C孵育30min ;将兔抗犬瘟热H血清按工作浓度稀释后，50μ?7孔，37°C孵育Ih，PBST洗板机洗涤3次；羊抗兔酶标抗体经PBST稀释后，ΙΟΟμ?/孔，37°C孵育Ih，PBST洗板机洗涤3次；最后加TMB显色液，ΙΟΟμ?ν孔，室温作用10 min ;2M浓硫酸终止显色，50ul/孔，测定D450nm值，计算抑.制率。
【文档编号】G01N33/569GK103439498SQ201310381302
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年8月29日 优先权日:2013年8月29日
【发明者】易立, 程世鹏 申请人:中国农业科学院特产研究所