一种水样中镉离子污染阻断elisa检测法
【专利摘要】本发明属于免疫学检测【技术领域】，主要涉及水样中重金属镉离子污染的免疫学定量检测，具体涉及一种水样中镉离子污染阻断ELISA检测法，将水样中的Cd2+与过量EDTA鳌合形成Cd2+-EDTA鳌合物；水样中的Cd2+-EDTA鳌合物与已经包被在酶标板上的Cd2+-ITCBE-OVA竞争Cd2+-EDTA单克隆抗体的抗原结合位点，添加HRP标记的羊抗鼠IgG和底物显色液，终止显色后，酶标仪读取A450nm值，与标准曲线对照，即可得出水样中Cd2+浓度，待检水样处理方法简单，检测过程不需大型仪器设备，操作简便、快速、样品检测量大、时效性强、检测成本低、便于推广；检测结果准确性高、重复性好，检测范围为5.0～512μg/L。
【专利说明】-种水样中镉离子污染阻断ELISA检测法
【技术领域】
[0001] 本发明属于免疫学检测【技术领域】，主要涉及水样中重金属镉离子污染的免疫学定 量检测，具体涉及一种水样中镉离子污染阻断ELISA检测法。
【背景技术】
[0002] 随着工业的发展，重金属镉（cadmium, Cd)已成为环境污染的公害之一。环境中 Cd主要以离子形式（Cd2+)存在，对人体具有肾脏、骨骼、肺脏、心血管等毒性作用和致癌、致 畸、致突变等危害作用。因此，Cd 2+污染的检测技术成为国内外学者的研究热点之一。
[0003] 目前Cd2+污染的检测主要有传统的理化检测和免疫学检测两种类型的方法。理化 检测是目前Cd 2+污染检测的主要方法，灵敏度高，结果准确，但由于存在需要昂贵的仪器设 备、熟练的专业人员、烦琐费时、周期长、费用高、不能现场操作、样品筛检量小等缺陷，其应 用受到了限制。Cd 2+污染免疫检测是一种新型的分析方法，是以抗原抗体的特异性反应为 基础的分析技术，与理化分析方法相比，具有省时省力、费用低廉、快速、敏感、特异、筛检量 大、便于携带、操作简便等优点，代表着今后重金属污染检测的发展趋势。
[0004] 本发明通过研制出水样中Cd2+污染快速定量检测产品，旨在建立方便、快捷、有效 的环境水样Cd 2+污染监督检测技术体系，对保障生态环境及公共卫生安全具有重要意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术中的不足而提供一种水样中镉离子污染阻断 ELISA检测法，该方法检测结果准确性高、重复性好，检测成本低。
[0006] 本发明的目的是这样实现的： 水样中Cd2+污染阻断ELISA快速定量检测法的原理是：将水样中的Cd2+与过量 EDTA鳌合形成Cd2+-EDTA鳌合物；水样中的Cd2+-EDTA鳌合物与已经包被在酶标板上的 Cd2+-ITCBE-〇VA竞争Cd2+-EDTA单克隆抗体的抗原结合位点，添加 HRP标记的羊抗鼠 IgG和 底物显色液，终止显色后，酶标仪读取义5_值，与标准曲线对照，即可得出水样中Cd2+浓度。
[0007] 本发明选用异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸（ITCBE)为双功能鳌合剂鳌合Cd2+形 成Cd 2+鳌合物半抗原，并将其耦连到牛血清蛋白（BSA)和鸡卵清蛋白（0VA)上形成 CcT-ITCBE-BSA 和 CcT-ITCBE-OVA 两种完全抗原，用 Cd2+-ITCBE-BSA 为免疫原免疫 Balb/C 小鼠，用Cd2+-ITCBE-〇VA为检测抗原，通过细胞融合技术，以间接ELISA和阻断ELISA筛选 建立抗Cd 2+-EDTA的杂交瘤细胞系，体内诱生腹水法制备Cd2+-EDTA单抗，以制备的高亲和力 配对单抗为核心试剂，研制出环境水样中Cd 2+污染阻断ELISA快速定量检测方法。本发明 的标准曲线回归方程为y = - 31. 796x + 89. 63, R2 = 0. 9902, IC5Q为17. 78μ g/L，检测范 围为 5. 0 ?512 μ g/L。
[0008] -种水样中镉离子污染阻断ELISA检测法，具体方法如下： 1)取10mL水样加入30mg EDTA钠盐，充分溶解，NaOH调节pH值为6. 0,室温反应24小 时； 2) 在酶标板上加入浓度为1. Ο μ g/mL的Cd2+-ITCBE-〇VA，每孔50 μ L，37°C温育2小时， PBST洗板3次，每次间隔3分钟； 3) 用5%猪血清封闭酶标孔，每孔250 μ L，37°C温育1小时，PBST洗板3次，每次间隔3 分钟； 4) 每孔加入50 μ L工作浓度的Cd2+-EDTA单抗，同时加入等体积的待测样品及不同浓 度的Cd2+标准品与EDTA的鳌合物，设阴性和空白对照，37°C温育15分钟，PBST洗板3次， 每次间隔3分钟； 5) 加入工作浓度的HRP标记的羊抗鼠 IgG，每孔50 μ L，37°C温育25分钟，PBST洗板3 次，每次间隔3分钟； 6) 加入TMB底物液，每孔100 μ L，室温显色5分钟； 7) 加入终止液，每孔100 μ L，酶标仪读取义5_值； 8) 结果判定：以吸光率Β/Β。为纵坐标，Β是Cd2+不同浓度时Cd2+-EDTA的小5Qnm值，Β0 是Cd 2+0浓度时Cd2+-EDTA的小5tol值，以不同标准品浓度的对数值为横坐标，在半对数坐标 纸上绘制标准曲线，进行回归分析，根据各样品的值在标准曲线上求出其对应的质量 浓度。
[0009] 基于以上所述，所述的Cd2+-ITCBE-〇VA检测抗原的制备方法如下：将20mg BSA 和OVA分别溶于lmL pH8. 0的HEPES缓冲液（10mM/L)中形成20mg/mL的载体蛋白溶液； Cd2+-ITCBE鳌合物半抗原溶液与载体蛋白溶液按1:1的比例混合并用NaOH调节pH值至 9. 0,室温摇床反应24小时，然后移入分子量为8000?14000透析袋中透析5天，形成 Cd2+-ITCBE-〇VA 检测抗原。
[0010] 基于以上所述，所述的Cd2+-EDTA单克隆抗体的制备方法为： 1) 用Cd2+-ITCBE-BSA背部、皮下、多点以50 μ g /只·0. 2 mL的剂量免疫Balb/C小鼠 5只，共免5次，每次间隔4周，最后1次免疫后10 d断尾采血分离血清； 2) 用Cd2+-ITCBE-〇VA为包被抗原包被酶标板，采用间接ELISA检测免疫小鼠抗血清效 价；将乙二胺四乙酸钠盐（EDTA)溶液与不同浓度梯度的Cd 2+标准溶液混合，调节pH值为 6. 0,室温摇床反应24小时，制成Cd2+-EDTA鳌合物溶液做为抑制剂，采用阻断ELISA试验检 测免疫小鼠抗血清的敏感性。选择抗血清效价高、并且抗血清对Cd 2+-EDTA鳌合物的50%抑 制浓度（IC5(I)低的小鼠用Cd2+-ITCBE-BSA进行尾静脉超免； 3) 无菌手术摘取超免小鼠的脾脏，制成脾细胞溶液；用分子量为1500的50%的聚乙二 醇将脾细胞与与NS0骨髓瘤细胞按10:1的比例进行细胞融合，将融合后的细胞加到含饲养 细胞的96孔细胞培养板上，每孔100 μ L，置37°C 5% C02培养箱中培养； 4) 用Cd2+-ITCBE-〇VA为包被抗原包被酶标板，以Cd2+-EDTA鳌合物溶液以及汞、铬、铅、 锌、铜、铯、钴、钥、铁与EDTA的鳌合物溶液和EDTA溶液做为抑制剂，采用间接ELISA和阻断 ELISA进行阳性杂交瘤细胞株的筛选；选择效价高、抑制效果好、特异性强、细胞生长旺盛 的孔采用有限稀释法进行克隆化；对单克隆细胞孔采用间接ELISA和阻断ELISA进行筛选， 并对阳性单克隆细胞进行扩大培养； 5) 给腹腔注射液体石蜡10 d后的小鼠腹腔注射克隆化特异性强的阳性杂交瘤细胞株 1〇7个细胞，7 d后抽取腹水，提纯后即为抗Cd2+-EDTA鳌合物腹水型单克隆抗体。
[0011] 水样中Cd2+污染阻断ELISA快速定量检测法的原理是：将水样中的Cd 2+与过量 EDTA鳌合形成Cd2+-EDTA鳌合物；水样中的Cd2+-EDTA鳌合物与已经包被在酶标板上的 Cd2+-ITCBE-〇VA竞争Cd2+-EDTA单克隆抗体的抗原结合位点，添加 HRP标记的羊抗鼠 IgG和 底物显色液，终止显色后，酶标仪读取义5_值，与标准曲线对照，即可得出水样中Cd2+浓度。
[0012] 本发明选用异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸（ITCBE)为双功能鳌合剂鳌合Cd2+形 成Cd 2+鳌合物半抗原，并将其耦连到牛血清蛋白（BSA)和鸡卵清蛋白（0VA)上形成 CcT-ITCBE-BSA 和 CcT-ITCBE-OVA 两种完全抗原，用 Cd2+-ITCBE-BSA 为免疫原免疫 Balb/C 小鼠，用Cd2+-ITCBE-〇VA为检测抗原，通过细胞融合技术，以间接ELISA和阻断ELISA筛选 建立抗Cd 2+-EDTA的杂交瘤细胞系，体内诱生腹水法制备Cd2+-EDTA单抗，以制备的高亲和力 配对单抗为核心试剂，研制出环境水样中Cd 2+污染阻断ELISA快速定量检测方法。本发明 的标准曲线回归方程为y = - 31. 796x + 89. 63, R2 = 0. 9902, IC5Q为17. 78μ g/L，检测范 围为 5. 0 ?512 μ g/L。
[0013] 待检水样处理方法简单，检测过程不需大型仪器设备，操作简便、快速、样品检测 量大、时效性强、检测成本低、便于推广；检测结果准确性高、重复性好，检测范围为5. 0? 512 μ g/L〇
【专利附图】
【附图说明】
[0014] 图1为Cd2+污染阻断ELISA法的标准曲线。
【具体实施方式】
[0015] 下面结合具体的实施例对本发明作进一步的描述。
[0016] 一种水样中镉离子污染阻断ELISA检测法，可以先进行Cd2+鳌合物完全抗原的制 备和抗Cd 2+-EDTA单克隆抗体的制备，然后在进行具体的实验。
[0017] 1) Cd2+鳌合物完全抗原的制备： 称取l〇mg ITCBE溶于lmL DMS0中形成金属鳌合剂溶液；称取4. 2mg CdCl2溶于lmL pH8. 0的HEPES缓冲液（10mM/L)中形成Cd2+溶液；将金属鳌合剂溶液和Cd2+溶液混合并 用NaOH调节pH值至7. 0,然后在室温条件下放在摇床上反应12小时，即形成Cd2+-ITCBE 鳌合物半抗原。将20mg BSA和OVA分别溶于lmL pH8. 0的HEPES缓冲液（10mM/L)中形成 20mg/mL的载体蛋白溶液；Cd2+-ITCBE鳌合物半抗原溶液与载体蛋白溶液按1:1的比例混 合并用NaOH调节pH值至9. 0,室温摇床反应24小时，然后移入分子量为8000?14000透 析袋中透析5天，即形成Cd2+-ITCBE-BSA免疫抗原和Cd 2+-ITCBE-〇VA检测抗原。
[0018] 2)抗Cd2+-EDTA单克隆抗体的制备： ①用Cd2+-ITCBE-BSA背部、皮下、多点以50 μ g八只· 0. 2 mL)的剂量免疫Balb/C小 鼠5只，共免5次，每次间隔4周，最后1次免疫后10 d断尾采血分离血清。
[0019] ②用Cd2+-ITCBE-〇VA为包被抗原包被酶标板，采用间接ELISA检测免疫小鼠抗血 清效价；将乙二胺四乙酸钠盐（EDTA)溶液与不同浓度梯度的Cd 2+标准溶液混合，调节pH值 为6. 0,室温摇床反应24小时，制成Cd2+-EDTA鳌合物溶液做为抑制剂，采用阻断ELISA试验 检测免疫小鼠抗血清的敏感性。选择抗血清效价高、并且抗血清对Cd 2+-EDTA鳌合物的50% 抑制浓度（IC5(I)低的小鼠用Cd2+-ITCBE-BSA进行尾静脉超免。
[0020] ③无菌手术摘取超免小鼠的脾脏，制成脾细胞溶液；用分子量为1500的50%的聚 乙二醇（PEG)将脾细胞与与NSO骨髓瘤细胞按10:1的比例进行细胞融合，将融合后的细胞 加到含饲养细胞的96孔细胞培养板上，每孔100 μ L，置37°C 5% C02培养箱中培养。
[0021] ④用Cd2+-ITCBE-〇VA为包被抗原包被酶标板，以Cd2+-EDTA鳌合物溶液以及汞、铬、 铅、锌、铜、铯、钴、钥、铁与EDTA的鳌合物溶液和EDTA溶液做为抑制剂，采用间接ELISA和 阻断ELISA进行阳性杂交瘤细胞株的筛选；选择效价高、抑制效果好、特异性强、细胞生长 旺盛的孔采用有限稀释法进行克隆化；对单克隆细胞孔采用间接ELISA和阻断ELISA进行 筛选，并对阳性单克隆细胞进行扩大培养。
[0022] ⑤给腹腔注射液体石蜡10 d后的小鼠腹腔注射克隆化特异性强的阳性杂交瘤细 胞株107个细胞，7 d后抽取腹水，提纯后即为抗Cd2+-EDTA鳌合物腹水型单克隆抗体。
[0023] 3)水样Cd2+污染阻断ELISA检测法的建立 ①将 CcT-ITCBE-OVA 稀释成 0· 4、0· 6、0· 8、1. 0、1. 2、1. 4、1. 6、1. 8、2· 0 μ g/mL 包被 96 孔酶标板，将 CcT-EDTA mAb 稀释成 1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、 1:12800、1:25600的稀释梯度，采用方阵滴定法，间接ELISA检测，确定Cd 2+-ITCBE-〇VA的 工作浓度为1. 〇 μ g/mL，Cd2+-EDTA mAb的工作浓度为1:12800。将商品化生产的HRP标记 的羊抗鼠 IgG以1:1000的浓度做为工作浓度。
[0024] ②在 0、2、4、8、16、32、64、128、256、512μ g/L 的 Cd2+溶液里面加入过量的 EDTA， 调节pH至6. 0,室温摇床反应过夜，形成Cd2+-EDTA鳌合物溶液，以此溶液为阻断剂，阻断 ELISA测定Cd2+-EDTA mAb对不同浓度的Cd2+-EDTA标准溶液的抑制效价。以吸光率B/B。 (B是Cd2+不同浓度时Cd2+-EDTA的J45(lnm值，B0是Cd 2+0浓度时Cd2+-EDTA的J45Qnm值）为纵 坐标，以不同标准品浓度的对数值为横坐标，在半对数坐标纸上绘制标准曲线，进行回归分 析。曲线回归方程为 y = - 31. 796x + 89. 63, R2 = 0. 9902, IC5Q 为 17. 78μ g/L。
[0025] ③水样处理：每lOmL水样加入30mgEDTA钠盐，充分溶解，调节pH值为6. 0,室温 反应24小时。
[0026] ④水样中镉离子污染阻断ELISA检测法： 第一步，在酶标板上加入浓度为1. 〇 μ g/mL的Cd2+-ITCBE-〇VA，每孔50 μ L，37°C温育2 小时，PBST洗板3次，每次间隔3分钟； 第二步，用5%猪血清封闭酶标孔，每孔250 μ L，37°C温育1小时，PBST洗板3次，每次 间隔3分钟； 第三步，每孔加入50 μ L工作浓度的Cd2+-EDTA单抗，同时加入等体积的待测样品及不 同浓度的Cd2+标准品与EDTA的鳌合物，设阴性和空白对照，37°C温育15分钟，PBST洗板3 次，每次间隔3分钟； 第四步，加入工作浓度的HRP标记的羊抗鼠 IgG，每孔50 μ L，37°C温育25分钟，PBST洗 板3次，每次间隔3分钟； 第五步，加入TMB底物液，每孔100 μ L，室温显色5分钟； 第六步，加入终止液，每孔100 μ L，酶标仪读取小5(lnm值。
[0027] 第七步，结果判定，根据各样品的抑制百分率B/^值在标准曲线上求出其对应的 质量浓度，如图1所示，其中y=_31. 796χ+89· 63, R2=0. 9902。
[0028] 4)检测方法的准确性及重复性验证 将Cd2+标准品以终浓度分别为5、10、20、40 μ g/L添加到自来水、蒸馏水中，用建立的 阻断ELISA检测Cd2+浓度，每个样品设6个重复孔。检测结果显示，自来水样的回收率在 (90. 7%±14. 1%)-(100. 3%±13. 2%)之间，平均 95. 5%，变异系数在 10. 2%-12. 9% 之间，平均 11. 45% ;蒸馏水样的回收率在（93. 5%±13. 2%)-(106. 3%±15. 3%)之间，平均99. 2%，变异系 数在10. 7%-14. 6%之间，平均12. 75%。表明该检测方法准确性高，重复性好。
【权利要求】
1. 一种水样中镉离子污染阻断ELISA检测法，其特征在于：具体方法如下： 1) 取10mL水样加入30mg EDTA钠盐，充分溶解，NaOH调节pH值为6. 0,室温反应24小 时； 2) 在酶标板上加入浓度为1. 0 μ g/mL的Cd2+-ITCBE-〇VA，每孔50 μ L，37°C温育2小时， PBST洗板3次，每次间隔3分钟； 3) 用5%猪血清封闭酶标孔，每孔250 μ L，37°C温育1小时，PBST洗板3次，每次间隔3 分钟； 4) 每孔加入50 μ L工作浓度的Cd2+-EDTA单抗，同时加入等体积的待测样品及不同浓 度的Cd2+标准品与EDTA的鳌合物，设阴性和空白对照，37°C温育15分钟，PBST洗板3次， 每次间隔3分钟； 5) 加入工作浓度的HRP标记的羊抗鼠 IgG，每孔50 μ L，37°C温育25分钟，PBST洗板3 次，每次间隔3分钟； 6) 加入TMB底物液，每孔100 μ L，室温显色5分钟； 7) 加入终止液，每孔100 μ L，酶标仪读取义5_值； 8) 结果判定：以吸光率Β/Β。为纵坐标，Β是Cd2+不同浓度时Cd2+-EDTA的小5Qnm值，Β0 是Cd2+0浓度时Cd2+-EDTA的小5tol值，以不同标准品浓度的对数值为横坐标，在半对数坐标 纸上绘制标准曲线，进行回归分析，根据各样品的值在标准曲线上求出其对应的质量 浓度。
2. 根据权利要求1所述的一种水样中镉离子污染阻断ELISA检测法，其特征在于：所 述的Cd2+-ITCBE-〇VA检测抗原的制备方法如下：将20mg BSA和OVA分别溶于lmL pH8. 0的 HEPES缓冲液（10mM/L)中形成20mg/mL的载体蛋白溶液；Cd2+-ITCBE鳌合物半抗原溶液 与载体蛋白溶液按1:1的比例混合并用NaOH调节pH值至9. 0,室温摇床反应24小时，然后 移入分子量为8000?14000透析袋中透析5天，形成Cd2+-ITCBE-〇VA检测抗原。
3. 根据权利要求1所述的一种水样中镉离子污染阻断ELISA检测法，其特征在于：所 述的Cd2+-EDTA单克隆抗体的制备方法为： 1) 用Cd2+-ITCBE-BSA背部、皮下、多点以50 μ g /只·0. 2 mL的剂量免疫Balb/C小鼠 5只，共免5次，每次间隔4周，最后1次免疫后10 d断尾采血分离血清； 2) 用Cd2+-ITCBE-〇VA为包被抗原包被酶标板，采用间接ELISA检测免疫小鼠抗血清效 价；将乙二胺四乙酸钠盐（EDTA)溶液与不同浓度梯度的Cd 2+标准溶液混合，调节pH值为 6. 0,室温摇床反应24小时，制成Cd2+-EDTA鳌合物溶液做为抑制剂，采用阻断ELISA试验检 测免疫小鼠抗血清的敏感性； 选择抗血清效价高、并且抗血清对Cd2+-EDTA鳌合物的50%抑制浓度（IC5(I)低的小鼠用 Cd2+-ITCBE-BSA进行尾静脉超免； 3) 无菌手术摘取超免小鼠的脾脏，制成脾细胞溶液；用分子量为1500的50%的聚乙二 醇将脾细胞与与NS0骨髓瘤细胞按10:1的比例进行细胞融合，将融合后的细胞加到含饲养 细胞的96孔细胞培养板上，每孔100 μ L，置37°C 5% C02培养箱中培养； 4) 用Cd2+-ITCBE-〇VA为包被抗原包被酶标板，以Cd2+-EDTA鳌合物溶液以及汞、铬、铅、 锌、铜、铯、钴、钥、铁与EDTA的鳌合物溶液和EDTA溶液做为抑制剂，采用间接ELISA和阻断 ELISA进行阳性杂交瘤细胞株的筛选；选择效价高、抑制效果好、特异性强、细胞生长旺盛 的孔采用有限稀释法进行克隆化；对单克隆细胞孔采用间接ELISA和阻断ELISA进行筛选， 并对阳性单克隆细胞进行扩大培养； 5)给腹腔注射液体石蜡10 d后的小鼠腹腔注射克隆化特异性强的阳性杂交瘤细胞株 1〇7个细胞，7 d后抽取腹水，提纯后即为抗Cd2+-EDTA鳌合物腹水型单克隆抗体。
【文档编号】G01N33/18GK104155424SQ201410407856
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月19日 优先权日:2014年8月19日
【发明者】李生涛, 刘耀东, 丁文敏, 齐子鑫, 王新炎 申请人:河南华牧生物科技有限公司