缓冲液，以及pH值为7.4的PBS缓冲液，并且配置pH值为5.0的 MES缓冲液，过滤除菌处理，4 °C存放。
[0041 ]实施例1 HER2-寡核苷酸探针 [0042] (1)寡核苷酸探针的醛基修饰
[0043] 将150腦〇1的01丨8〇1(寡核苷酸）用0.謂的？!17.4的磷酸缓冲液配置成溶液。称取 1500nmo 1的SFB(4-甲酰苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯），用无水DMF(N，N-二甲基甲酰胺)溶解后， 在室温反应2.5h，过柱纯化得到01ig〇-FB(醛基修饰的寡核苷酸）。
[0044] 检测Oligo-FB的浓度：用Nanodrop分光光度计检测A26Q的值，计算Oligo-FB的浓度 为2 · 6nmol/iiL〇
[0045]检测醛基修饰率：用定量的2-肼吡啶-2-盐酸盐溶液检测醛基修饰率。取上述 Oligo-FB加入到2-肼吡啶-2-盐酸盐溶液中，振荡混匀后于37°C反应lh，用Nanodrop检测 360nm处的吸光值为6 · 3，计算其修饰率，A36Q下的修饰率为0 · 99。
[0046] (2)抗体HER2的肼基修饰
[0047] 对抗体HER2进行脱盐纯化后用Nanodrop检测抗体蛋白浓度为4.8mg/mL。
[0048]用pH值为7.4的磷酸缓冲液稀释抗体HER2至浓度为3mg/mL。称取30倍量的SANH(抗 体与SANH的摩尔比为1:30)，溶解在无水DMF中，再加入到抗体中，使抗体与SANH的摩尔比为 1:30，在室温反应2.5h，过柱纯化得到HER2-SANH(肼基修饰的HER2)。
[0049] 检测HER2-SANH的浓度:通过BCA法计算修饰后的HER2-SANH的浓度为2.5mg/mL。 [0050]检测肼基修饰率：用定量的2-甲酰苯磺酰钠盐溶液检测肼基修饰率。取纯化后的 抗体-SANH加入到的2-甲酰苯磺酰钠盐溶液中，涡旋混匀后于37°C反应lh，Nanodrop检测 348nm处的吸光值为0.26。通过348nm处的吸光值和HER2-SANH的浓度计算出HER2-SANH的肼 基修饰率为6.8。
[0051 ] (3)01ig〇-FB 与 HER2-SANH 的偶联
[0052] 将01ig〇-FB与HER2-SANH按照摩尔比7:1混合涡旋混匀，室温反应4h，最后得到的 产物经过过柱纯化后即可得到所述通用型HER2-01 igo探针。
[0053] 取HER2-01 i go探针进行Nanodrop检测。在354nm下有明显吸收峰出现，说明01 igo-FB与HER2-SANH的偶联成功。
[0054] 取HER2-01igo探针进行SDS-PAGE检测，分析HER2与oligo偶联程度，跟纯的HER2比 较，得到多条电泳条带，说明HER2上偶联了不同数量的寡核苷酸。
[0055]取HER2-01igo探针进行BCA法浓度检测。BCA法浓度检测计算偶联物抗体的浓度。 用单链定量试剂盒定量HER2_01igo中Oligol的浓度。可以计算出HER2与Oligol的比例，并 可以和修饰率结果比较。说明了 HER2-01 i go分子中01 i go 1与抗体的偶联比，结果如表2所 不。
[0056] 表2册1?2-01丨8〇分子中01丨8〇与抗体的偶联比 [0057]
[0058]实施例201 igo分子的QPCR扩增特异性检测
[0059] 将01ig〇l-13分子稀释至浓度为25000分子数AxL、83333分子数/VL和250000分子 数AiL三个浓度。然后以01ig〇l-3为例，将01ig〇l-3在相同浓度下混合，得到混合样品A、B、 C，如表3所示。
[0060] 表3实施例2样品配方
[0061]
[0063]将上述样品按照表4配置QPCR扩增液，得到QPCR扩增试剂盒，然后按照表5所示的 程序对01ig〇l-3进行QPCR扩增，以及对混合样品A、B、C中的Oligol-3各自进行QPCR扩增，以 各自延伸扩展后的01ig〇l-3为模板，扩增结果的Ct值如表6所示。其中，延伸引物为RT-P，它 的3'端末端与寡核苷酸的3'端互补配对，5'端可以形成发卡结构，且中间序列与MGB探针 (MGty)的序列互补即可，本实施例的RT-P以序列为SEQ ID勵：14所示为例。正向引物为卩卩， 反向序列为RP。FP以序列为SEQIDN0:15所示为例，RP以序列为SEQIDN0 :16所示为例， MGty以序列为SEQ ID从)：17所示为例，5'端的荧光基团用?41标记，3'端为10。
[0064] 表401 igo分子的QPCR扩增试剂盒
[0065]
[0066] 表5QPCR扩增程序
[0067]
[0068]
[0069] 表6扩增结果Ct值
[0070]
[0071] 从表6可以看出，混合样品A、B、C中的Oligol-3,在相同浓度下扩增的Ct值与单个 Oligo的扩增Ct值相差为0.1左右。同时，根据每条Oligo的不同浓度样品绘出回归直线，可 以算得回归直线方程及相关系数R2如下：
[0072 ] 01ig〇1:y = -3.3664x+40.11，R2 = 0.99937;
[0073] 01ig〇2：y = -3.384x+40.809,R2 = 0.99997；
[0074] 01ig〇3:y = -3·3824x+38·928，R2 = 0·99463。
[0075] 将每条Oligo对应的A-C号样品根据各个方程进行计算，算得分子数除以对应理论 分子数，所得检测效率如下：
[0076]
LUU//」 凶此，干仃秤品|日Η厂増(Jt差值为? · 1ΖΞ石，粒测双卒为98 · 5 % -110 · 5 % H日」，说_ 三条Oligo分别与其余两条没有非特异性扩增，相互之间不会影响扩增效率。其余Oligo经 鉴定可以得到同样结果，说明本实验设计的多条Oligo之间无交叉影响，可以保证多重PCR 的特异性、精确性和灵敏度。其他Oligo可以得到同样的结论，由于篇幅原因不一一详细说 明。
[0078] 实施例3制作标准曲线
[0079]以01ig〇l-13可以得到同样的结果，为了简化过程，以下实施例以Oligol-4为例。 [0080] 按照实施例1的步骤，用摩尔当量为5倍的SFB对01igo2进行修饰得到01ig〇-FB，用 摩尔当量为10倍的SANH对EGFR进行肼基修饰得到EGFR-SANH，将摩尔比为10:1的01ig〇-FB 与EGFR-SANH在室温条件下反应16小时后得到EGFR-01 igo2。
[0081 ] 按照实施例1的步骤，用摩尔当量为20倍的SFB对01igo3进行修饰得到01ig〇-FB， 用摩尔当量为50倍的SANH对PD-L1进行肼基修饰得到H)-L1-SANH，将摩尔比为8:1的Oligo-FB与H)-L1-SANH在室温条件下反应24小时后得到PD-Ll-01igo3。
[0082] 按照实施例1的步骤，用摩尔当量为10倍的SFB对01igo4进行修饰得到01ig〇-FB， 用摩尔当量为30倍的SANH对VEGFR-2进行肼基修饰得到VEGFR-2-SANH，将摩尔比为7 :1的 01ig〇-FB与VEGFR-2-SANH在室温条件下反应16小时后得到VEGFR-2-01igo4。
[0083] 将 HER2-01igol、EGFR-01igo2、PD-Ll-01igo3和VEGFR-2-01igo4按照表4的配方和 表5的程序进行QPCR扩增，以延伸扩展后的Oligol-4为模板，得到的扩增结果与Oligol-4单 独扩增一致，说明偶联的抗体部分对01 igo的PCR扩增没有影响。
[0084] 用标准品稀释液将 HER2-01igol、EGFR-01igo2、ro-Ll-01igo3和VEGFR-2-01igo4 各自稀释成浓度为：833、2500、8333、25000、83333和250000分子数/2.5yL，共六个浓度，空 白对照组为去离子水。
[0085] 按照表4所示的配方配置QPCR扩增试剂盒，然后按照表5所示的程序对以上各浓度 的 HER2-01igol、EGFR-01igo2、PD-Ll-01igo3 和 VEGFR-2-01igo4 进行 QPCR 扩增，以延伸扩展 后的Oligol-4为模板，扩增结果如表7所示：
[0086] 表7标准曲线QPCR扩增结果Ct值