电化学免疫传感器及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于检测技术，特别涉及一种电化学免疫传感器及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 电化学免疫传感器（Electrochemical Immunosensor，ECIS)是一种集微生物学、 免疫学、物理学等多学科交叉的先进技术，具有灵敏度高、特异性强、检测快速方便和易实 现在线检测等优点，因此成为环境和食品安全检测等多个领域中有害微生物快速检测的研 宄热点，应用前景广阔。而以往的免疫传感器多使用石墨烯、无序的碳纳米管、介孔碳等材 料来制作电极，操作复杂易流失，性能不够好，且在电子的传输速率上有一定的限制，拉伸 强度稍欠；同时，电极与生物分子的结合也多采用物理吸附法固定，反应过程中随机导向问 题严重，特异选择性不够，且利用物理吸附法固定的生物分子与固体表面的结合不牢固，具 有易脱落、灵敏度差等缺点。因此，需要一种新型的电化学免疫传感器来解决或减少这些问 题。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种电化学免疫传感器及其制备方法，以获得具有良好生 物相容性，高导电性，高稳定性的纳米电极材料，提高灵敏度，和检测稳定性，减少检测时 间。
[0004] 本发明提供一种电化学免疫传感器，包括复合碳纳米管电极、免疫生物探针、待测 物。
[0005] 优选的，所述的复合碳纳米管为高导电率及双向的基团改性的复合碳纳米管；所 述的免疫生物探针包括电极和待结合物。
[0006] 优选的，所述的双向基团改性包括在碳纳米管电极表面基团进行的羧基化和氨基 化改性；所述的高导电率的复合碳纳米管是将碳纳米管经过Layer-by-Layer法层层组装 成致密的导电膜后制备而成。
[0007] 优选的，所述的待结合物为辣根过氧化物酶标记的具有生物活性的分子。
[0008] 本发明还提供一种电化学免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：
[0009] (1)制备碳纳米管电极：所用的羧基化碳纳米管与氨基化碳纳米管在调整pH为 2. 5-4. 5水中超声处理1-3小时，形成碳纳米管浓度为0. 5mg/ml的稳定溶液；将电极基体 先浸没于氨基化碳纳米管溶液20-60分钟，然后放入去离子水1-5分钟1-2次，反复循环此 过程，直至获得层叠的碳纳米管电极；
[0010] (2)再构筑碳纳米管表面纳米形貌：将步骤（1)中的碳纳米管电极置于浓度为 5nm-100nm或者0? 01-10mg/ml的金溶胶中，并在-0? 7至+0? 7V的电压下以电沉积方式将金 纳米颗粒固定在碳纳米管电极表面进行复合；
[0011] (3)制备免疫生物探针：用化学键共价交联法将以上步骤获得的碳纳米管电极在 浓度为500mg/mL的1-乙基3-(3-二甲氨基）碳二亚胺盐酸盐，浓度为250mg/mL的N-羟基 硫代湖泊酰亚胺，浓度为0. 01-0. lmmol/L且pH值为7. 0-7. 4的磷酸盐缓冲液中活化1到2 小时，磷酸盐缓冲液洗涤2~3次；随后将活化后的碳纳米管电极置于含有1. 0-1. 8 y g/mL 的辣根过氧化物酶标记的副溶血性弧菌抗体或单增李斯特菌抗体的磷酸盐缓冲液中反应3 小时，磷酸盐缓冲液洗涤2~3次；然后将电极放在含有0. 2 % -2 %牛血清白蛋白的磷酸盐 缓冲液封闭液中封闭1小时，洗涤2~3次，晾干后置4°C冰箱中保存备用；
[0012] (4)结合免疫生物探针与待测物：将免疫生物探针与副溶血性弧菌、单增李斯特 菌溶液在室温下孵育，缓冲液洗涤2~3次，并在待测液中加入具有氧化还原特性的硫堇后 进行待测。
[0013] 优选的，所述步骤（1)中是将已有铜电极的基板在氨基化碳管溶液和羧基化碳管 溶液中反复交替浸泡数次，获得层层自组装碳纳米管电极。
[0014] 优选的，所述步骤（2)中是将金纳米颗粒固定在碳纳米管电极表面进行复合。
[0015] 优选的，所述步骤（3)中是采用化学键共价交联法，使待固定物上的基团与电极 表面的基团进行结合，形成化学键。
[0016] 优选的，所述步骤（3)中还可在化学键共价交联法的基础上采用夹心法、竞争法、 间接法、直接法结合固定物。
[0017] 优选的，所述步骤（4)中：
[0018] 采用三电极体系以循环伏安法作为免疫电极表征和定性判定的方法，以免疫反应 前、后还原峰电流下降的比例来判断被测样品中是否含有副溶血性弧菌或单增李斯特菌抗 原；或者采用电阻型生物探针，在不同浓度下，测量不同期电阻值的变换，获得定量数据。
[0019] 本发明的有益效果在于：通过Layer-by-Layer方法，形成层层自组装的致密纳米 结构薄膜，并对薄膜进行改性，获得具有良好生物相容性，高导电性，高稳定性的纳米电极 材料，提高灵敏度，和检测稳定性，减少检测时间。使得导电率、比表面积等性能更优越，且 具有一定的柔韧性；在改性时，官能团的密度可控，给生物分子与电极表面的结合量提供了 参考。化学键共价结合法的应用克服了物理吸附法固定过程中的随机导向问题严重，特异 选择性不够，生物分子与固体表面的结合不牢固，易脱落、灵敏度差等缺点。
【附图说明】
[0020] 图1为复合碳纳米管电极的制备、生物分子固定及间接法、夹心法、竞争法三种方 法下抗体与电极表面的结合示意图；
[0021] 图2为免疫传感器的电化学表征图；
[0022] 图3为化学键共价交联法处理的传感器的稳定性测试图；
[0023] 图4为物理吸附固定法处理的传感器的稳定性测试图；
[0024] 图5为在不同pH缓冲液中免疫传感器在加入双氧水后的还原峰电流峰值的对比 图；
[0025] 图6为向测试液中加入不同浓度双氧水前后还原峰电流峰值的对比图。
【具体实施方式】
[0026] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下文中将结合实施例进行详 细说明。
[0027] 本发明提供的电化学免疫传感器，包括复合碳纳米管电极、免疫生物探针、待测 物。所述的复合碳纳米管为高导电率及双向的基团改性的复合碳纳米管；所述的免疫生物 探针包括电极和待结合物。所述的双向基团改性包括在碳纳米管电极表面基团进行的羧基 化和氨基化改性；所述的高导电率的复合碳纳米管是将碳纳米管经过Layer-by-Layer法 层层组装成致密的导电膜后制备而成。所述的待结合物为辣根过氧化物酶标记的具有生物 活性的分子。
[0028] 本发明还提供一种电化学免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：
[0029] 步骤（1)，关于碳纳米管电极的制备，所用的羧基化碳纳米管（MWNT-COOH)与氨基 化碳纳米管（MWNT-NH2)在调整pH为2. 5-4. 5水中超声处理1-3小时，形成碳纳米管浓度 为0. 5mg/ml的稳定溶液。电极基体先浸没于MWNT-NH2溶液20-60分钟，然后放入去离子 水1-5分钟1-2次，然后在放入到MWNT-C00H20-60分钟，然后放入去离子水1-5分钟1-2 次，然后浸没于MWNT-NH2溶液20-60分钟，后放入去离子水中，过程被不断反复。反复循环 此过程，获得良好层叠的layer-by-layer碳管膜电极。最终制得的碳纳米管电极如图1所 不〇
[0030] 步骤（2)，将没有固定生物分子的电极室温下在0. lmol/L、pH7. 0的含有硫堇的 PBS磷酸盐测试液中进行电化学循环伏安法测试；洗涤后采用化学键共价交联法将一定 量的酶标抗体固定在碳纳米管电极表面，洗涤后将其在测试液中进行测试，然后加入〇. 5m mol/L过氧化氢反应，测试结束后洗涤；将104cfu/mL的副溶血性弧菌、单增李斯特菌溶液 与电极室温下孵育，洗涤后测试即得到图2。
[0031] 步骤（3)，选取表观形貌相近的碳纳米管电极，室温下均置于各含有5yL的1-乙 基3-(3_二甲氨基）碳二亚胺盐酸盐（EDC)、N-羟基硫代湖泊酰亚胺（NHS)的50 y L的PBS 缓冲混合液中活化两个小时，洗涤；再把电极放置于含有一定量酶标抗体的PBS缓冲液中， 反应三个小时；洗涤后，用含有0. 2% BSA的PBS溶液封闭一小时，洗涤晾干后4°C保存待 测，得到表一中相应的数据。测试液为0. lmol/L、pH7. 0的含有硫堇的PBS磷酸盐溶液，加 入的过氧化氢浓度为0. 5mmol/L。
[0032] 步骤（4)，选取表观形貌相近的碳纳米管电极，直接将与实施例2中相同量的酶标 抗体滴涂至电极表面，室温下干燥成膜，洗涤晾干后4°C保存待测（实施例2、3中测试液 的体积及加入的过氧化氢的量均相同），测试后，得到表1中相应的数据。液为〇. lmol/L、 pH7. 0的含有硫堇的PBS磷酸盐溶液，加入的过氧化氢浓度为0. 5mmol/L。
[0033]表1
[0035]步骤（5)，采用与上述操作相同的化学键共价交联法、物理吸附法固定生物分子， 在测试液中进行循环测试，得图4。测试液为0. lmol/L、pH7. 0的含有硫堇的PBS磷酸盐溶 液。
[0036] 步骤（6)，取3个碳纳米管电极室温下分别置于有等量的EDC、NHS混合的PBS缓冲 混合液中活化两个小时，洗涤；再把电极分别放置于含有4. 5 y L、13. 5 y L、22. 5 y L(浓度 均为1. 1 U g/mL)酶标抗体的PBS缓冲液中，反应三个小时，洗涤；用含有0. 2% BSA的PBS 溶液封闭，洗涤晾干后4°C过夜。待加入0. 5mmol/L过氧化氢测试后，用102cfu/mL的菌液 37°C孵育半小时，测试，得到表二中的数据。测试液为0. lmol/L、pH7. 0的含有硫堇的PBS 磷酸盐溶液。
[0037] 步骤