一种三维生物表面及其制备方法和一种三维生物芯片及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物芯片领域，尤其涉及一种三维生物表面及其制备方法和一种三维 生物芯片及其用途。
【背景技术】
[0002] 在生物分析领域，利用仪器分析（比如表面等离子基元共振，石英晶体微天平，酶 联免疫吸附法等）研宄生物大分子与靶标蛋白间的相互作用，需要将生物大分子（指抗原， 蛋白等）固定到不同材质的基底上（比如纳米金膜、载玻片、娃片、磁珠、琼脂糖小球等）， 制备成生物芯片进行生化检测。但是生物大分子的直接固定会使其发生变性，进而造成失 活。通常情况下，都是利用1个链霉亲和素分子可与4个生物素分子（biotin)特异性结合 的性能，先将生物大分子生物素化，然后通过链霉亲和素-生物素的相互作用，将生物大分 子特异性地固定在SA基底上。得益于链霉亲和素在多种基底（磁珠、纳米金膜、琼脂糖小 球，聚苯乙烯酶标板等）上所具有的优良吸附能力，通过这种表面，生物大分子能够被普适 地间接固定在各种基底上。
[0003] 近十年来，链霉亲和素包被的各种基底（比如链霉亲和素包被的纳米金膜、载玻 片、硅片、磁珠、琼脂糖小球等）均已发展得十分商业化，制备操作简单，便捷，并且具有广 泛的应用前景。比如，链霉亲和素包被的磁珠可用于捕获生物素标记的底物，包括生物素标 记的抗原、抗体和核酸，从而进行靶标垂钓。再比如，将链霉亲和素直接或间接包被在酶标 板上，并通过生物素将抗体固定在上面，可克服传统物理吸附方法造成的抗原抗体结合能 力大量丧失的不足。然而，在目前商业化的SA包被基底中，有两个共同的缺陷。
[0004] 首先，由于生物大分子在基底上的固定量越高，生物大分子间的相互作用就越容 易被检测到。因此，如何提高生物大分子在SA基底上的固定量，并且不影响底物与靶标蛋 白结合的生化活性，一直是在SA基底上固定这项技术最具有挑战性的难题。传统的固定方 法就是将生物素化的生物大分子，通过链霉亲和素-生物素相互作用，直接固定在链霉亲 和素包被的二维基底上。这种方法步骤简单，但所固定的生物大分子量十分少，与靶标蛋白 的结合信号噪音大，灵敏度低。
[0005] 2010年，中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研宄所的马宏伟等报道了通过混 合表面自组装单分子层（SAM)引发的原子转移自由基聚合（ATPR)反应来构建低密度三维 生物芯片（Ma H, He J, Liu X, Gan J, Jin G, Zhou J. Surface initiated polymerization from substrates of low initiator density and its applications in biosensors. ACS applied materials&interfaces. 2010 ;2 :3223_30.)。在此工作中，他们在金表面首先固定 两种末端巯基的混合SAM，然后利用其中一种SAM来引发高分子的聚合，另一种SAM来调控 高分子密度，从而构建了一种密度可控的三维聚乙二醇高分子刷状表面。该表面可以通过 支链末端功能化，来固定生物大分子。这项技术的优点在于，首先，功能化的三维刷状表面 的结合位点要远远大于传统二维表面，因此对生物大分子的固定量要优于传统二维表面； 同时，通过调节两种自组装单分子的比例，可以调控不同刷状高分子主链间的距离，进而控 制所固定的生物大分子之间的距离，为靶标蛋白靠近生物大分子预留足够的空间；最后，聚 乙二醇具有优良的抗非特异性吸附能力，可以降低检测背景的噪音信号。但是，该技术的缺 点在于只能在金片上制备生物芯片，无法适用于链霉亲和素包被的基底。这是由于该技术 所用的混合SAM末端含有巯基，只能与Au等贵金属发生配位反应进行固定。
[0006] 除了固定量低之外，目前商业化的SA包被基底还存在第二个缺陷：通常链霉亲和 素包被的磁珠可用于固定生物素标记的生物大分子作为诱饵，然后利用生物大分子间的相 互作用，去捕获靶标蛋白。但是在靶标垂钓领域，为了达到药物筛选的目的，有时需要将药 物小分子固定在表面，来研宄药物小分子与靶标蛋白的相互作用。由于目前商业化的链霉 亲和素芯片只能用来固定生物素化的底物，而大多数药物小分子由于不具备生物素化的能 力，不能被普适地固定在芯片上。因此，设计出一种可将药物小分子普适地固定在基底上的 方法，是一项非常有价值的研宄。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种适用于SA基底的、能增加生物大分子固定量的、具有 优良抗非特异性吸附能力并且可以固定药物小分子的三维生物表面及其制备方法以及包 括该三维生物表面的三维生物芯片及其用途。
[0008] 根据本发明的第一方面，提供了一种三维生物表面，所述三维生物表面包括链霉 亲和素包被的基底，其特征在于：所述三维生物表面还包括通过生物素与所述链霉亲和素 包被的基底结合的功能化的抗非特异性吸附材料，在所述三维生物表面中，未与所述功能 化的抗非特异性吸附材料结合的生物素与结合了所述功能化的抗非特异性吸附材料的生 物素的摩尔比是1 :(〇~12500)，优选1 :(0~5000)，更优选1 :1000。
[0009] 本文所述的"链霉亲和素包被的基底"或"SA基底"是指通过物理吸附或化学固定 的方法预先固定了链霉亲和素的固相衬底。
[0010] 优选地，所述固相衬底选自但不限于硅片、金属薄膜、磁珠或者酶标板。
[0011] 优选地，所述金属薄膜是金膜或银膜。
[0012] 优选地，所述酶标板为聚苯乙烯。
[0013] 优选地，所述磁珠内核为四氧化三铁。
[0014] 本文所述的"生物大分子"是指作为生物体内主要活性成分的各种分子量达到上 万或更多的有机分子。常见的生物大分子包括蛋白质、核酸、糖类等。
[0015] 本文所述的"药物小分子"是指具有潜在药物作用或者显著药物作用的，相对分子 量在一万左右或者以下的有机小分子。药物小分子通常可以与生物大分子进行相互作用。
[0016] 本文所述的"抗非特异性吸附材料"是指用于对表面改性，使之能够具备特异性结 合单一一种或者一类物质，对其他物质具有显著排斥作用的包被材料。
[0017] 优选地，所述抗非特异性吸附材料是支链含羟基末端的高分子。
[0018] 优选地，所述高分子为聚乙二醇、聚乙二醇的衍生物或者支链含羟基的含氟聚合 物。
[0019] 本文所述的"聚乙二醇"是指环氧乙烷的寡聚物或聚合物。
[0020] 本文所述的"聚乙二醇的衍生物"是指具有两个或者两个以上的亚乙氧基重复单 元的化学物质。
[0021] 本文所述的"支链含羟基的含氟聚合物"是指支链末端为羟基，主碳链上氢原子被 氟原子全部或者部分取代的化合物或者聚合物。
[0022] 本文所述的"功能化"是指对材料表面进行化学或者物理改性使之能够完成特定 功能称为功能化。
[0023] 优选地，所述功能化是指酸化或者酯化。
[0024] 根据本发明的第二方面，还提供了上述三维生物表面的制备方法，包括以下步 骤：
[0025] (1)合成生物素化的引发剂；
[0026] (2)将所述生物素化的引发剂和生物素固定在链霉亲和素包被的基底上，所述生 物素化的引发剂和生物素的摩尔比为1 :(〇~12500)，优选1 :(0~5000)，更优选1 :1000 ;
[0027] (3)利用所述生物素化的引发剂引发单体聚合从而在所述链霉亲和素包被的基底 上生成抗非特异性吸附材料；
[0028] (4)使所述抗非特异性吸附材料功能化；
[0029] 任选地，所述制备方法包括以下步骤：
[0030] (P )合成生物素化的引发剂；
[0031] (2 ')利用所述生物素化的引发剂引发单体聚合从而合成生物素化的抗非特异 性吸附材料；
[0032] (3 ')将所述生物素化的抗非特异性吸附材料和生物素接枝到链霉亲和素包被 的基底上，所述生物素化的抗非特异性吸附材料和生物素的摩尔比为1 : (〇~12500)，优选 1 :(0 ~5000)，更优选 1 :1000 ;
[0033] (4 ')使所述抗非特异性吸附材料功能化。根据本发明的合成生物素化的引发剂 的方法包括以下步骤：
[0034] (a)将生物素活化：将酰胺化反应活化剂、有机碱类催化剂分别加入生物素的有 机溶剂中，在5°C~60°C下搅拌，优选10°C到50°C，优选20°C到30°C，更优选25° ;酰胺化 反应活化试剂、生物素、有机碱类催化剂三种物质的摩尔比优选1 : (0. 5~5) : (1~10)，优 选 1 : (0. 5 ~2) : (1 ~5)，更优选 1:1:1. 5 ;
[0035] (b)将活化后的生物素酰胺化：将单边保护的双氨基末端试剂加入步骤（a)所得 的溶液中，在5 °C~60 °C下搅拌，优选10 °C到50 °C，优选20 °C到30 °C，更优选25 ° ;单边保 护的双氨基末端试剂以及活化后的生物素的摩尔比为（10~1) :1，最优选2:1 ;
[0036] (c)纯化步骤（b)所得的酰胺化的生物素；
[0037] (c)纯化步骤（b)所得的酰胺化的生物素；
[0038] (d)将上述步骤（c)所得产物进行去单边保护；
[0039] (e)将引发剂活化：将酰胺化反应活化剂、有机碱类催化剂分别加入引发剂的有 机溶剂中，在5°C~60°C下搅拌；酰胺化反应活化试剂、引发剂、有机碱类催化剂三种物质 的摩尔比最优为1 : (0. 5~5) : (1~10)，优选1:1:1. 5 ;
[0040] (f)将活化的引发剂生物素化：将步骤⑷所得产物与步骤（e)所得产物进行反 应，前者的摩尔量与后者摩尔量的优选摩尔比应为1 :(1~10)，优选1 :(1~5)，最优选 1:2 ；
[0041] (g)纯化步骤（f)所得的生物素化的引发剂。
[0042] 本文所述的"生物素化的引发剂"是指通过化学合成的，一端带有生物素，另一端 具有能够引发高分子聚合的官能团的化学物质。
[0043] 根据本发明的具体实施方案，所述生物素化的引发剂的结构为
[0044]
[0045] 其中，R为碳、氮和氧三种元素所形成的末端为-NH-的直链烷基，优选C3~C10的 直链烷基，x为卤素；
[0046] 优选地，所述直链烷基为-nh-ch2-ch2-o-ch2-ch2-o-ch2-ch2-nh-或-nh-ch2-ch2-o-ch2-ch2-nh-；
[0047] 进一步优选地，所述生物素化的引发剂为
[0048]
[0049] 本文所述的"酰胺化反应活化剂"是指能够活化酰胺化反应的化学试剂。
[0050] 本文所述的"有机碱类催化剂"是指能够催化某种或者某类化学反应的碱类有机 物。例如能够催化酰胺化反应的三乙胺或者4-二甲氨基吡啶，优选三乙胺。
[0051] 本文所述的"单边保护的双氨基末端试剂"是指一端氨基被保护基保护，中间部 分为碳、氮和氧三种元素所形成的直链烷基，另一端为氨基的化学试剂，例如N-叔丁氧羰 基-2-[2-(2-氨基-乙氧基）-乙氧基]-乙醇胺或者N-叔丁氧羰基-2-(2-氨基-乙氧 基） -乙醇胺。
[0052] 根据本发明的具体实施方案，在上述制备方法中，所述酰胺化反应活化剂是 N，N' -二琥珀酰亚胺基碳酸酯或者1-