一种提高植物抗逆性的方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种提高植物抗逆性的方法及其应用，属于植物转基因育种技术领 域。
【背景技术】
[0002] 大豆对干旱、盐碱等逆境胁迫十分敏感，逆境导致大豆品质和产量下降。因此，研 宄抗逆相关基因，明确抗逆分子机制，提高大豆抗逆性非常重要。随着分子生物技术的发 展，将抗逆基因转入相关作物中，使其在目的作物中高效表达，从而提高作物对逆境环境的 适应性，提高作物产量和品质已成为目前研宄的重点。但是，关于大豆中AKTl类基因相关 信息的研宄还很少，尚没有利用AKTl类基因改善植物抗逆性的方法。
【发明内容】
[0003] 为解决上述问题，本发明提供了一种提高植物抗逆性的方法，采取的技术方案如 下：
[0004] 本发明的目的在于提供一种提高植物抗逆性的方法，其特征在于，通过PCR扩增 获得抗逆基因后，构建植物表达载体，再将植物表达载体转化到农杆菌上，再利用含有表达 载体的农杆菌侵染目标植物，培育被侵染的目标植物至获得转抗逆基因的种子。
[0005] 所述方法的步骤如下：
[0006] 1)提取大豆子叶总RNA，反转录后获得cDNA，并以所得CDNA为模板，进行PCR扩 增，获得抗逆基因；
[0007] 2)将步骤1)所扩增的抗逆基因插入到质粒载体上获得植物表达载体；
[0008] 3)再将步骤2)所得的植物表达载体转化到农杆菌上，获得农杆菌转化子；
[0009] 4)利用步骤3)所得的农杆菌转化子侵染目标植物，获得侵染植物；
[0010] 5)培育侵染植物至获得含有抗逆基因的种子。
[0011] 优选地，步骤1)所述大豆，品种为东农50 ;所述抗逆基因，抗逆基因 GmAKTl， GeneBank登陆号为KM491715. 1 ;所述PCR扩增，所用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2-SEQ ID NO. 3所示；扩增条件为：94°C 2min ;再进行38个循环，其中每个循环降0. 2°C:98°C 10s， 58°C 30s，68°C 3min ;68°C终延伸 lOmin。
[0012] 优选地，步骤2)所述质粒载体，是质粒载体pCXSN。
[0013] 优选地，步骤3)所述将植物表达载体转化到农杆菌上，是将植物表达载体通过冻 融法转化到根瘤农杆菌EHA105中。
[0014] 优选地，步骤4)所述目标植物为拟南芥或大豆，侵染部位为花絮；所述侵染是将 拟南芥的花絮浸入到转化液中28-32s。
[0015] 所述转化液，是将农杆菌转化子在室温5000rpm下离心10min后，再将沉淀菌液悬 浮在1/2MS缓冲液中，加入表面活性剂SilwetL-77制得。
[0016] 所述方法的具体步骤如下：
[0017] 1)提取东农50大豆子叶的总RNA，反转录获得cDNA后，以所得cDNA为模板， 以如SEQ ID NO. 2-SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列为引物，进行PCR扩增，扩增条件为： 94°C 2min;再进行 38 个循环，其中每个循环降 0. 2°C :98°C 10s，58°C 30s，68°C 3min;68°C 终延伸lOmin，获得抗逆基因 GmAKT I扩增产物；
[0018] 2)通过XcmI和Hind III的酶切作用将步骤1)所得的抗逆基因 GmAKT 1扩增产 物连接到质粒载体PCXSN上，获得植物表达载体pCXSN-GmAKTl ;
[0019] 3)通过冻融法将步骤2)所得的植物表达载体pCXSN-GmAKTl转化到根瘤农杆菌 EHA105中，获得农杆菌转化子pCXSN-GmAKTl ;
[0020] 4)将步骤3)所得的农杆菌转化子pCXSN-GmAKTl在室温5000rpm下离心10min 后，再将沉淀菌液悬浮在1/2MS缓冲液中，加入表面活性剂SilwetL-77制得转化液，将拟南 芥的花絮浸入到转化液中30s后取出，获得侵染拟南芥；
[0021] 5)平放步骤4)所得的侵染拟南芥，避光，保鲜膜包裹保持湿度，暗培养Id后，取出 除去遮挡，放入培养箱中培养至获得转抗逆基GmAKTl的拟南芥种子。
[0022] 所述任一方法用于农作物转基因育种。
[0023] 优选地，所述任一方法用于培育抗逆性提高的农作物；更优选地，用于培育抗逆性 提尚的大?。
[0024] 发明人从大豆DN50中分离了一个新基因 GmAKTl，虽然发明人公开了该基因的碱 基序列，但是对于该基因的功能并未披露。对于基因 GmAKTl尚无功能研宄报道。
[0025] 本发明获得的有益效果如下：
[0026] 发明人对组织特异性进行分析，发现GmAKTl在大豆根部表达量高于其他组织，在 受到ABA、NaCl及PEG诱导时，其表达量显著升高。原核表达实验证明获得的大豆GmAKTl 基因可以编码翻译目的蛋白。将其转入拟南芥中，得到了转GmAKTl拟南芥，转GmAKTl拟南 芥表现出莲座叶少，开花早，荚数多，株高增加的特性，与野生型相比有一定程度的生理优 势。GmAKTl提高了拟南芥的抗旱及抗盐能力，转入突变体拟南芥时，可以将突变体拟南芥对 盐、旱的超敏感恢复到正常水平。GmAKTl增加了拟南芥种子在萌发时期对ABA的敏感性，而 AKTl基因缺失则导致拟南芥对ABA的不敏感。同时，GmAKTl的过表达可以在一定程度上清 除逆境时植物体内的活性氧。
【附图说明】
[0027] 图I GmAKTl的序列差异性分析。
[0028] 图2 GmAKTl蛋白与GmAKT2蛋白、水稻OsAKTl、拟南芥AKTl蛋白的氨基酸比对。
[0029] 图3 GmAKTl组织表达分析及PEG、NaCl、ABA处理的大豆GmAKTl基因的相对表达 量。
[0030] 图4转基因拟南芥的表型。
[0031] 图5不同ABA浓度处理下种子的萌发率。
[0032] 图6水分胁迫处理下种子的萌发率、根长变化及拟南芥离体叶片失水率。
[0033] 图7不同NaCl浓度处理下种子的萌发率、根长及表型变化。
[0034] 图8 NBT染色检测转基因拟南芥中超氧阴离子的含量。
[0035] 图9 DAB染色检测转基因拟南芥中H2O2的含量。
【具体实施方式】
[0036] 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
[0037] 以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规 材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。
[0038] 实施例1GmAKTl的获得
[0039] 一、GmAKTl的克隆及生物信息学分析
[0040] 从Phytozome数据库中获得拟南芥AKTl的同源基因，利用同源克隆的方法从东 农50中获得同源性最高的2个基因拷贝，分别位于17号染色体和5号染色体，氨基酸同源 率分别为69. 41%和68. 00%，命名为GmAKTl，GmAKT2。本发明克隆的GmAKTl含有一个长 2628bp的开放阅读框，编码875个氨基酸。
[0041] Trizol试剂提取大豆（Glycine max)(东农50,武天龙，杨庆凯，马占峰，吴宗璞， 赵淑文，高凤兰，李文滨，张国栋，杨琪，孟庆喜，王金陵.东农小粒豆1号大豆新品种选育报 告，[J].东北农业大学学报，1994,（25) 1:104;公众可从东北农业大学获得，以下简称为野 生型大豆）。叶片总RNA，反转录合成cDNA第一条链作为模板，以SEQ ID NO. 3-4所示序列 为引物，进行PCR 反应，PCR 条件为 94°C 2min ;38 循环：98°C 10s，58°C 30s，68°C 3min ;(每 个循环降0. 2°C )68 °C终延伸IOmin。经测序，PCR产物为2707bp，有两个碱基与大豆数据 库中比对得到的不同，序列中第17Ibp由T变为A，第501个bp由G变为A，从而导致第168 个氨基酸由甘氨酸变为丝氨酸（图1)。该基因命名为GmAKTl。由于数据库中的GmAKTl序 列来自于威廉姆斯82号大豆，而本申请中所克隆的GmAKTl于东农50中分离，品种的差异 可能引起氨基酸的变异。本申请克隆的大豆GmAKTl在GenBank登陆号为KM491715. 1。
[0042] GmAKTl的分子量为98137. 58,等电点7. 09,负电残基（Asp+Glu)为90,正电残基 (Arg+Lys)是89。原子组成为4408个C、6911个H、1195个N、1277个0、33个S,化学式为 C44tl8H6911N1195O1277S 33，原子总数是13824个（图2)。预测GmAKTl蛋白有5个跨膜区域，分别 位于52-74,84-106,190-212, 232-254, 267-289,其中在S4跨膜区域上，发现一个P结构域， 是钾离子通道Shaker家族的结构的基本特征。
[0043] 二、GmAKTl的表达分析
[0044] 1、大豆GmAKTl基因的组织特异性表达
[0045] 用半定量法分析了 GmAKTl在大豆各个组织器官的表达情况。于大豆盛花期取 DN50根、茎、叶、荚、豆、花等各个组织部分，用Trizol试剂盒提取RNA，调整RNA浓度后以总 RNA为模板，分别反转录各组织cDNA。以大豆管家基因 actin为内参调整扩增目的基因的 模板量。反应条件为：94°C 5min ;34 循环：94°C 30s，58°C 30s，72°C 30s72°C，终延伸 lOmin。 (图