专利名称：AtTGA4基因在提高植物抗逆性中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及AtTGA4蛋白及其编码基因在调控植物抗旱性和/或调控对氮素吸收中的应用，特别涉及AtTGA4蛋白及其编码基因在提高植物抗旱性及提高植物氮素吸收中的应用。
背景技术：
氮素是植物生长发育必须的营养物质。氮素不仅是植物的营养元素，在植物的抗逆方面中也发挥着重要作用。干旱条件下植物不仅可以通过根与地上部分之间的“根-冠”信息传递，使植物能快速地调整整体的水分关系(Davies WJ, Zhang J. Root signalsand the regulation of growth and development of plants in drying soil. Annu ReV PlantPhysiol Plant Mol Biol, 1991，42，55-76)，而且植物还积累如脯氨酸等可溶性渗透物质作为渗透保护物质(Delauney AJ, Hu C AA, Kishor P B K，et al. cloning ofornithine-aminotransferase cDNA from Vigna aconitifolia by trans-complementation inEscherichia coli and regulation of proline biosynthesis [J]. J Biol Chem，1993，268:18673-18678)，同时脯氨酸代谢的中间产物具有诱导基因表达(Iyer S，CaplanA. Prodcts of proline catabolism can induce osmotically regulated genes in rice[J]. PlantPhysiolj 1998, 116:203-211)以及降低渗透胁迫所造成的氧伤害作用(Hong ZLj LakkineniKj Zheng ZHj et al. Removal of feedback inhibition of pyrroline-5-carboxylate synthetaseresults in increased proline accumulation and protection of plants from osmotic stress[J]. Plant Physiol, 2000, 122:1129-1136)。植物这些干旱胁迫响应机制都与氮素有密切的关系。大量研究表明ABA是介导“根-冠”信息传递的核心物质(Zhang Jj Davies WJ. Antitranspirant activty in the xylem sap of maize plants.J Exp Bot， 1991，42，317-321)， 同时氮素营养和ABA积累有着密切的关系(Wilkinson S，Daies WJ. ABA-based chemicalsignaling: the co-ordination of responses to stress in plant. Plant Cell Environ. 2002，25，195-210)，氮素营养的 增加可明显提高气孔对根信号的敏感度(Liu Jj Wei KFj Gao ZHj Li BBj Ren HBj Hu JFj Jia WS. Nitrate as an enhancer of root signal in theregulation of stomatal movement in plants under drought stress. Chin Bull Bot, 2008，25，34-40)。干旱条件下植物脯氨酸的增加也与氮素的吸收和代谢有着密切的关系(Voetberg G S，Sharp R Ej Growth at the maize primary root at low water potential. 3. Roleof increased proline deposition in osmotic adjustment[J]. Plant Physiol, 1991,96:1125-1130)。发掘能在干旱条件下通过提高植物对氮素的吸收来增强植物抗旱性的基因，对于提高植物的抗旱性同时增加产量具有重要意义。
目前尚未有对AtTGA4转录因子是否在植物抗旱中发挥作用进行研究的报道。发明内容
本发明的目的是提供一种AtTGA4蛋白及其编码基因的新用途。AtTGA4蛋白是通过核蛋白筛选系统(NTT)筛选得到的。
本发明所提供的新用途具体为AtTGA4蛋白或其编码基因在调控植物抗旱性和/ 或调控对氮素吸收中的应用；
所述AtTGA4蛋白是如下I)或2)的蛋白质
I)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且具有与I)相同功能的由I)衍生的蛋白质。
在本发明中，所述调控植物抗旱性和/或对氮素吸收具体体现在提高植物抗旱性和/或提高植物对氮素吸收能力。
本发明的又一个目的是提供AtTGA4蛋白或其编码基因在调控植物如下 (al) - (a6)至少一种中的应用；
(al)植株脯氨酸含量；
(a2)植株叶绿素含量；
(a3)植株过氧化物酶活性；
(a4)植株总氮含量；
(a5)植株硝酸·还原酶活性；
(a6)植株氮途径关键基因的表达量，所述氮途径关键基因具体为NRT2. UNRT2. 2、 NIAl和MIA2中的至少一种；
所述AtTGA4蛋白是如下I)或2)的蛋白质
I)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且具有与I)相同功能的由I)衍生的蛋白质。
在本发明中，所述调控植物上述(al) - (a6)性状具体体现在在干旱诱导后可提高植株脯氨酸含量，和/或提高植株叶绿素含量，和/或降低植株过氧化物酶活性；在低氮素(如铵态氮或硝态氮，氮素含量低于MS0培养基中的氮元素含量)条件下可提高植株总氮含量，和/或提高植株硝酸还原酶活性，和/或提高植株氮途径关键基因(如NRT2.1、 NRT2. 2、NIAl 或 NIA2)的表达量。
本发明的再一个目的是提供一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤将 AtTGA4蛋白的编码基因导入目的植物中，获得具有如下(bl)- (b8)中至少一种性状的转基因植物
(bl)与所述目的植物相比抗旱性提高；
(b2)与所述目的植物相比对氮素的吸收能力提高；
(b3)与所述目的植物均经干旱诱导后，其植株脯氨酸含量高于所述目的植物；
(b4)与所述目的植物均经干旱诱导后，其植株叶绿素含量高于所述目的植物；
(b5)与所述目的植物均经干旱诱导后，其植株过氧化物酶活性低于所述目的植物；
(b6)与所述目的植物均经低氮处理后，其植株总氮含量高于所述目的植物；
(b7)与所述目的植物均经低氮处理后，其植株硝酸还原酶活性高于所述目的植
(b8)与所述目的植物均经低氮处理后，其植株中氮途径关键基因的表达量高于所述目的植物，所述氮途径关键基因具体为NRT2. UNRT2. 2、NIAl和NIA2中的至少一种；
步骤(b6) - (b8)中所述低氮为氮元素含量低于所述目的植物正常所需氮元素含量。在本发明中，所述低氮为氮元素含量低于MStl固体培养基(配方见具体实施方式
)中氮元素含量或低于Hoagland水培液(配方见具体实施方式
)中的氮元素含量；在本发明中，所述低氮具体为O. 2mM NOf或2mM NH4+或ImM NH4+。
所述AtTGA4蛋白是如下I)或2)的蛋白质
I)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且具有与I)相同功能的由I)衍生的蛋白质。
在上述应用或方法中，所述AtTGA4蛋白的编码基因(AtTGA4基因)具体可为下述 a)-c)中任一所述的基因
a)编码序列如序列表中序列I所示的基因；
b)核苷酸序列如序列表中序列I所示的基因；
c)在严格条件下与a)或b)的基因杂交，且编码序列2所示氨基酸序列组成的蛋白质的基因。
其中，序列I由1095个核苷酸组成，整个序列I即为AtTGA4基因的编码序列，编码序列表中序列2所示的蛋白(AtTGA4蛋白)，序列2共由364个氨基酸组成。
在上述方法中，所述AtTGA4蛋白的编码基因是通过含有所述AtTGA4蛋白的编码基因的重组表达载体导入所述目的植物中的。
所述重组表达载体中启动所述AtTGA4蛋白的编码基因转录的启动子可为35s启动子。
在本发明的一个实施例中，所述重组表达载体具体为将所述AtTGA4蛋白的编码基因插入到PBI121质粒(35s启动子)下游的多克隆位点，得到的表达所述AtTGA4蛋白的编码基因的重组质粒。所述多克隆位点具体为Sma I和Spe I。
在上述应用或方法中，所述植物可为双子叶植物，也可为单子叶植物。
在本发明的一个实施例中，所述植物为双子叶植物，所述双子叶植物具体为拟南芥，如拟南芥品种ColumbiaO。
在本发明中，上述应用或方法所涉及的抗旱和/或氮素吸收具体体现在如下指标中的至少一种
(Cl)植株存活率；
(c2)植株表型，如根系长度、直径、表面积，茎长及叶面积等；
(c3)植株的脯氨酸含量；
(c4)植株的叶绿素含量；
(c5)植株的过氧化物酶活性；
(c6)植株的总氮含量；
(c7)植株的硝酸还原酶活性；
(c8)植株中氮途径关键基因的表达量，如NRT2. UNRT2. 2、NIA1或NIA2。
总体上来说，抗旱性提高体现在与未转基因的野生型对照相比，经干旱处理后转入AtTGA4蛋白的编码基因的植株，其存活率相对较高，根系长度、直径及茎长相对较长、根系表面积及叶面积相对较大，植株的脯氨酸含量和叶绿素含量相对较高，植株的过氧化物酶活性相对较低；氮素吸收能力提高体现在与未转基因的野生型对照相比，经低氮素(如铵态氮或硝态氮)处理后转入AtTGA4蛋白的编码基因的植株，其存活率相对较高，根系长度、 直径及茎长相对较长、根系表面积及叶面积相对较大，植株的总氮含量相对较高，植株的硝酸还原酶活性相对较高，植株中氮途径关键基因NRT2. UNRT2. 2、NIAl和NIA2的表达量相对较高。
实验证明，利用本发明所提供的方法培育得到的转入AtTGA4蛋白的编码基因的植株与野生型植株相比，其抗旱性和对氮素的吸收能力均有较大的提高。
图1为AtTGA4基因在干旱处理不同时间段的表达情况。
图2为AtTGA4基因在低氮条件下(O. 2mM N03_和2mM NH4+)不同时间段的表达情况。其中，A为AtTGA4基因在O. 2mM N03_处理不同时间段的表达情况；B为AtTGA4基因在 2mM NH4+处理不同时间段的表达情况。A和B中，横坐标中的“D”表示“天”。
图3为重组表达载体pBI121-TGA4的构建流程图。
图4为50mg/mL Kan筛选得到的Ttl代转AtTGA4基因拟南芥植株幼苗(位于箭头所指圆圈内)。
图5为4个转AtTGA4基因株系与野生型拟南芥萌发期抗旱性检测结果。其中，A 为8%PEG处理至10天时长出2片绿叶的苗数的统计结果，具体的，A-1为正常的MStl固体培养基处理组中各拟南芥的生长形态，A-2为含有8%PEG的MStl固体培养基处理组中各拟 南芥的生长形态，A-3为A-1和A-2处理组的样品分布示意图，A-4为含有8%PEG的MStl固体培养基处理组中长出2片绿叶的苗数统计结果；B*8%PEG处理至17天时，表型观察、根系扫描、茎长及叶面积测定结果，B-1为8%PEG处理至17天时各拟南芥的表型(其分布如A-3所示)，B-2为8%PEG处理至17天时各拟南芥根系形态比较，B-3为8%PEG处理至17天时各拟南芥根长统计结果，B-4为8%PEG处理至17天时各拟南芥根表面积统计结果，B-5为8%PEG 处理至17天时各拟南芥根平均直径统计结果，B-6为8%PEG处理至17天时各拟南芥茎长统计结果，B-7为8%PEG处理至17天时各拟南芥叶面积统计结果。
图6为4个转AtTGA4基因株系、野生型拟南芥及AtTGA4拟南芥突变体苗期抗旱性检测结果——表型。其中，A为干旱处理前；B为干旱处理18天后；C为干旱处理18天并复水5天后。Mutant表示AtTGA4拟南芥突变体。
图7为4个转AtTGA4基因株系、野生型拟南芥及AtTGA4拟南芥突变体苗期抗旱性检测结果——存活率结果。Mutant表示AtTGA4拟南芥突变体。
图8为4个转AtTGA4基因株系、野生型拟南芥及AtTGA4拟南芥突变体苗期抗旱性检测结果——抗旱生理指标的测定。其中，A为脯氨酸含量；B为过氧化物酶(POD)活性； C为叶绿素含量。Mutant表示AtTGA4拟南芥突变体。
图9为4个转AtTGA4基因株系与野生型拟南芥萌发期氮素吸收能力的检测结果。 其中，A为各拟南芥植株表型，A-1为正常MStl固体培养基处理组各拟南芥植株形态，A-2为在含有O. 2mM NO3-的MStl固体培养基上各拟南芥的生长情况，A-3为在含有O. 2mM NO3I^MStl 固体培养基上各拟南芥根系形态比较，A-4为A-1、A-2和A-5的样品分布示意图，A-5为在含有2mM NH4+的MStl固体培养基上各拟南芥的生长情况，A-6为在含有2mM NH4+的MStl固体培养基上各拟南芥根系形态比较；B为各拟南芥植株的根系扫描、茎长及叶面积测定结果， B-1为含有O. 2mM NO3-的在MStl固体培养基上各拟南芥的根长数据统计，B-2为在含有O. 2mM NO3-的MStl固体培养基上各拟南芥的根表面积数据统计，B-3为在含有O. 2mM N03_的MStl固体培养基上各拟南芥的根平均直径数据统计，B-4为在含有O. 2mM N03_的MS0固体培养基上各拟南芥的茎长数据统计，B-5为在含有O. 2mM N03_的MStl固体培养基上各拟南芥的叶面积数据统计，B-6为在含有2mM NH4+的MS0固体培养基上各拟南芥的根长数据统计，B-7为在含有2mM NH4+的MStl固体培养基上各拟南芥的根表面积数据统计，B-8为在含有2mMNH4+的 MS0固体培养基上各拟南芥的根平均直径数据统计，B-9为在含有2mM NH4+的MStl固体培养基上各拟南芥的茎长数据统计，B-1O为在含有2mM NH4+的MS0固体培养基上各拟南芥的叶面积数据统计。
图10为4个转AtTGA4基因株系与野生型拟南芥苗期(水培条件下)氮素吸收能力的检测结果——表型。其中，A为含有O. 2mM N03_的Hoagland水培液处理10天后各拟南芥植株的形态；B为含有ImM NH4+的Hoagland水培液处理10天后各拟南芥植株的形态。
图11为4个转AtTGA4基因株系与野生型拟南芥苗期氮素吸收能力的检测结果——总氮量。其中，A为含有O. 2mM NO3-的Hoagland水培液处理10天后各拟南芥植株的总氮量为含有ImM NH4+的Hoagland水培液处理10天后各拟南芥植株的总氮量。
图12为4个转AtTGA4基因株系与野生型拟南芥苗期干旱条件下氮途径相关生理反应检测结果。其中，A为总氮量；B为硝酸还原酶(NR)活性 ；C为谷氨酰胺合成酶(GS)活性。
图13为4个转AtTGA4基因株系、野生型拟南芥及AtTGA4拟南芥突变体中参与氮素途径的8个关键基因的RT-PCR分析结果。对于每个基因的检测结果，从左到右均依次为 AtTGA4拟南芥突变体、野生型拟南芥、TGA4-1、TGA4-2、TGA4-3、TGA4-4。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)生态型ColumbiaO :从拟南芥数据库订购，http://www. arabidopsis. org/ ;AtTGA4拟南芥突变体种子从拟南芥数据库订购， http://www. arabidopsis. org/。拟南芥种植于中国农业科学院作物科学研究所植物生长室，生长室温度设为21°C，长日照为16h光照/8h黑暗，短日照为IOh光照/14h黑暗。
pBI121载体:购自于Clontech公司，产品目录号6081-1。
MS0固体培养基
权利要求
1.AtTGA4蛋白或其编码基因在调控植物抗旱性和/或对氮素吸收中的应用；所述AtTGA4蛋白是如下I)或2)的蛋白质 O由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； 2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且具有与I)相同功能的由I)衍生的蛋白质。
2.AtTGA4蛋白或其编码基因在调控植物如下(al)-(a6)至少一种中的应用； (al)植株脯氨酸含量； (a2)植株叶绿素含量； (a3)植株过氧化物酶活性； (a4)植株总氮含量； (a5)植株硝酸还原酶活性； (a6)植株氮途径关键基因的表达量，所述氮途径关键基因具体为NRT2. UNRT2. 2,NIAl和NIA2中的至少一种； 所述AtTGA4蛋白是如下I)或2)的蛋白质 O由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； 2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且具有与I)相同功能的由I)衍生的蛋白质。
3.一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤将AtTGA4蛋白的编码基因导入目的植物中，获得具有如下(bl)- (b8)中至少一种性状的转基因植物 (bl)与所述目的植物相比抗旱性提高； (b2)与所述目的植物相比对氮素的吸收能力提高； (b3)与所述目的植物均经干旱诱导后，其植株脯氨酸含量高于所述目的植物； (b4)与所述目的植物均经干旱诱导后，其植株叶绿素含量高于所述目的植物； (b5)与所述目的植物均经干旱诱导后，其植株过氧化物酶活性低于所述目的植物； (b6)与所述目的植物均经低氮处理后，其植株总氮含量高于所述目的植物； (b7)与所述目的植物均经低氮处理后，其植株硝酸还原酶活性高于所述目的植物；(b8)与所述目的植物均经低氮处理后，其植株中氮途径关键基因的表达量高于所述目的植物，所述氮途径关键基因具体为NRT2. UNRT2. 2、NIAl和NIA2中的至少一种； 所述AtTGA4蛋白是如下I)或2)的蛋白质 O由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； 2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且具有与I)相同功能的由I)衍生的蛋白质。
4.根据权利要求1-3中任一所述的应用或方法，其特征在于所述AtTGA4蛋白的编码基因为下述a) -c)中任一所述的基因 a)编码序列如序列表中序列I所不的基因； b)核苷酸序列如序列表中序列I所示的基因； c)在严格条件下与a)或b)的基因杂交，且编码序列2所示氨基酸序列组成的蛋白质的基因。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述AtTGA4蛋白的编码基因是通过含有所述AtTGA4蛋白的编码基因的重组表达载体导入所述目的植物中的。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述重组表达载体中启动所述AtTGA4蛋白的编码基因转录的启动子是35s启动子。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述重组表达载体为将所述AtTGA4蛋白的编码基因插入到PBI121质粒的多克隆位点，得到的表达所述AtTGA4蛋白的编码基因的重组质粒。
8.根据权利要求1-7中任一所述的应用或方法，其特征在于所述植物为双子叶植物或单子叶植物。
9.根据权利要求8所述的应用或方法，其特征在于所述双子叶植物为拟南芥。
全文摘要
本发明公开了一种AtTGA4蛋白及其编码基因的新用途。本发明所提供的AtTGA4蛋白及其编码基因的新用途具体为AtTGA4蛋白及其编码基因在调控植物抗旱性和/或调控对氮素吸收中的应用；所述AtTGA4蛋白是如下1)或2)的蛋白质1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且具有与1)相同功能的由1)衍生的蛋白质。实验证明，本发明培育得到的转入AtTGA4蛋白的编码基因的植株与野生型植株相比，其抗旱性和对氮素的吸收能力均有较大的提高。
文档编号C12N15/82GK103045639SQ201210554530
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月19日 优先权日2012年12月19日
发明者曹新有, 陈明, 马有志, 闵东红, 陈丹丹, 徐兆师, 李连城, 薛飞洋 申请人:中国农业科学院作物科学研究所